钙增敏剂MCI-154对内毒素休克大鼠左心室肌原纤维ATP酶活性的影响
作者：梅建民 胡德耀 陈惠孙 刘良明 肖南 刘建仓
单位：梅建民(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；胡德耀(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；陈惠孙(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘良明(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；肖南(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘建仓(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)
关键词：内毒素休克；心肌肌原纤维；钙增敏剂；MCI-154
第三军医大学学报000614 提 要： 目的 研究钙增敏剂MCI-154对内毒素休克大鼠左心室肌原纤维ATP酶活性的影响。方法 利用心室肌原纤维制备，测定其在不同钙浓度的激活液中的ATP酶活性。结果 内毒素休克组心肌肌原纤维在不同pCa(-log[Ca2+])溶液中的ATP酶活性及最大ATP酶活性均明显低于假休克组，ATP酶-pCa曲线向右移位约0.35个pCa单位，曲线的中位值pCa50(产生50%最大ATP酶活性所对应的pCa)明显降低。5×10-5 mol/L甲腈吡酮对上述异常无明显的纠正作用。内毒素休克大鼠心室肌原纤维经含1×10-5 mol/L的MCI-154的激活液处理后，各pCa点ATP酶活性及最大ATP酶活性均明显增加，显著高于内毒素休克组和甲腈吡酮组；ATP酶-pCa曲线向左移位约0.4个pCa单位，pCa50值增加，显著高于内毒素休克组和甲腈吡酮组值，与假休克组值无明显差别。结论 内毒素休克后，心肌肌原纤维活力下降，ATP酶活性降低；钙增敏剂MCI-154可通过增加心肌收缩蛋白对钙的敏感性而提高心肌肌原纤维活力，增加ATP酶活性。
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中图法分类号： R337;R631.4 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)06-0557-04
Effects of calcium sensitizer, MCI-154, on ATPase activity of left ventricular myofibrils in rats with endotoxic shock
MEI Jian-ming, HU De-yao, CHEN Hui-sun, LIU Liang-ming, XIAO Nan, LIU Jian-cang
(Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
, 百拇医药
Abstract: Objective To study the effects of a calcium sensitizer, MCI-154, on the adenosine triphosphatase (ATPase) activity of left ventricular myofibrils in rats with endotoxic shock. Methods After the preparation of ventricular fibrils, the ATPase activity in the activation solutions containing different concentrations of calcium ions [expressed as pCa(-log Ca2+)] was determined. Results The ATPase activity in all the concentrations of calcium and the highest ATPase activity were significantly higher in the endotoxic shock group than in the sham shock group. The relationship curve of ATPase activity and pCa units was shifted to the right by about 0.35 pCa unit. pCa50 (pCa required to produce 50% of highest ATPase activity) was significantly reduced. 5×10-5 mol/L milrinone failed to counteract the changes mentioned above. After the left ventricular myofibrils were treated with 1×10-5 mol/L of MCI-154, the ATPase activity in all kinds of pCa and the highest ATPase activity were significantly higher than those of the endotoxic shock group and milrinone-treated group and the ATPase activity-pCa units with relationship curve was shifted to the left by 0.4 pCa unit. pCa50 was significantly increased. Conclusion Calcium sensitizer, MCI-154, can reverse the endotoxin-induced damages and the ATPase activity of left ventricular myofibrils through increasing the sensitivity of their contractile protein to calcium.
