组织蛋白酶D、表皮生长因子受体在膀胱移行细胞癌中的表达及其相关性
作者：顾晓 眭元庚 徐正铨 尤国才 吴宏飞
单位：顾晓(200080 上海市第一人民医院泌尿外科)；眭元庚 徐正铨 尤国才 吴宏飞(南京医科大学第一附属医院泌尿外科)
关键词：膀胱肿瘤；癌；组织蛋白酶D；表皮生长因子受体
江苏医药000607 【摘要】 目的 探讨组织蛋白酶D(CD)、表皮生长因子受体(EGFR)的表达与膀胱移行细胞癌(BTCC)生物学行为间的关系及其发生浸润转移的机制。方法 应用免疫组化ABC法检测33例BTCC及12例正常膀胱组织中CD、EGFR的表达。结果 正常膀胱移行细胞CD均呈弱阳性表达，BTCC组肿瘤细胞CD中/强阳性表达率显著高于正常对照组(P<0.05)，且在不同病理分级，临床分期，单发与多发，初发与复发组间均有显著性差异(P<0.05)。BTCC组CD、EGFR的过表达率有显著相关性(P<0.05)。结论 CD与BTCC生物学特性密切相关，与EGFR协同作用促进肿瘤发生浸润转移。
, 百拇医药
Expression and relativity of cathepsin D and epidermal growth factor receptor in human transitional cell carcinoma of bladder
GU Xiao SUI Yuangeng XU Zhengquan
(Department of Urology，the First People’s Hospital of Shanghai，Shanghai 200080)
【Abstract】 Objective To evaluate the relationship between the expression of cathepsin D(CD)or epidermal growth factor receptor (EGFR)and biological behavior of bladder transitional cell carcinoma(BTCC)and the mechanisms of invasiveness and metastasis.Methods The expression of CD and EGFR was detected by standard ABC immunohistochemical technique in 33 paraffin-embedded tissue specimens of BTCC.Results CD antigen was weakly stained in all normal transitional cells.The moderately or strongly positive rate of CD in BTCC group was significantly higher than that in normal control group(P<0.05).Fisher’s accuracy analysis showed that moderately and strongly positive rate of CD in tumor cells were closely correlated with different pathological grades(P<0.05)，clinical stages(P<0.05)，number of lesions(P<0.05)and postoperative recurrence(P<0.05).The over expression of CD and EGFR showed significant relativity in the same groups of BTCC(P<0.05).Conclusion The over expression of CD was closely correlated with complex and variable biological characteristics of BTCC.The synergy of CD and EGFR may influence the invasiveness and metastasis of BTCC.
, 百拇医药
【Key words】 Bladder neoplasms Carcinoma Cathepsin D Epidermal growth factor receptor
