腺病毒介导的p53和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用
作者：鲁建国 林晨 黄志强 马庆久 付明 张雪艳 梁萧 要秀 吴旻
单位：鲁建国 马庆久 吴旻(第四军医大学唐都医院普外科 西安 710038)；林晨 付明 张雪艳 梁萧 要秀(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室)；黄志强(解放军总医院普外研究所)
关键词：胆管癌；p53基因；腺病毒；顺铂；基因治疗；凋亡
中国现代医学杂志000610 目的：研究p53基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用。方法：将重组体腺病毒p53和顺铂联合作用于人胆管癌细胞QBC939，对p53基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果：用Ad-LacZ进行重组腺病毒转导效率的检测，发现当MOI为100以上时，重组腺病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被传导。用RT-PCR方法检测，在胆管癌QBC939细胞系中p53无表达。重组体腺病毒能介导外源基因p53在胆管癌QBC939细胞系中高效表达。重组体腺病毒介导的p53在QBC939细胞中表达，能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。其与顺铂联合应用对QBC939细胞的生长抑制具有明显作用。流式细胞计数证实p53能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞，顺铂能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致细胞发生明显的G2期阻滞。结论：p53基因能够增加QBC939细胞对顺铂的敏感性。
, 百拇医药
分类号 R735.8
INHIBITED GROWTH OF QBC939 CELL LINES OF
BILE DUCT CANCER BY COMBINATION APPLI CATION p53 CENE AND
CISPLATINE BY MEDIATED ADENOVIRUS VECTOR
Lu Jianguo，Lin Cheng，Huang Zhiqiang，et al.
(Department of General Surgery, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medi cine College, Xi'an 710038)
, 百拇医药
[Abstract] Objective: To study the effect of combination ap plication p53 gene an d cisplatine in QBC939 bile duct cancer cell lines. Methods: Ana lyse the express ion of p53 gene and inhibited growth of QBC939 cell lines by combination applica tion p53 gene mediated by recombination adenoviral vector and cisplatine. Result s: If MOI>100, 90% QBC939 cells were transductd by recombination adenovi ral vect or when we detected the efficiency of transduction by using Ad-LacZ system. The expression of p53 gene was not detected by RT-PCR method. The high active expres sion of p53 gene in bile duct cancer cell lines used recombination adenoviral ve ctor. The expression of p53 gene by this way can inhibit growing and forming col ony of QBC939 cell lines. Combination application recombination adenoviral p53 g ene vector and cisplative can obviously inhibit QBC939 cell growth. By FCM analy sing, p53 gene can induce cells apoptosis and make it G1 arrest; Cisplatine can induce cell apoptosis and make it G2 arrest. Conclusions: p53 ge ne can enhance the sensibility of cisplatine in QBC939 cell lines.
, http://www.100md.com
Key words: Bile duct cancer; p53 gene adenovirus; Cisplatine; Ge ne therapy; Apoptosis
化疗是肿瘤治疗的一个基本措施，但其毒副作用及肿瘤的复发仍是一个需要迫切解决的问题。本研究以胆管癌细胞为研究对象，探讨了p53基因和化疗药物顺铂联合应用的可能性及机制，现将结果报告如下。
1 材料与方法