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Key words: endotoxic shock; myofibril preparation/left ventricle; calcium sensitizer; rat
钙增敏剂MCI-154可增加正常心肌肌钙蛋白钙结合亚单位(TnC)与钙的亲和力[1，2]，TnC与钙结合越多，横桥(Cross bridge)形成就会增多，心肌三磷酸腺苷酶(Adenosinetriphosphatase,ATPase)活性亦相应增加。但目前尚不清楚钙增敏剂MCI-154用于内毒素休克机体时是否也能增加心肌ATPase活性。本实验利用肌原纤维制备，研究了钙增敏剂哒嗪酮(6-[4-(4′-pyridyl)aminophenyl]-4,5-dihydro-3(2H)-pyridazinone hydrochloride,MCI-154)对内毒素休克大鼠左心室肌原纤维ATPase活性的影响，旨在从生化角度探讨钙增敏剂MCI-154改善内毒素休克心功能的机制。
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1 材料与方法
1.1 动物模型及分组 Wistar大鼠32只，体重(200±15)g，雌雄不拘，实验前随机分为4组，分别为：a：假休克组(n=8)；b:内毒素休克组(n=8)；c:甲腈吡酮组(n=8)，内毒素休克大鼠心室肌肌原纤维经甲腈吡酮处理；d:MCI-154组(n=8)，内毒素休克大鼠心室肌原纤维经MCI-154处理。内毒素休克模型按本实验室常用方法完成，即10 mg/kg大肠杆菌内毒素(E.coli,O111∶B4，Sigma)腹腔内注射，8 h后进行实验，假休克组腹腔内注射同10 mg/kg内毒素等容量的生理盐水(NS)。
1.2 左心室肌原纤维的制备
参照Pagani和Solaro[3]的方法制备左心室肌原纤维，主要步骤包括反复匀浆、破膜及清除细胞内游离钙等过程。将肌原纤维置于悬浮液中，成份(mmol/L)：KCl 80，MgCl2 5，EGTA 10，imidazole 20,pH 7.0。以上操作均在4°C条件下进行。采用Lowry法定蛋白含量。
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1.3 左心室肌原纤维ATP酶活性的测定
将肌原纤维悬浮液分成7份，每份1ml，4°C条件下2000 g离心10 min，弃上清，然后分别加入激活液(含不同Ca2+浓度的悬浮液，Ca2+浓度以pCa,-log[Ca2+]表示)，各pCa点所需加入的CaCl2按Fabiato的计算程序[4](湖南医科大学心血管生理研究室提供)确定，使7份激活液中pCa分别为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0，c组每个pCa点均含5×10-5 mol/L的甲腈吡酮，d组每个pCa点均含1×10-5 mol/L的MCI-154。置于30°C恒温水浴中预温5 min后，加入1 mmol/L Na2ATP启动反应，10 min后，加入10%三氯醋酸中止反应，1 000 g离心10 min，取上清液，利用定磷法测定无机磷含量，酶活性单位以 μmol.Pi/mg.pr.hr表示。以pCa 4.0时的ATP酶活性为最大活性，算出其它pCa点酶的相对活性，然后以相对ATP酶活性为纵轴，pCa为横轴，按Hill方程：T=[Ca2+]n/(Kn+[Ca2+]n)进行回归，可得ATP酶-pCa曲线。方程中T为相对ATP酶活性，为不同pCa点的ATP酶活性与最大ATP酶活性的百分比，n为回归斜率，K为待求的Hill系数，为产生50%的最大ATP酶活性的Ca2+浓度，其负对数(-logK)即为pCa50值，pCa50是衡量TnC钙敏感性的定量指标[5]。
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1.4 数据处理及统计学分析
所有实验数据均以
±s表示，组间比较采用方差分析及t检验进行。
2 结果
2.1 ATP酶活性的变化
各组ATP酶活性变化见表1。b组和c组各pCa点上的值及最大ATP酶活性均明显低于a组(P<0.05、0.01)，两组间无明显差别(P>0.05)。d组各pCa点ATP酶活性及最大ATP酶活性均明显高于b、c组(P<0.05、0.01)，与a组无明显差别(P>0.05)。
表1 ATP酶活性的变化(μmol/mg.h)
Tab 1 Changes of ATPase activity(μmol/mg.h) Group
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pCa(calcium concentration,-log[Ca2+])
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
a
0.82±0.12
6.71±1.74
17.35±2.47
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36.15±3.46
45.34±5.68
51.39±5.90
52.60±4.76
b
0.68±0.09#
4.18±1.32# #
12.94±2.63# #
23.90±3.07# #
34.79±4.20#
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43.69±4.06#
44.61±6.53#
c
0.67±0.11#
4.36±1.46# #
12.67±2.72# #
24.75±3.23# #
35.20±3.89#
43.07±5.57#
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45.26±6.24#
d
0.91±0.15*
6.96±1.86* *
18.29±2.77* *
36.80±4.67* *
44.45±5.92*
50.04±5.67*
51.37±4.55*
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a:sham shock group; b:endotoxic shock group;c:milrinone group; d:MCI-154 group.