膀胱移行细胞癌(Bladder Transitional Cell Carcinoma，BTCC)生物学行为复杂而多变，浸润性是其中的突出表现之一。研究表明蛋白水解酶通过降解一系列的天然屏障在肿瘤的浸润转移中发挥重要作用，组织蛋白酶D(Cathepsin，CD)是参与此过程的重要因素之一，且细胞因子又可以诱导CD的合成与分泌，进一步促使肿瘤发生浸润转移[1]。有关乳癌、结肠癌、前列腺癌的研究已表明：CD含量与他们的生物学特性密切相关[2～3]。但在膀胱肿瘤方面的研究甚少，本文旨在通过检测CD、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)在BTCC中的表达及其相关性，探讨CD、EGFR与BTCC生物学行为间的关系及其发生浸润转移的机制。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料和分组
1.BTCC组33例，为1995年～1997年间手术切除并经病理证实为BTCC的存档蜡块标本。男性25例，女性8例；年龄38～81岁，平均60.8岁。按WHO病理分级标准：G1级10例，G2级15例，G3级8例；按UICC-TNM临床分期标准：Ta～T116例，T2～T417例；肿瘤单发18例，多发15例；初发19例，复发14例。
2.正常对照组12例，均取自其它原因死亡的尸体膀胱，年龄19～49岁，平均25.7岁。
二、主要试剂和方法
一抗为美国DAKO公司兔抗人CD多克隆抗体，美国Santa Cruz公司兔抗人EGFR多克隆抗体，二抗为美国Vector公司生物素化抗兔IgG试剂盒。
, 百拇医药
每例标本连续石蜡切片3张，片厚5 μm，一张常规HE染色，复核病理诊断，分级和分期，结合免疫组化染色观察抗原定位。另2张作CD、EGFR免疫组化ABC法染色，两者所用一抗及二抗稀释度均为1∶100，DAB作为底物显色。
以乳癌组织作阳性对照，以其他原因死亡的尸体膀胱组织作正常对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
三、结果判定标准
镜下细胞结构清晰，阳性颗粒定性、定位良好且着色明显高于背景者为阳性。将染色结果分为：阴性(染色细胞数≤5%)，弱阳性(染色细胞数5%～25%)，中/强阳性(染色细胞>25%)。阳性结果由三位独立的评估者得出一致的结论所决定。
四、统计学处理
本研究结果均为半定量分析的计数资料，应用Pentuium133型计算机SAS 6.04软件处理实验数据，作Fisher精确概率χ2检验及配对的χ2检验。
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结 果
一、CD在正常移行细胞胞质内均呈弱阳性表达，尤其表层伞形细胞呈阳性染色。肿瘤细胞中CD抗原可呈中/强阳性染色，棕黄色颗粒分布于胞浆。BTCC组中CD中/强阳性率48.48%，显著高于正常对照组(P<0.05)。EGFR在正常移行细胞中呈阴性表达，肿瘤细胞胞质、胞膜可见棕黄色颗粒染色，呈阳性表达。
二、不同病理分级和临床分期组间肿瘤细胞CD中/强阳性表达率有显著性差异(P<0.05)，且随恶性程度和侵袭能力增加而增高；复发组和多发组肿瘤细胞CD中/强阳性表达率均分别显著高于初发组和单发组(P<0.05)，见表1。
三、CD、EGFR在肿瘤细胞中的过表达率有显著相关性(P<0.05)，见表2。
讨 论
CD是广泛存在于人体细胞溶酶体的天冬酰氨蛋白酶原的激活形式，由定位于11P15的基因编码。体内细胞首先合成一种52KD无活性的前体形式，在溶酶体中通过蛋白水解过程，合成有催化活性的48KD蛋白，由分子量为34KD和14KD的两条单链组成，能够分解基底膜(BM)和细胞外基质(ECM)，并具有促有丝分裂活性[4]。在浸润转移过程中，包括CD在内的一系列不同的蛋白水解酶通过类似凝血过程的方式活化不同的无活性前体，催化降解BM和ECM，形成局部溶解区以构成肿瘤细胞移动的通道，使其易于移动穿过ECM和脉管壁进入循环。
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表1 CD表达与BTCC不同病理分级、临床分期、单发与多发、初发与复发组间的关系
肿瘤细胞CD表达
P值
弱阳性
中/强阳性
病理分级G1
9
1
G2
6
9
0.010
, 百拇医药
G3
2
6
临床分期
Ta～T1
12
4
T2～T4
5
12
0.015
单发
, 百拇医药
13
5
多发
4
11
0.015
初发
14
5
复发
3
11
0.005
表2 BTCC中CD、EGFR的表达相关性 EGFR表达
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肿瘤细胞CD的表达
χ2
P值
弱阳性
中/强阳性
阴性
13
2
13.604
<0.05
阳性
4
14