重组腺病毒：Ad-p53及Ad-LacZ由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室构建。细胞系：人胆管癌细胞系QBC939细胞由第三军医大学西南医院肝胆外科王曙光教授惠赠。培养条件为5340培养基，含100ml/L胎牛血清，37℃、50ml/L CO2。PCR引物：由上海Sangon公司合成。p53 PCR引物：由上海Sangon公司合成(扩增产物620bp)：上游1：5’-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3’，下游2：5’-CTTAGCACCTGAAGGGTGAAATATTC-3；tubulin(扩增产物410bp)：上游：5’-CTCATCACAGGCAAGGAAGAT-3’，下游：5’-TTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG-3’。
, http://www.100md.com
重组体腺病毒的繁殖、纯化、滴度测定，病毒感染，重组腺病毒的转导效率测定，细胞存活率测定，克隆形成实验，流式细胞仪对细胞周期、RT-PCR分析及凋亡的分析参照有关文献[1]。扩增p53反应条件：95℃ 5min，94℃ 30s,65℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 1min，26个循环。统计分析采用SAS统计软件包。
2 结果
2.1 重组体腺病毒滴度的测定
重组腺病毒纯化后的滴度分别为Ad-p16:2.0×1010pfu/ml,Ad-LacZ:1.0×1010pfu/ml。
2.2 重组体腺病毒的转导效率
在MOI大于100的感染强度时，重组体腺病毒即可达到90%以上的转导效率[1]。
, 百拇医药
2.3 腺病毒介导外源性p53的表达
结果见附图。Ad-p53使QBC939细胞中p53mRNA的水平明显升高，感染前QBC939细胞中无p53mRNA。
附图 RT-PCR分析Ad-p53感染前后的QBC939细胞的表达
C：感染前4天；4d：感染后4天；M：X174DNA/HaeⅢMarkers Maker
2.4 腺病毒介导p53基因和顺铂联合应用对肿瘤细胞生长的影响
Ad-p53(100 MOI)对QBC939的生长抑制率可达到24.4%(8d)，与对照组及Ad-LacZ组(1.4%)比较，有显著差异(P<0.05)。以Ad-LacZ为对照，CDDP(0.5及1.0μg/ml)对QBC939细胞的生长抑制率分别为56.0%和67.8%(8d,P<0.01)，Ad-p53(50MOI)和CDDP(0.5μg/ml)联合应用对QBC939细胞的生长抑制率达79.7%(8d)，与单用Ad-p53(100MOI)或单用顺铂(1.0μg/ml)对QBC939细胞的生长抑制率相比较，P<0.05。
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2.5 顺铂对肿瘤克隆形成能力的影响
QBC939细胞感染Ad-p53(MOI为100)后，克隆形成数减少，与对照组及Ad-LacZ组比较，抑制率为41.8%，有显著差异(P<0.01)，大大降低了QBC939细胞的克隆形成能力。CDDP(0.5、1.0μg/ml)处理后的QBC939细胞，克隆形成数为0，各组与Ad-LacZ比较，有极显著意义。
2.6 腺病毒介导p53和顺铂对肿瘤细胞的作用和机制分析
对Ad-LacZ、Ad-p53(MOI为100)、Ad-p53(MOI为50)和顺铂(0.5μg/ml)处理QBC939细胞进行流式细胞计数分析，结果见附表。与Ad-LacZ相比，p53能引起QBC939细胞明显的剂量依赖性的细胞凋亡，以及QBC939细胞的G1期阻滞。顺铂能引起QBC939细胞明显的剂量依赖性的细胞凋亡，以及QBC939细胞的G2期阻滞。两者联合应用使G2期阻滞和细胞凋亡更加明显。
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附表 流式细胞仪分析腺病毒介导p53和CDDP和QBC939细胞周期的作用 (4d) 组别
% of cell in diffent phases(%
±s)
G1
S
G2/M
Control
22.6±3.6
43.8±1.9
33.6±2.6
Ad-LacZ(100MOI)
, http://www.100md.com
35.5±2.7
36.3±3.8
28.5±4.7
Ad-p53(100MOI)
46.4±4.51)
22.0±6.31)
31.6±5.4
CDDP(1.0mg/ml)
19.0±4.61)
23.2±4.81)
, 百拇医药 57.8±3.31)2)
Adp53(50MOI)+CDDP(0.5μg/ml)
34.1±2.23)
3.0±2.61)2)
62.9±5.91)2)
注：1)与Control、Ad-Lacz比较P<0.05
2)与Ad-p53比较P<0.05
3)与CDDP比较P<0.053 讨论
多年以来，化疗是肿瘤治疗的一个基本措施，尽管它可以杀死肿瘤细胞，但也可以杀死处于细胞周期中的非肿瘤细胞，这些副作用如恶病质及免疫抑制等可造成严重的后果，限制了化疗的应用，也造成了一些肿瘤细胞的残留，从而形成新的肿瘤病灶及产生对化疗药物的抵抗和耐受。因此，肿瘤的化疗及其毒副作用及肿瘤的复发仍是一个需要迫切解决的问题[2～4]。
, http://www.100md.com
p53是引起G1期阻滞的一个重要因素[5]。细胞DNA损伤时，p53水平升高，导致p21的活化，引起G1期阻滞。p53的失活，引起损伤的DNA发生复制，最终出现恶变的克隆[6]。凋亡作为一种生理性调节机制，与机体生长、发育、稳态的维持及许多疾病的发生有很密切的关系。p53基因就是研究得较多的参与凋亡的基因之一。在一些肿瘤细胞中，导入野生p53基因，便可诱导肿瘤细胞生长停滞和凋亡[7～9]。研究进一步显示，人类肿瘤细胞周期调节基因的改变，其对化疗的敏感性也发生改变[10]。如肿瘤细胞在p53缺失的情况下，对化疗的耐受性增加[11]。随着外源性p53的介入，肿瘤细胞于短时间在化疗药物的作用下出现凋亡和死亡[12]。