#：P<0.05,# #：P<0.01 vs a;*：P<0.05,* *：P<0.01 vs b and c
2.2 ATP酶-pCa曲线的变化
各组ATP酶-pCa曲线均呈S形，见图1。随激活液中Ca2+浓度的增加，相对ATP酶活性值升高，但b组pCa 7.0～4.5点上的相对ATP酶活性值上升的幅度明显小于a组(P<0.05、0.01)，曲线向右移位约0.35 pCa单位。c组ATP酶-pCa曲线与b组类似，pCa 7.0～4.5点上的值与b组无明显差别(P>0.05)，明显低于a组值(P<0.05、0.01)，曲线亦向右移位约0.32个pCa单位。d组pCa 7.0～4.5点上的相对ATP酶活性显著高于b、c组(P<0.05、0.01)，与a组无明显差别(P>0.05)，曲线向左移位约0.4 pCa单位。各组pCa50值分别为：5.807±0.118; b:5.458±0.094; c:5.482±0.078; d:5.816±0.131。b、c组pCa50值明显低于a组(P<0.05),d组pCa50值明显高于b、c组(P<0.05)，与a组无明显差别(P>0.05)。
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图1 ATP酶-pCa曲线的变化
Fig 1 Changes of ATPase-pCa curvesgroup a: sham shock group; group b:endotoxic shock group; group c: milrinone group; group d:MCI-154 group.#:P<0.05,# #：P<0.01 vs group a;*P<0.05,* *：P<0.01 vs group b and c
3 讨论
肌原纤维制备包括反复匀浆、破膜及清除细胞内游离钙等过程。因此，肌原纤维ATP酶活性反映的是溶液中的Ca2+与TnC结合后，引起TnC构型变化，触发横桥形成后肌动球蛋白的ATP酶活力。ATP酶活性增高，表明TnC与钙的亲和力增加，横桥形成的量增加，ATP酶再生率升高。肌原纤维制备比裸露心肌纤维的制备简单，测定药物对肌原纤维ATP酶活性的影响，可以检验该药物是否具有钙增敏效果，因而是研究药物钙增敏性的一种有效而易行的方法。
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本实验利用肌原纤维制备，测定了内毒素休克大鼠心肌肌原纤维在不同钙浓度下的ATP酶活性，并观察了钙增敏剂MCI-154对内毒素休克大鼠心肌肌原纤维ATP活性的影响，目的是想了解脓毒症/感染性休克后心肌ATP酶活性及心肌收缩蛋白对钙的敏感性是否降低，以及MCI-154对上述异常是否有一定的纠正作用。结果显示：内毒素休克后心肌肌原纤维ATP酶活性在各钙浓度点上的值均明显低于假休克组，其中最大ATP酶活性(pCa 4.0，饱和钙浓度)亦明显低于假休克组；ATP酶活性-pCa曲线向右移位，移位幅度约0.35 pCa单位，曲线的pCa50值下降。ATP酶特别是最大ATP酶活性降低，说明心肌肌原纤维的活力下降，钙激活引起的肌动蛋白、肌球蛋白相互作用形成的横桥量减少，ATP酶再生率降低。造成上述异常的可能原因如下：①肌球蛋白ATP酶受损。内毒素休克时，心脏冠脉低灌注或不均匀灌注[6]，心肌缺血缺氧，能量供应和利用障碍，心肌ATP酶受损。至于内毒素是否可直接损害心肌肌原纤维ATP酶，目前尚无此方面的文献报道。②心肌收缩蛋白对钙的敏感性降低。内毒素休克时，心肌细胞内酸中毒，H+与Ca2+竞争TnC钙结合位点，造成TnC对钙的亲和力降低[7]；另外，心肌缺血缺氧，肌酸激酶活性降低，激活肌酶激酶的底物ADP受限，横桥周围无机磷的积聚，一方面引起心肌收缩蛋白对钙的敏感性降低[7]，另一方面还可使横桥从强结合状态变为弱结合状态，导致钙激活引起的ATP酶活性降低[8]。本实验显示的ATP酶-pCa曲线右移及pCa50值降低，说明内毒素休克后出现了心肌收缩蛋白对钙敏感性降低。钙激活引起的TnC构型变化减弱，横桥产量降低。甲腈吡酮不能提高内毒素休克大鼠心肌肌原纤维在各钙浓度点上的ATP酶活性及最大ATP酶活性，不能纠正ATP酶-pCa曲线右移，pCa50值不增加。