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本研究显示全部的正常移行上皮细胞中CD均呈弱阳性表达，证实CD在人体细胞中低浓度的广泛分布。本研究进一步显示48.48%BTCC过表达CD，并呈现深棕色抗原颗粒局灶性堆积的特点，表现出BTCC异质性的细胞分子学基础，CD含量不同的肿瘤细胞亚群可能具有不同的浸润潜能。
本研究进一步显示CD过表达更易见于低分化或浸润性BTCC(P<0.05)，提示CD的过表达有可能作为判断其恶性程度和侵袭潜能的指标之一。在天冬氨酰酶类中，CD的起源和进化最低且分布广泛，由此推测原始未分化或低分化肿瘤细胞更易强表达CD，与本研究结果相一致。但Dickinson等[5]研究BTCC时得出了相反的结论，CD阳性更易出现于分化较好的肿瘤组织，而CD阴性表达是预后不良的标记。从CD的合成过程可见：分子量为52KD的酶原形式(Pro-CD)大量转移进入溶酶体方可形成48KD的活性形式。正常细胞或高分化肿瘤细胞中以无活性的Pro-CD形式为主，而低分化的肿瘤细胞中以活性CD形式为主。本研究所用兔抗人多抗可同时检测Pro-CD和CD，而仅应用Pro-CD或CD单抗检测可能得到相反的结论和不同的预后意义。Lunec等[6]发现一些多灶性肿瘤起源于单克隆，复发原因可能由于细胞向周围上皮的播散。本研究也表明复发或多发病例中的肿瘤细胞能够大量合成分泌CD，更易溶解BM和ECM并向周围浸润。
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CD异常分泌源于CD基因的过表达和Pro-CD的水解过程，且生长因子又使CD基因转录增加，蛋白合成增多。生长因子的激活可使CD成为自分泌有丝分裂原，促进肿瘤细胞的生长。因此本研究还通过检测同一标本连续切片中EGFR的表达探讨其与CD的共同作用机制。由cerbB-1基因编码的EGFR是由1186个氨基酸组成的单链跨膜糖蛋白，分子量17KD，参与细胞膜信息传递，并在细胞恶性转化和增殖中起重要作用。人体多种恶性肿瘤组织可检测出EGFR的过表达。本研究所示CD、EGFR过表达具有显著相关性，提示EGF能诱导CD的合成或CD与EGFR受体相互作用，促进肿瘤细胞的增殖和移动，协同作用于BTCC的浸润转移。Dean等[7]证实，EGFR抗体可抑制一系列EGFR高表达肿瘤细胞系的生长，并能诱导EGFR高表达移植瘤的完全退缩。由本研究结果推测，EGFR抗体抑制肿瘤生长和转移的作用通过阻断EGFR与其配体的结合，还可能间接抑制或阻断了CD的作用。
应用CD抑制剂可预防其它蛋白水解酶的激活及BM、ECM的降解；细胞因子单抗在阻断其与配体结合的同时还可抑制CD的合成与分泌，进一步阻止BTCC发生浸润转移。因此，多途径阻断浸润转移的发生可能成为治疗的新方向。
, 百拇医药
参考文献
1，Rochefort H，Liaudet E，Garcia M.Alteration and role of human cathepsin D in cancer metastasis.Enzyme Protein，1996，49：106-117.
2，Reid WA，Valler MJ，Kay J.Immunolocalisation of cathepsin D in normal and neoplastic human tissues.J Clin Pathol，1986，39：1323-1330.
3，Markar R，Mason A，Kittelson JM，et al.Immunohistochemical analysis of cathepsin D in prostate carcinoma.Mod Pathol，1994，7：747-751.
, 百拇医药
4，Schwatz MK.Tissue cathepsins as tumor markers.Clinica Chemica Acta，1995，237：67-68.
5，Dickinson AJ，Fox SB，Newcomb PV，et al.An immunohistochemical and prognostic evaluation of cathepsin D expression in 105 bladder carcinomas.J Urol，1995，154：237-241.
6，Lunec J，Challen C，Wright C，et al.CerbB-2 amplification and identical p53 mutation in concomitant transitional carcinomas of renal pelvis and urinary bladder.Lancet，1992，339：439-440.