我们的实验证实了Ad-p53和CDDP合用能明显增加疗效。体外实验结果显示，流式细胞计数结果显示p53能导致QBC939发生明显的细胞G1期阻滞和凋亡；顺铂能导致QBC939发生明显的细胞G2期阻滞和凋亡。我们分析细胞周期的阻滞，其节点主要是在G1-S和G2-M期的阻滞，并引起肿瘤细胞的凋亡和死亡，从而导致其明显的抑瘤活性和协同作用。
, 百拇医药
对于胆管癌的一系列治疗，包括手术、化疗和放疗，目前已取得了很大的进展，但其长期的生存率仍不尽如人意。本实验为今后临床上开展基因治疗提供了实验依据和材料。一方面，Ad-p53和CDDP的联合应用不但可以明显提高疗效，还能明显减少化疗药物的用量，从而增加病人对化疗药物的耐受性；另一方面，肿瘤的治疗应该尽量减少其对正常细胞的毒副作用，CDDP对正常细胞的LD50(药物的半数致死量)在G1期阻滞状态下可达增殖状态下的8倍，从而减少CDDP对正常细胞的毒副作用。正常细胞G1期阻滞后不发生凋亡。p53可使正常细胞暂时处于G1期阻滞状态，此状态是可逆的。当p53作用消失后，正常细胞G1期阻滞状态消失，细胞进入正常分化增殖阶段[2～4]。在正常细胞G1期阻滞状态时，由于其对化疗药物不敏感，此时，也可增加化疗药物的剂量，更有效地杀死肿瘤细胞，而对正常细胞的影响显著减少[13]。临床可以做为手术后预防局部复发、耐药的原发和转移的胆管癌的一个辅助治疗，为今后临床上胆管癌的治疗提供了一个新的行之有效的治疗方法。
, 百拇医药
国家863高科学技术发展资助项目(No.Z20-01-02)
参考文献
1，鲁建国，林 晨，黄志强，等.腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用.第四军医大学学报，2000；21：464～468
2，Hrtwell H,Kastan MB.Cell cycle control and cancer.Sciene,1994;266:1821～1812
3，Kohn KW,Jackman J,Connor P.Cell cycle control and cancer chemotherapy,1995;58:440～452
4，Darzynkiewicz Z.Apoptosis in anticancer stragegies:modulation of cell cycle differentiantion. J Cell Biochem,1995;58:151～159
, http://www.100md.com
5，Steele RJ,Thompson AM,Hall PA,et al.The p53 tumor suppressor gene.Br J Surg,1998;85(11):1460～1467
6，EI-Deiry WS,Tokino VE,Velculescu DB,et al.WAF1,a otential mediator of p53 tumor suppresion.Cell,1993;362:849～852
7，Timiryasova TM,Chen B,Haghighat P,et al.Vaccinia virus-mediated expression of wild-type p53 suppresses glioma cell growth and indues apoptosis.Int J Oncol,1999;14(5):845～854
8，Habib NA,Mitry RR,Sadri R,p53 and gene therapy for hepatocellular carcinoma.Adv Exp Med Biol,1998;451:499～504
, 百拇医药
9，Ohashi M,Kanai F,Ueno H,et al.Adenovirus mediated p53 tumoursuppressor gene therapy for human gastric cancer cells in vitro and in vivo.Gut,1999;44(3):366～371
10，Hochhauser D.Modulation of chemosensitivity through altered expression of cell cycle regulatory genes in cancer.Anticancer Drugs,1997;8(10):903～910
11，Lowe SW,Ruley HE,Jacks T,et al.p52-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993;74:957～967
12，Fujiwara T,Grimn EA,Mukhopadhgag T,et al.Induction of chemosensitivty in human lung cner cell in vivo by adenovirus-mediated transfer of the wild-type p53 gene.Cancer Res,1994;54:2287～2291
13，Stone S,Dayananth P,Kamb A.Reversible.p16-mediated cell cycle arrest as protection from chemotheray.Cancer Res,1996;56(14):3199～3202, 百拇医药
单位：鲁建国 马庆久 吴旻(第四军医大学唐都医院普外科 西安 710038)；林晨 付明 张雪艳 梁萧 要秀(中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室)；黄志强(解放军总医院普外研究所)