此结果提示传统强心药不能提高脓毒症/感染性休克心肌TnC与钙的亲和力，不能促进肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用。与甲腈吡酮不同，钙增敏剂MCI-154作用于内毒素休克心肌肌原纤维后，能提高各钙浓度点上的ATP酶活性，提高最大ATP酶活性，ATP酶-pCa曲线左移，移位幅度约0.4个pCa单位，曲线的pCa50值增加。这些实验结果表明MCI-154能提高内毒素休克心肌肌原纤维活力，提高TnC与钙的亲和力，促进肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用，增加横桥形成的量，增加ATP酶的再生率。内毒素休克大鼠心肌肌原纤维经MCI-154处理后，各钙浓度点的ATP酶活性及最大ATP酶活性能恢复到假休克组水平。说明心肌收缩蛋白对钙敏感性降低是造成内毒素休克后心肌肌原纤维ATP酶活性降低的主要原因。本实验结果同MCI-154作用于正常心肌的实验结果相符[9，10]，说明MCI-154用于脓毒症/感染性休克时亦能通过提高心肌收缩蛋白对钙的敏感性而增强心功能。
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本实验利用心肌肌原纤维制备，证明了内毒休克后，心肌肌原纤维存在因收缩蛋白对钙敏感性降低所致的ATP酶活性降低；MCI-154能提高心肌收缩蛋白对钙的敏感性，促进肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用而提高肌原纤维的活力，增加肌原纤维ATP酶活性。本实验表明钙增敏剂MCI-154比较适合于脓毒症/感染性休克心功能障碍的治疗，值得开展临床试验。
基金项目：全军“九五”攻关项目(96L041)
作者简介：梅建民(1966-)，男，湖北省麻城市人，博士，主治医师，现在北京军区总医院肝胆外科，主要从事休克的病理生理及防治方面的研究，发表论文17篇。电话：(010)66721629-8090
参考文献：
[1] Liao R, Gwathmey J K. Effects of MCI-154 and caffeine on Ca2+-regulated interactions between troponin subunits from bovine heart[J]. J Pharmacol Exp Ther,1994,270(2):831-839.
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[2] Sata M, Sugiura S, Yamashita H, et al. MCI-154 increases Ca2+ sensitivity of reconstituted thin filament: A study using a novel in vitro motility assay technique[J]. Circ Res,1995,76(4):626-633.
[3] Pagani E D, Solaro R J. Methods for measuring functional pro-perties of sarcoplasmic reticulum and myofibril in a small samples of myocardium[A]. In: Schwartx A ed. Methods in pharmacology[M]. New York：Plenum Publishing Corporation,1984.49-61.
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[4] Fabiato A, Fabiato F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned muscle cells[J]. J Physio(Paris),1979,75:463-505.