7，Dean C，Modjtahedi H，Ecdes S.Immunotherapy with antibodies to the EGF receptor.Int J Cancer Suppl，1994，8：103-107.
(收稿：1999-09-05 修回：1999-11-20), 百拇医药
单位：顾晓(200080 上海市第一人民医院泌尿外科)；眭元庚 徐正铨 尤国才 吴宏飞(南京医科大学第一附属医院泌尿外科)
关键词：膀胱肿瘤；癌；组织蛋白酶D；表皮生长因子受体
江苏医药000607 【摘要】 目的 探讨组织蛋白酶D(CD)、表皮生长因子受体(EGFR)的表达与膀胱移行细胞癌(BTCC)生物学行为间的关系及其发生浸润转移的机制。方法 应用免疫组化ABC法检测33例BTCC及12例正常膀胱组织中CD、EGFR的表达。结果 正常膀胱移行细胞CD均呈弱阳性表达，BTCC组肿瘤细胞CD中/强阳性表达率显著高于正常对照组(P<0.05)，且在不同病理分级，临床分期，单发与多发，初发与复发组间均有显著性差异(P<0.05)。BTCC组CD、EGFR的过表达率有显著相关性(P<0.05)。结论 CD与BTCC生物学特性密切相关，与EGFR协同作用促进肿瘤发生浸润转移。
, 百拇医药
Expression and relativity of cathepsin D and epidermal growth factor receptor in human transitional cell carcinoma of bladder
GU Xiao SUI Yuangeng XU Zhengquan
(Department of Urology，the First People’s Hospital of Shanghai，Shanghai 200080)
【Abstract】 Objective To evaluate the relationship between the expression of cathepsin D(CD)or epidermal growth factor receptor (EGFR)and biological behavior of bladder transitional cell carcinoma(BTCC)and the mechanisms of invasiveness and metastasis.Methods The expression of CD and EGFR was detected by standard ABC immunohistochemical technique in 33 paraffin-embedded tissue specimens of BTCC.Results CD antigen was weakly stained in all normal transitional cells.The moderately or strongly positive rate of CD in BTCC group was significantly higher than that in normal control group(P<0.05).Fisher’s accuracy analysis showed that moderately and strongly positive rate of CD in tumor cells were closely correlated with different pathological grades(P<0.05)，clinical stages(P<0.05)，number of lesions(P<0.05)and postoperative recurrence(P<0.05).The over expression of CD and EGFR showed significant relativity in the same groups of BTCC(P<0.05).Conclusion The over expression of CD was closely correlated with complex and variable biological characteristics of BTCC.The synergy of CD and EGFR may influence the invasiveness and metastasis of BTCC.
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【Key words】 Bladder neoplasms Carcinoma Cathepsin D Epidermal growth factor receptor
膀胱移行细胞癌(Bladder Transitional Cell Carcinoma，BTCC)生物学行为复杂而多变，浸润性是其中的突出表现之一。研究表明蛋白水解酶通过降解一系列的天然屏障在肿瘤的浸润转移中发挥重要作用，组织蛋白酶D(Cathepsin，CD)是参与此过程的重要因素之一，且细胞因子又可以诱导CD的合成与分泌，进一步促使肿瘤发生浸润转移[1]。有关乳癌、结肠癌、前列腺癌的研究已表明：CD含量与他们的生物学特性密切相关[2～3]。但在膀胱肿瘤方面的研究甚少，本文旨在通过检测CD、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)在BTCC中的表达及其相关性，探讨CD、EGFR与BTCC生物学行为间的关系及其发生浸润转移的机制。