关键词：胆管癌；p53基因；腺病毒；顺铂；基因治疗；凋亡
中国现代医学杂志000610 目的：研究p53基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用。方法：将重组体腺病毒p53和顺铂联合作用于人胆管癌细胞QBC939，对p53基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果：用Ad-LacZ进行重组腺病毒转导效率的检测，发现当MOI为100以上时，重组腺病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被传导。用RT-PCR方法检测，在胆管癌QBC939细胞系中p53无表达。重组体腺病毒能介导外源基因p53在胆管癌QBC939细胞系中高效表达。重组体腺病毒介导的p53在QBC939细胞中表达，能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。其与顺铂联合应用对QBC939细胞的生长抑制具有明显作用。流式细胞计数证实p53能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞，顺铂能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致细胞发生明显的G2期阻滞。结论：p53基因能够增加QBC939细胞对顺铂的敏感性。
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分类号 R735.8
INHIBITED GROWTH OF QBC939 CELL LINES OF
BILE DUCT CANCER BY COMBINATION APPLI CATION p53 CENE AND
CISPLATINE BY MEDIATED ADENOVIRUS VECTOR
Lu Jianguo，Lin Cheng，Huang Zhiqiang，et al.
(Department of General Surgery, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medi cine College, Xi'an 710038)
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[Abstract] Objective: To study the effect of combination ap plication p53 gene an d cisplatine in QBC939 bile duct cancer cell lines. Methods: Ana lyse the express ion of p53 gene and inhibited growth of QBC939 cell lines by combination applica tion p53 gene mediated by recombination adenoviral vector and cisplatine. Result s: If MOI>100, 90% QBC939 cells were transductd by recombination adenovi ral vect or when we detected the efficiency of transduction by using Ad-LacZ system. The expression of p53 gene was not detected by RT-PCR method. The high active expres sion of p53 gene in bile duct cancer cell lines used recombination adenoviral ve ctor. The expression of p53 gene by this way can inhibit growing and forming col ony of QBC939 cell lines. Combination application recombination adenoviral p53 g ene vector and cisplative can obviously inhibit QBC939 cell growth. By FCM analy sing, p53 gene can induce cells apoptosis and make it G1 arrest; Cisplatine can induce cell apoptosis and make it G2 arrest. Conclusions: p53 ge ne can enhance the sensibility of cisplatine in QBC939 cell lines.
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Key words: Bile duct cancer; p53 gene adenovirus; Cisplatine; Ge ne therapy; Apoptosis
化疗是肿瘤治疗的一个基本措施，但其毒副作用及肿瘤的复发仍是一个需要迫切解决的问题。本研究以胆管癌细胞为研究对象，探讨了p53基因和化疗药物顺铂联合应用的可能性及机制，现将结果报告如下。
1 材料与方法