[5] 黄 焰，贺振翮，李云霞.大鼠皂素蜕膜心肌肌钙蛋白Ca2+敏感性的实验研究[J].中国应用生理学杂志，1996，12(7)：1-5.
[6] Hauptmann S, Klosterhalf B, Weiss J, et al. Morphology of cardiac muscle in septic shock: Observation with a porcine model[J]. Virchows Arch,1995,426(5):487-491.
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[7] Abe Y, Kitada Y, Narimatsu A. Effect of a calcium-sensitizing positive inotropic agent MCI-154 and its combined use with enalapril on postischemic contractile dysfunction of dog hearts[J]. J Cardiovasc Pharmacol,1995,26(4):653-659.
[8] Kitada Y. MCI-154, a cardiac Ca2+ sensitizer ,reverses the depression in Ca2+-activated force by inorganic phosphate and acidic pH in skinned guinea pig heart[J]. Cardiovasc Drugs Ther,1997,11(5):611-618.
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[9] Iwamoto H. Effect of a cardiotonic agent, MCI-154, on the contractile properties of skinned skeletal muscle fibers[J]. Eur J Pharmacol,1998,341(2～3):243-252.
[10] Abe Y, Ishis R, Onishi K, et al. Calcium sensitization in perfused beating guinea pig heart by a positive inotropic agent MCI-154[J]. J Pharmacol Exp Ther,1996,276(2):433-439.
收稿日期：1999-06-11；修回日期：2000-03-13, 百拇医药
单位：梅建民(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；胡德耀(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；陈惠孙(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘良明(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；肖南(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)；刘建仓(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆 400042)
关键词：内毒素休克；心肌肌原纤维；钙增敏剂；MCI-154
第三军医大学学报000614 提 要： 目的 研究钙增敏剂MCI-154对内毒素休克大鼠左心室肌原纤维ATP酶活性的影响。方法 利用心室肌原纤维制备，测定其在不同钙浓度的激活液中的ATP酶活性。结果 内毒素休克组心肌肌原纤维在不同pCa(-log[Ca2+])溶液中的ATP酶活性及最大ATP酶活性均明显低于假休克组，ATP酶-pCa曲线向右移位约0.35个pCa单位，曲线的中位值pCa50(产生50%最大ATP酶活性所对应的pCa)明显降低。5×10-5 mol/L甲腈吡酮对上述异常无明显的纠正作用。内毒素休克大鼠心室肌原纤维经含1×10-5 mol/L的MCI-154的激活液处理后，各pCa点ATP酶活性及最大ATP酶活性均明显增加，显著高于内毒素休克组和甲腈吡酮组；ATP酶-pCa曲线向左移位约0.4个pCa单位，pCa50值增加，显著高于内毒素休克组和甲腈吡酮组值，与假休克组值无明显差别。结论 内毒素休克后，心肌肌原纤维活力下降，ATP酶活性降低；钙增敏剂MCI-154可通过增加心肌收缩蛋白对钙的敏感性而提高心肌肌原纤维活力，增加ATP酶活性。
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中图法分类号： R337;R631.4 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)06-0557-04
Effects of calcium sensitizer, MCI-154, on ATPase activity of left ventricular myofibrils in rats with endotoxic shock
MEI Jian-ming, HU De-yao, CHEN Hui-sun, LIU Liang-ming, XIAO Nan, LIU Jian-cang
(Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
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Abstract: Objective To study the effects of a calcium sensitizer, MCI-154, on the adenosine triphosphatase (ATPase) activity of left ventricular myofibrils in rats with endotoxic shock. Methods After the preparation of ventricular fibrils, the ATPase activity in the activation solutions containing different concentrations of calcium ions [expressed as pCa(-log Ca2+)] was determined. Results The ATPase activity in all the concentrations of calcium and the highest ATPase activity were significantly higher in the endotoxic shock group than in the sham shock group. The relationship curve of ATPase activity and pCa units was shifted to the right by about 0.35 pCa unit. pCa50 (pCa required to produce 50% of highest ATPase activity) was significantly reduced. 5×10-5 mol/L milrinone failed to counteract the changes mentioned above. After the left ventricular myofibrils were treated with 1×10-5 mol/L of MCI-154, the ATPase activity in all kinds of pCa and the highest ATPase activity were significantly higher than those of the endotoxic shock group and milrinone-treated group and the ATPase activity-pCa units with relationship curve was shifted to the left by 0.4 pCa unit. pCa50 was significantly increased. Conclusion Calcium sensitizer, MCI-154, can reverse the endotoxin-induced damages and the ATPase activity of left ventricular myofibrils through increasing the sensitivity of their contractile protein to calcium.