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材料和方法
一、材料和分组
1.BTCC组33例，为1995年～1997年间手术切除并经病理证实为BTCC的存档蜡块标本。男性25例，女性8例；年龄38～81岁，平均60.8岁。按WHO病理分级标准：G1级10例，G2级15例，G3级8例；按UICC-TNM临床分期标准：Ta～T116例，T2～T417例；肿瘤单发18例，多发15例；初发19例，复发14例。
2.正常对照组12例，均取自其它原因死亡的尸体膀胱，年龄19～49岁，平均25.7岁。
二、主要试剂和方法
一抗为美国DAKO公司兔抗人CD多克隆抗体，美国Santa Cruz公司兔抗人EGFR多克隆抗体，二抗为美国Vector公司生物素化抗兔IgG试剂盒。
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每例标本连续石蜡切片3张，片厚5 μm，一张常规HE染色，复核病理诊断，分级和分期，结合免疫组化染色观察抗原定位。另2张作CD、EGFR免疫组化ABC法染色，两者所用一抗及二抗稀释度均为1∶100，DAB作为底物显色。
以乳癌组织作阳性对照，以其他原因死亡的尸体膀胱组织作正常对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
三、结果判定标准
镜下细胞结构清晰，阳性颗粒定性、定位良好且着色明显高于背景者为阳性。将染色结果分为：阴性(染色细胞数≤5%)，弱阳性(染色细胞数5%～25%)，中/强阳性(染色细胞>25%)。阳性结果由三位独立的评估者得出一致的结论所决定。
四、统计学处理
本研究结果均为半定量分析的计数资料，应用Pentuium133型计算机SAS 6.04软件处理实验数据，作Fisher精确概率χ2检验及配对的χ2检验。
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结 果
一、CD在正常移行细胞胞质内均呈弱阳性表达，尤其表层伞形细胞呈阳性染色。肿瘤细胞中CD抗原可呈中/强阳性染色，棕黄色颗粒分布于胞浆。BTCC组中CD中/强阳性率48.48%，显著高于正常对照组(P<0.05)。EGFR在正常移行细胞中呈阴性表达，肿瘤细胞胞质、胞膜可见棕黄色颗粒染色，呈阳性表达。
二、不同病理分级和临床分期组间肿瘤细胞CD中/强阳性表达率有显著性差异(P<0.05)，且随恶性程度和侵袭能力增加而增高；复发组和多发组肿瘤细胞CD中/强阳性表达率均分别显著高于初发组和单发组(P<0.05)，见表1。
三、CD、EGFR在肿瘤细胞中的过表达率有显著相关性(P<0.05)，见表2。
讨 论
CD是广泛存在于人体细胞溶酶体的天冬酰氨蛋白酶原的激活形式，由定位于11P15的基因编码。体内细胞首先合成一种52KD无活性的前体形式，在溶酶体中通过蛋白水解过程，合成有催化活性的48KD蛋白，由分子量为34KD和14KD的两条单链组成，能够分解基底膜(BM)和细胞外基质(ECM)，并具有促有丝分裂活性[4]。在浸润转移过程中，包括CD在内的一系列不同的蛋白水解酶通过类似凝血过程的方式活化不同的无活性前体，催化降解BM和ECM，形成局部溶解区以构成肿瘤细胞移动的通道，使其易于移动穿过ECM和脉管壁进入循环。
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表1 CD表达与BTCC不同病理分级、临床分期、单发与多发、初发与复发组间的关系
肿瘤细胞CD表达
P值
弱阳性
中/强阳性
病理分级G1
9
1
G2
6
9
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G3
2
6
临床分期
Ta～T1
12
4
T2～T4
5
12
0.015
单发
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13
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多发
4
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初发
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3
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表2 BTCC中CD、EGFR的表达相关性 EGFR表达
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肿瘤细胞CD的表达
χ2
P值
弱阳性
中/强阳性
阴性
13
2
13.604
<0.05
阳性
4
14