重组腺病毒：Ad-p53及Ad-LacZ由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室构建。细胞系：人胆管癌细胞系QBC939细胞由第三军医大学西南医院肝胆外科王曙光教授惠赠。培养条件为5340培养基，含100ml/L胎牛血清，37℃、50ml/L CO2。PCR引物：由上海Sangon公司合成。p53 PCR引物：由上海Sangon公司合成(扩增产物620bp)：上游1：5’-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3’，下游2：5’-CTTAGCACCTGAAGGGTGAAATATTC-3；tubulin(扩增产物410bp)：上游：5’-CTCATCACAGGCAAGGAAGAT-3’，下游：5’-TTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG-3’。
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重组体腺病毒的繁殖、纯化、滴度测定，病毒感染，重组腺病毒的转导效率测定，细胞存活率测定，克隆形成实验，流式细胞仪对细胞周期、RT-PCR分析及凋亡的分析参照有关文献[1]。扩增p53反应条件：95℃ 5min，94℃ 30s,65℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 1min，26个循环。统计分析采用SAS统计软件包。
2 结果
2.1 重组体腺病毒滴度的测定
重组腺病毒纯化后的滴度分别为Ad-p16:2.0×1010pfu/ml,Ad-LacZ:1.0×1010pfu/ml。
2.2 重组体腺病毒的转导效率
在MOI大于100的感染强度时，重组体腺病毒即可达到90%以上的转导效率[1]。
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2.3 腺病毒介导外源性p53的表达
结果见附图。Ad-p53使QBC939细胞中p53mRNA的水平明显升高，感染前QBC939细胞中无p53mRNA。
附图 RT-PCR分析Ad-p53感染前后的QBC939细胞的表达
C：感染前4天；4d：感染后4天；M：X174DNA/HaeⅢMarkers Maker
2.4 腺病毒介导p53基因和顺铂联合应用对肿瘤细胞生长的影响
Ad-p53(100 MOI)对QBC939的生长抑制率可达到24.4%(8d)，与对照组及Ad-LacZ组(1.4%)比较，有显著差异(P<0.05)。以Ad-LacZ为对照，CDDP(0.5及1.0μg/ml)对QBC939细胞的生长抑制率分别为56.0%和67.8%(8d,P<0.01)，Ad-p53(50MOI)和CDDP(0.5μg/ml)联合应用对QBC939细胞的生长抑制率达79.7%(8d)，与单用Ad-p53(100MOI)或单用顺铂(1.0μg/ml)对QBC939细胞的生长抑制率相比较，P<0.05。
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2.5 顺铂对肿瘤克隆形成能力的影响
QBC939细胞感染Ad-p53(MOI为100)后，克隆形成数减少，与对照组及Ad-LacZ组比较，抑制率为41.8%，有显著差异(P<0.01)，大大降低了QBC939细胞的克隆形成能力。CDDP(0.5、1.0μg/ml)处理后的QBC939细胞，克隆形成数为0，各组与Ad-LacZ比较，有极显著意义。
2.6 腺病毒介导p53和顺铂对肿瘤细胞的作用和机制分析
对Ad-LacZ、Ad-p53(MOI为100)、Ad-p53(MOI为50)和顺铂(0.5μg/ml)处理QBC939细胞进行流式细胞计数分析，结果见附表。与Ad-LacZ相比，p53能引起QBC939细胞明显的剂量依赖性的细胞凋亡，以及QBC939细胞的G1期阻滞。顺铂能引起QBC939细胞明显的剂量依赖性的细胞凋亡，以及QBC939细胞的G2期阻滞。两者联合应用使G2期阻滞和细胞凋亡更加明显。
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附表 流式细胞仪分析腺病毒介导p53和CDDP和QBC939细胞周期的作用 (4d) 组别
% of cell in diffent phases(%
±s)G1
S
G2/M
Control
22.6±3.6
43.8±1.9
33.6±2.6
Ad-LacZ(100MOI)
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35.5±2.7
36.3±3.8
28.5±4.7
Ad-p53(100MOI)
46.4±4.51)
22.0±6.31)
31.6±5.4
CDDP(1.0mg/ml)
19.0±4.61)
23.2±4.81)
, 百拇医药 57.8±3.31)2)
Adp53(50MOI)+CDDP(0.5μg/ml)
34.1±2.23)
3.0±2.61)2)
62.9±5.91)2)
注：1)与Control、Ad-Lacz比较P<0.05
2)与Ad-p53比较P<0.05
3)与CDDP比较P<0.053 讨论
多年以来，化疗是肿瘤治疗的一个基本措施，尽管它可以杀死肿瘤细胞，但也可以杀死处于细胞周期中的非肿瘤细胞，这些副作用如恶病质及免疫抑制等可造成严重的后果，限制了化疗的应用，也造成了一些肿瘤细胞的残留，从而形成新的肿瘤病灶及产生对化疗药物的抵抗和耐受。因此，肿瘤的化疗及其毒副作用及肿瘤的复发仍是一个需要迫切解决的问题[2～4]。
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p53是引起G1期阻滞的一个重要因素[5]。细胞DNA损伤时，p53水平升高，导致p21的活化，引起G1期阻滞。p53的失活，引起损伤的DNA发生复制，最终出现恶变的克隆[6]。凋亡作为一种生理性调节机制，与机体生长、发育、稳态的维持及许多疾病的发生有很密切的关系。p53基因就是研究得较多的参与凋亡的基因之一。在一些肿瘤细胞中，导入野生p53基因，便可诱导肿瘤细胞生长停滞和凋亡[7～9]。研究进一步显示，人类肿瘤细胞周期调节基因的改变，其对化疗的敏感性也发生改变[10]。如肿瘤细胞在p53缺失的情况下，对化疗的耐受性增加[11]。随着外源性p53的介入，肿瘤细胞于短时间在化疗药物的作用下出现凋亡和死亡[12]。