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Key words: endotoxic shock; myofibril preparation/left ventricle; calcium sensitizer; rat
钙增敏剂MCI-154可增加正常心肌肌钙蛋白钙结合亚单位(TnC)与钙的亲和力[1，2]，TnC与钙结合越多，横桥(Cross bridge)形成就会增多，心肌三磷酸腺苷酶(Adenosinetriphosphatase,ATPase)活性亦相应增加。但目前尚不清楚钙增敏剂MCI-154用于内毒素休克机体时是否也能增加心肌ATPase活性。本实验利用肌原纤维制备，研究了钙增敏剂哒嗪酮(6-[4-(4′-pyridyl)aminophenyl]-4,5-dihydro-3(2H)-pyridazinone hydrochloride,MCI-154)对内毒素休克大鼠左心室肌原纤维ATPase活性的影响，旨在从生化角度探讨钙增敏剂MCI-154改善内毒素休克心功能的机制。
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1 材料与方法
1.1 动物模型及分组 Wistar大鼠32只，体重(200±15)g，雌雄不拘，实验前随机分为4组，分别为：a：假休克组(n=8)；b:内毒素休克组(n=8)；c:甲腈吡酮组(n=8)，内毒素休克大鼠心室肌肌原纤维经甲腈吡酮处理；d:MCI-154组(n=8)，内毒素休克大鼠心室肌原纤维经MCI-154处理。内毒素休克模型按本实验室常用方法完成，即10 mg/kg大肠杆菌内毒素(E.coli,O111∶B4，Sigma)腹腔内注射，8 h后进行实验，假休克组腹腔内注射同10 mg/kg内毒素等容量的生理盐水(NS)。
1.2 左心室肌原纤维的制备
参照Pagani和Solaro[3]的方法制备左心室肌原纤维，主要步骤包括反复匀浆、破膜及清除细胞内游离钙等过程。将肌原纤维置于悬浮液中，成份(mmol/L)：KCl 80，MgCl2 5，EGTA 10，imidazole 20,pH 7.0。以上操作均在4°C条件下进行。采用Lowry法定蛋白含量。
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1.3 左心室肌原纤维ATP酶活性的测定
将肌原纤维悬浮液分成7份，每份1ml，4°C条件下2000 g离心10 min，弃上清，然后分别加入激活液(含不同Ca2+浓度的悬浮液，Ca2+浓度以pCa,-log[Ca2+]表示)，各pCa点所需加入的CaCl2按Fabiato的计算程序[4](湖南医科大学心血管生理研究室提供)确定，使7份激活液中pCa分别为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0，c组每个pCa点均含5×10-5 mol/L的甲腈吡酮，d组每个pCa点均含1×10-5 mol/L的MCI-154。置于30°C恒温水浴中预温5 min后，加入1 mmol/L Na2ATP启动反应，10 min后，加入10%三氯醋酸中止反应，1 000 g离心10 min，取上清液，利用定磷法测定无机磷含量，酶活性单位以 μmol.Pi/mg.pr.hr表示。以pCa 4.0时的ATP酶活性为最大活性，算出其它pCa点酶的相对活性，然后以相对ATP酶活性为纵轴，pCa为横轴，按Hill方程：T=[Ca2+]n/(Kn+[Ca2+]n)进行回归，可得ATP酶-pCa曲线。方程中T为相对ATP酶活性，为不同pCa点的ATP酶活性与最大ATP酶活性的百分比，n为回归斜率，K为待求的Hill系数，为产生50%的最大ATP酶活性的Ca2+浓度，其负对数(-logK)即为pCa50值，pCa50是衡量TnC钙敏感性的定量指标[5]。
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1.4 数据处理及统计学分析
所有实验数据均以
