厚片法测定大鼠胃壁粘液凝胶层的厚度
作者：湛先保 李兆申 许国铭 崔忠敏 段义民
单位：湛先保(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)；李兆申(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)；许国铭(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)；崔忠敏(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)；段义民(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)
关键词：胃粘膜; 粘液凝胶层
第二军医大学学报000631 【中图分类号】 R 333.2 【文献标识码】 B
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0594-01
人及多种动物胃粘膜表面结合粘液凝胶层(AML)是粘液屏障的形态基础。其厚度的实验室测定方法主要有冰冻切片、超声测定、微电极法及裂隙灯辅助测定等，这些方法或因需特殊设备、或因操作烦琐、或因欠准确，使胃壁结合粘液凝胶层厚度的测定应用受到限制。现介绍一种在国外研究基础上改良的、简便易行的胃壁AML厚度测定方法。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验材料及动物 雄性SD大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；37XAZ倒置显微镜为上海光学仪器厂产品；乌拉坦为Sigma公司产品，上海化学试剂采购站分装；飞鹰牌双面刀片为上海刀片厂产品。
1.2 胃粘膜厚片标本制备 取10只SD大鼠禁食24 h、禁水1 h后，20%乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，剖腹并取出胃，沿胃大弯切开使胃粘膜外翻，生理盐水轻轻漂洗，分别于腺胃前后壁中心处向粘膜下层注入0.5 ml生理盐水，使粘膜层隆起并与粘膜下层分离，用眼科剪切下胃粘膜后铺于普通滤纸上，胃粘膜腔面朝上，用间隔1.6 mm的平行刀片(用胶布将两只双面刀片平行固定于载玻片两侧，刀刃侧平行，间隔一个载玻片厚度约1.6 mm)垂直于粘膜面切取1.6 mm粘膜组织厚片，将厚片转90о铺于载玻片上，供测定胃壁结合粘液凝胶层厚度用。离体后全部操作宜在10 min内完成。
1.3 胃壁粘液凝胶层厚度测定 将厚片置于倒置显微镜上，可见自粘膜表面至粘膜下滤纸层分为暗、明、暗3个分界明显的条带，分别为粘附溶液层、凝胶层、粘膜组织及滤纸层。当用墨汁对粘附溶液进行染色时，可见凝胶层不被染黑，3条带分界更清晰。用目镜测微尺测定中间明亮带厚度，即可得胃壁粘液凝胶层厚度。每只鼠胃壁粘膜切4～6张厚片，每张厚片每间隔500 μm测3～6次，每只鼠胃测定10～23次，取其平均值为鼠腺胃区粘液凝胶层厚度。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 测定结果以
±s表示
2 结 果
10只大鼠腺胃区共测152次，粘液凝胶层厚度为(100±11.81) μm；粘液凝胶层在所有腺胃标本均呈连续性分布；鼠间平均厚度从(79.09±18.91) μm至(119±51.56) μm不等；所有大鼠中单次测定值范围较大(34～238 μm)，但多数测定值相对集中。
3 讨 论
文献报道裂隙灯结合厚度仪方法所测的粘液凝胶层平均厚度为166 μm，与本方法所测结果有一定差异，分析原因是由于前者在测定之前幽门经结扎1～2 h，刺激迷走神经兴奋，促进粘液分泌[1]，而且该方法难以明确区分粘液凝胶层与粘附的已溶解的粘液或溶液所致。锑微电极法是根据粘液凝胶层形成pH梯度的特性，用微操纵装置控制pH敏感锑微电极测定pH梯度时反映粘液凝胶层厚度，国外据此方法测得的平均厚度为(695±202) μm。因微电极可挤压粘液凝胶层，故所测值与一般文献报道差异颇大，难以反映真实状况，且当粘液层pH梯度破坏时，不能用该方法，故其实际使用价值不大。冰冻切片虽不经过固定、脱水、包埋等破坏粘液凝胶的步骤，但切片仍可破坏凝胶，故也难以反映真实的粘液凝胶层厚度值。