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本研究显示全部的正常移行上皮细胞中CD均呈弱阳性表达，证实CD在人体细胞中低浓度的广泛分布。本研究进一步显示48.48%BTCC过表达CD，并呈现深棕色抗原颗粒局灶性堆积的特点，表现出BTCC异质性的细胞分子学基础，CD含量不同的肿瘤细胞亚群可能具有不同的浸润潜能。
本研究进一步显示CD过表达更易见于低分化或浸润性BTCC(P<0.05)，提示CD的过表达有可能作为判断其恶性程度和侵袭潜能的指标之一。在天冬氨酰酶类中，CD的起源和进化最低且分布广泛，由此推测原始未分化或低分化肿瘤细胞更易强表达CD，与本研究结果相一致。但Dickinson等[5]研究BTCC时得出了相反的结论，CD阳性更易出现于分化较好的肿瘤组织，而CD阴性表达是预后不良的标记。从CD的合成过程可见：分子量为52KD的酶原形式(Pro-CD)大量转移进入溶酶体方可形成48KD的活性形式。正常细胞或高分化肿瘤细胞中以无活性的Pro-CD形式为主，而低分化的肿瘤细胞中以活性CD形式为主。本研究所用兔抗人多抗可同时检测Pro-CD和CD，而仅应用Pro-CD或CD单抗检测可能得到相反的结论和不同的预后意义。Lunec等[6]发现一些多灶性肿瘤起源于单克隆，复发原因可能由于细胞向周围上皮的播散。本研究也表明复发或多发病例中的肿瘤细胞能够大量合成分泌CD，更易溶解BM和ECM并向周围浸润。
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CD异常分泌源于CD基因的过表达和Pro-CD的水解过程，且生长因子又使CD基因转录增加，蛋白合成增多。生长因子的激活可使CD成为自分泌有丝分裂原，促进肿瘤细胞的生长。因此本研究还通过检测同一标本连续切片中EGFR的表达探讨其与CD的共同作用机制。由cerbB-1基因编码的EGFR是由1186个氨基酸组成的单链跨膜糖蛋白，分子量17KD，参与细胞膜信息传递，并在细胞恶性转化和增殖中起重要作用。人体多种恶性肿瘤组织可检测出EGFR的过表达。本研究所示CD、EGFR过表达具有显著相关性，提示EGF能诱导CD的合成或CD与EGFR受体相互作用，促进肿瘤细胞的增殖和移动，协同作用于BTCC的浸润转移。Dean等[7]证实，EGFR抗体可抑制一系列EGFR高表达肿瘤细胞系的生长，并能诱导EGFR高表达移植瘤的完全退缩。由本研究结果推测，EGFR抗体抑制肿瘤生长和转移的作用通过阻断EGFR与其配体的结合，还可能间接抑制或阻断了CD的作用。
应用CD抑制剂可预防其它蛋白水解酶的激活及BM、ECM的降解；细胞因子单抗在阻断其与配体结合的同时还可抑制CD的合成与分泌，进一步阻止BTCC发生浸润转移。因此，多途径阻断浸润转移的发生可能成为治疗的新方向。
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参考文献
1，Rochefort H，Liaudet E，Garcia M.Alteration and role of human cathepsin D in cancer metastasis.Enzyme Protein，1996，49：106-117.
2，Reid WA，Valler MJ，Kay J.Immunolocalisation of cathepsin D in normal and neoplastic human tissues.J Clin Pathol，1986，39：1323-1330.
3，Markar R，Mason A，Kittelson JM，et al.Immunohistochemical analysis of cathepsin D in prostate carcinoma.Mod Pathol，1994，7：747-751.
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4，Schwatz MK.Tissue cathepsins as tumor markers.Clinica Chemica Acta，1995，237：67-68.
5，Dickinson AJ，Fox SB，Newcomb PV，et al.An immunohistochemical and prognostic evaluation of cathepsin D expression in 105 bladder carcinomas.J Urol，1995，154：237-241.
6，Lunec J，Challen C，Wright C，et al.CerbB-2 amplification and identical p53 mutation in concomitant transitional carcinomas of renal pelvis and urinary bladder.Lancet，1992，339：439-440.
7，Dean C，Modjtahedi H，Ecdes S.Immunotherapy with antibodies to the EGF receptor.Int J Cancer Suppl，1994，8：103-107.
(收稿：1999-09-05 修回：1999-11-20), 百拇医药