±s表示，组间比较采用方差分析及t检验进行。2 结果
2.1 ATP酶活性的变化
各组ATP酶活性变化见表1。b组和c组各pCa点上的值及最大ATP酶活性均明显低于a组(P<0.05、0.01)，两组间无明显差别(P>0.05)。d组各pCa点ATP酶活性及最大ATP酶活性均明显高于b、c组(P<0.05、0.01)，与a组无明显差别(P>0.05)。
表1 ATP酶活性的变化(μmol/mg.h)
Tab 1 Changes of ATPase activity(μmol/mg.h) Group
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pCa(calcium concentration,-log[Ca2+])
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
a
0.82±0.12
6.71±1.74
17.35±2.47
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36.15±3.46
45.34±5.68
51.39±5.90
52.60±4.76
b
0.68±0.09#
4.18±1.32# #
12.94±2.63# #
23.90±3.07# #
34.79±4.20#
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43.69±4.06#
44.61±6.53#
c
0.67±0.11#
4.36±1.46# #
12.67±2.72# #
24.75±3.23# #
35.20±3.89#
43.07±5.57#
, http://www.100md.com
45.26±6.24#
d
0.91±0.15*
6.96±1.86* *
18.29±2.77* *
36.80±4.67* *
44.45±5.92*
50.04±5.67*
51.37±4.55*
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a:sham shock group; b:endotoxic shock group;c:milrinone group; d:MCI-154 group.
#：P<0.05,# #：P<0.01 vs a;*：P<0.05,* *：P<0.01 vs b and c
2.2 ATP酶-pCa曲线的变化
各组ATP酶-pCa曲线均呈S形，见图1。随激活液中Ca2+浓度的增加，相对ATP酶活性值升高，但b组pCa 7.0～4.5点上的相对ATP酶活性值上升的幅度明显小于a组(P<0.05、0.01)，曲线向右移位约0.35 pCa单位。c组ATP酶-pCa曲线与b组类似，pCa 7.0～4.5点上的值与b组无明显差别(P>0.05)，明显低于a组值(P<0.05、0.01)，曲线亦向右移位约0.32个pCa单位。d组pCa 7.0～4.5点上的相对ATP酶活性显著高于b、c组(P<0.05、0.01)，与a组无明显差别(P>0.05)，曲线向左移位约0.4 pCa单位。各组pCa50值分别为：5.807±0.118; b:5.458±0.094; c:5.482±0.078; d:5.816±0.131。b、c组pCa50值明显低于a组(P<0.05),d组pCa50值明显高于b、c组(P<0.05)，与a组无明显差别(P>0.05)。
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图1 ATP酶-pCa曲线的变化
Fig 1 Changes of ATPase-pCa curvesgroup a: sham shock group; group b:endotoxic shock group; group c: milrinone group; group d:MCI-154 group.#:P<0.05,# #：P<0.01 vs group a;*P<0.05,* *：P<0.01 vs group b and c