超声波的方法不仅烦琐，而且因难以区分凝胶层上下界面，故所测值也欠准确[2]。 粘液凝胶层在暗视野显微镜或相差显微镜下，与粘膜层和表面粘附溶液层分界明显，使测定准确可行。本实验结果显示大鼠不同次测定值间差异很大，从34 μm到238 μm，这与文献报道相符，国外报道其范围从5 μm至400 μm不等，这可能反映了大鼠胃粘膜粘附凝胶的实际状态。有文献报道禁食大鼠胃粘膜仅50%的面积覆盖有粘液凝胶层，且不同部位凝胶层厚度差异显著，而在进食或其他生理或病理状态下，则胃粘膜表面粘液凝胶层的厚度与覆盖面积发生了明显的改变。因此要保证测定大鼠粘膜的粘附凝胶层厚度的准确性，必须增加测定次数和统一测定部位。 本方法具有取材简单，操作方便，直接测定，接近生理状况的优点。使用过程中要求标本在切片前处于生理盐水中，勿使之干燥，切片过程中勿使粘液凝胶层牵拉挤压变形，切片后宜在10 min内测定。
, 百拇医药
【基金项目】军队医药卫生杰出中青年人才科研基金资助项目(1996卫科 训字95号)
【作者简介】湛先保(1972～)，男(汉族)，博士
【参考文献】
[1] Tanaka S,Tache Y,Kaneko H, et al. Central vagal activation increases mucus gel thickness and surface cell intracellular pH in rat stomach[J]. Gastroenterology, 1997,112(2):409-417.
[2] Sababi M, Nilsson E, Holm L.Mucus and alkali secretion in the rat duodenum:effects of indomethacin,N-omega-nitro-L-arginine, and luminal acid[J]. Gastroenterology, 1995,109(5):1526-1534.
【收稿日期】1999-10-11
【修回日期】2000-01-24
【本文编辑】 张寓景, 百拇医药
单位：湛先保(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)；李兆申(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)；许国铭(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)；崔忠敏(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)；段义民(第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)
关键词：胃粘膜; 粘液凝胶层
第二军医大学学报000631 【中图分类号】 R 333.2 【文献标识码】 B
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0594-01
人及多种动物胃粘膜表面结合粘液凝胶层(AML)是粘液屏障的形态基础。其厚度的实验室测定方法主要有冰冻切片、超声测定、微电极法及裂隙灯辅助测定等，这些方法或因需特殊设备、或因操作烦琐、或因欠准确，使胃壁结合粘液凝胶层厚度的测定应用受到限制。现介绍一种在国外研究基础上改良的、简便易行的胃壁AML厚度测定方法。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验材料及动物 雄性SD大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；37XAZ倒置显微镜为上海光学仪器厂产品；乌拉坦为Sigma公司产品，上海化学试剂采购站分装；飞鹰牌双面刀片为上海刀片厂产品。
1.2 胃粘膜厚片标本制备 取10只SD大鼠禁食24 h、禁水1 h后，20%乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，剖腹并取出胃，沿胃大弯切开使胃粘膜外翻，生理盐水轻轻漂洗，分别于腺胃前后壁中心处向粘膜下层注入0.5 ml生理盐水，使粘膜层隆起并与粘膜下层分离，用眼科剪切下胃粘膜后铺于普通滤纸上，胃粘膜腔面朝上，用间隔1.6 mm的平行刀片(用胶布将两只双面刀片平行固定于载玻片两侧，刀刃侧平行，间隔一个载玻片厚度约1.6 mm)垂直于粘膜面切取1.6 mm粘膜组织厚片，将厚片转90о铺于载玻片上，供测定胃壁结合粘液凝胶层厚度用。离体后全部操作宜在10 min内完成。