我们的实验证实了Ad-p53和CDDP合用能明显增加疗效。体外实验结果显示，流式细胞计数结果显示p53能导致QBC939发生明显的细胞G1期阻滞和凋亡；顺铂能导致QBC939发生明显的细胞G2期阻滞和凋亡。我们分析细胞周期的阻滞，其节点主要是在G1-S和G2-M期的阻滞，并引起肿瘤细胞的凋亡和死亡，从而导致其明显的抑瘤活性和协同作用。
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对于胆管癌的一系列治疗，包括手术、化疗和放疗，目前已取得了很大的进展，但其长期的生存率仍不尽如人意。本实验为今后临床上开展基因治疗提供了实验依据和材料。一方面，Ad-p53和CDDP的联合应用不但可以明显提高疗效，还能明显减少化疗药物的用量，从而增加病人对化疗药物的耐受性；另一方面，肿瘤的治疗应该尽量减少其对正常细胞的毒副作用，CDDP对正常细胞的LD50(药物的半数致死量)在G1期阻滞状态下可达增殖状态下的8倍，从而减少CDDP对正常细胞的毒副作用。正常细胞G1期阻滞后不发生凋亡。p53可使正常细胞暂时处于G1期阻滞状态，此状态是可逆的。当p53作用消失后，正常细胞G1期阻滞状态消失，细胞进入正常分化增殖阶段[2～4]。在正常细胞G1期阻滞状态时，由于其对化疗药物不敏感，此时，也可增加化疗药物的剂量，更有效地杀死肿瘤细胞，而对正常细胞的影响显著减少[13]。临床可以做为手术后预防局部复发、耐药的原发和转移的胆管癌的一个辅助治疗，为今后临床上胆管癌的治疗提供了一个新的行之有效的治疗方法。
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国家863高科学技术发展资助项目(No.Z20-01-02)
参考文献
1，鲁建国，林 晨，黄志强，等.腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用.第四军医大学学报，2000；21：464～468
2，Hrtwell H,Kastan MB.Cell cycle control and cancer.Sciene,1994;266:1821～1812
3，Kohn KW,Jackman J,Connor P.Cell cycle control and cancer chemotherapy,1995;58:440～452
4，Darzynkiewicz Z.Apoptosis in anticancer stragegies:modulation of cell cycle differentiantion. J Cell Biochem,1995;58:151～159
, http://www.100md.com
5，Steele RJ,Thompson AM,Hall PA,et al.The p53 tumor suppressor gene.Br J Surg,1998;85(11):1460～1467
6，EI-Deiry WS,Tokino VE,Velculescu DB,et al.WAF1,a otential mediator of p53 tumor suppresion.Cell,1993;362:849～852
7，Timiryasova TM,Chen B,Haghighat P,et al.Vaccinia virus-mediated expression of wild-type p53 suppresses glioma cell growth and indues apoptosis.Int J Oncol,1999;14(5):845～854
8，Habib NA,Mitry RR,Sadri R,p53 and gene therapy for hepatocellular carcinoma.Adv Exp Med Biol,1998;451:499～504
, 百拇医药
9，Ohashi M,Kanai F,Ueno H,et al.Adenovirus mediated p53 tumoursuppressor gene therapy for human gastric cancer cells in vitro and in vivo.Gut,1999;44(3):366～371
10，Hochhauser D.Modulation of chemosensitivity through altered expression of cell cycle regulatory genes in cancer.Anticancer Drugs,1997;8(10):903～910
11，Lowe SW,Ruley HE,Jacks T,et al.p52-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993;74:957～967
12，Fujiwara T,Grimn EA,Mukhopadhgag T,et al.Induction of chemosensitivty in human lung cner cell in vivo by adenovirus-mediated transfer of the wild-type p53 gene.Cancer Res,1994;54:2287～2291
13，Stone S,Dayananth P,Kamb A.Reversible.p16-mediated cell cycle arrest as protection from chemotheray.Cancer Res,1996;56(14):3199～3202, 百拇医药