1.3 胃壁粘液凝胶层厚度测定 将厚片置于倒置显微镜上，可见自粘膜表面至粘膜下滤纸层分为暗、明、暗3个分界明显的条带，分别为粘附溶液层、凝胶层、粘膜组织及滤纸层。当用墨汁对粘附溶液进行染色时，可见凝胶层不被染黑，3条带分界更清晰。用目镜测微尺测定中间明亮带厚度，即可得胃壁粘液凝胶层厚度。每只鼠胃壁粘膜切4～6张厚片，每张厚片每间隔500 μm测3～6次，每只鼠胃测定10～23次，取其平均值为鼠腺胃区粘液凝胶层厚度。
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1.4 统计学处理 测定结果以
±s表示2 结 果
10只大鼠腺胃区共测152次，粘液凝胶层厚度为(100±11.81) μm；粘液凝胶层在所有腺胃标本均呈连续性分布；鼠间平均厚度从(79.09±18.91) μm至(119±51.56) μm不等；所有大鼠中单次测定值范围较大(34～238 μm)，但多数测定值相对集中。
3 讨 论
文献报道裂隙灯结合厚度仪方法所测的粘液凝胶层平均厚度为166 μm，与本方法所测结果有一定差异，分析原因是由于前者在测定之前幽门经结扎1～2 h，刺激迷走神经兴奋，促进粘液分泌[1]，而且该方法难以明确区分粘液凝胶层与粘附的已溶解的粘液或溶液所致。锑微电极法是根据粘液凝胶层形成pH梯度的特性，用微操纵装置控制pH敏感锑微电极测定pH梯度时反映粘液凝胶层厚度，国外据此方法测得的平均厚度为(695±202) μm。因微电极可挤压粘液凝胶层，故所测值与一般文献报道差异颇大，难以反映真实状况，且当粘液层pH梯度破坏时，不能用该方法，故其实际使用价值不大。冰冻切片虽不经过固定、脱水、包埋等破坏粘液凝胶的步骤，但切片仍可破坏凝胶，故也难以反映真实的粘液凝胶层厚度值。超声波的方法不仅烦琐，而且因难以区分凝胶层上下界面，故所测值也欠准确[2]。 粘液凝胶层在暗视野显微镜或相差显微镜下，与粘膜层和表面粘附溶液层分界明显，使测定准确可行。本实验结果显示大鼠不同次测定值间差异很大，从34 μm到238 μm，这与文献报道相符，国外报道其范围从5 μm至400 μm不等，这可能反映了大鼠胃粘膜粘附凝胶的实际状态。有文献报道禁食大鼠胃粘膜仅50%的面积覆盖有粘液凝胶层，且不同部位凝胶层厚度差异显著，而在进食或其他生理或病理状态下，则胃粘膜表面粘液凝胶层的厚度与覆盖面积发生了明显的改变。因此要保证测定大鼠粘膜的粘附凝胶层厚度的准确性，必须增加测定次数和统一测定部位。 本方法具有取材简单，操作方便，直接测定，接近生理状况的优点。使用过程中要求标本在切片前处于生理盐水中，勿使之干燥，切片过程中勿使粘液凝胶层牵拉挤压变形，切片后宜在10 min内测定。
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【基金项目】军队医药卫生杰出中青年人才科研基金资助项目(1996卫科 训字95号)
【作者简介】湛先保(1972～)，男(汉族)，博士
【参考文献】
[1] Tanaka S,Tache Y,Kaneko H, et al. Central vagal activation increases mucus gel thickness and surface cell intracellular pH in rat stomach[J]. Gastroenterology, 1997,112(2):409-417.
[2] Sababi M, Nilsson E, Holm L.Mucus and alkali secretion in the rat duodenum:effects of indomethacin,N-omega-nitro-L-arginine, and luminal acid[J]. Gastroenterology, 1995,109(5):1526-1534.
【收稿日期】1999-10-11
【修回日期】2000-01-24
【本文编辑】 张寓景, 百拇医药