3 讨论
肌原纤维制备包括反复匀浆、破膜及清除细胞内游离钙等过程。因此，肌原纤维ATP酶活性反映的是溶液中的Ca2+与TnC结合后，引起TnC构型变化，触发横桥形成后肌动球蛋白的ATP酶活力。ATP酶活性增高，表明TnC与钙的亲和力增加，横桥形成的量增加，ATP酶再生率升高。肌原纤维制备比裸露心肌纤维的制备简单，测定药物对肌原纤维ATP酶活性的影响，可以检验该药物是否具有钙增敏效果，因而是研究药物钙增敏性的一种有效而易行的方法。
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本实验利用肌原纤维制备，测定了内毒素休克大鼠心肌肌原纤维在不同钙浓度下的ATP酶活性，并观察了钙增敏剂MCI-154对内毒素休克大鼠心肌肌原纤维ATP活性的影响，目的是想了解脓毒症/感染性休克后心肌ATP酶活性及心肌收缩蛋白对钙的敏感性是否降低，以及MCI-154对上述异常是否有一定的纠正作用。结果显示：内毒素休克后心肌肌原纤维ATP酶活性在各钙浓度点上的值均明显低于假休克组，其中最大ATP酶活性(pCa 4.0，饱和钙浓度)亦明显低于假休克组；ATP酶活性-pCa曲线向右移位，移位幅度约0.35 pCa单位，曲线的pCa50值下降。ATP酶特别是最大ATP酶活性降低，说明心肌肌原纤维的活力下降，钙激活引起的肌动蛋白、肌球蛋白相互作用形成的横桥量减少，ATP酶再生率降低。造成上述异常的可能原因如下：①肌球蛋白ATP酶受损。内毒素休克时，心脏冠脉低灌注或不均匀灌注[6]，心肌缺血缺氧，能量供应和利用障碍，心肌ATP酶受损。至于内毒素是否可直接损害心肌肌原纤维ATP酶，目前尚无此方面的文献报道。②心肌收缩蛋白对钙的敏感性降低。内毒素休克时，心肌细胞内酸中毒，H+与Ca2+竞争TnC钙结合位点，造成TnC对钙的亲和力降低[7]；另外，心肌缺血缺氧，肌酸激酶活性降低，激活肌酶激酶的底物ADP受限，横桥周围无机磷的积聚，一方面引起心肌收缩蛋白对钙的敏感性降低[7]，另一方面还可使横桥从强结合状态变为弱结合状态，导致钙激活引起的ATP酶活性降低[8]。本实验显示的ATP酶-pCa曲线右移及pCa50值降低，说明内毒素休克后出现了心肌收缩蛋白对钙敏感性降低。钙激活引起的TnC构型变化减弱，横桥产量降低。甲腈吡酮不能提高内毒素休克大鼠心肌肌原纤维在各钙浓度点上的ATP酶活性及最大ATP酶活性，不能纠正ATP酶-pCa曲线右移，pCa50值不增加。此结果提示传统强心药不能提高脓毒症/感染性休克心肌TnC与钙的亲和力，不能促进肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用。与甲腈吡酮不同，钙增敏剂MCI-154作用于内毒素休克心肌肌原纤维后，能提高各钙浓度点上的ATP酶活性，提高最大ATP酶活性，ATP酶-pCa曲线左移，移位幅度约0.4个pCa单位，曲线的pCa50值增加。这些实验结果表明MCI-154能提高内毒素休克心肌肌原纤维活力，提高TnC与钙的亲和力，促进肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用，增加横桥形成的量，增加ATP酶的再生率。内毒素休克大鼠心肌肌原纤维经MCI-154处理后，各钙浓度点的ATP酶活性及最大ATP酶活性能恢复到假休克组水平。说明心肌收缩蛋白对钙敏感性降低是造成内毒素休克后心肌肌原纤维ATP酶活性降低的主要原因。本实验结果同MCI-154作用于正常心肌的实验结果相符[9，10]，说明MCI-154用于脓毒症/感染性休克时亦能通过提高心肌收缩蛋白对钙的敏感性而增强心功能。
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本实验利用心肌肌原纤维制备，证明了内毒休克后，心肌肌原纤维存在因收缩蛋白对钙敏感性降低所致的ATP酶活性降低；MCI-154能提高心肌收缩蛋白对钙的敏感性，促进肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用而提高肌原纤维的活力，增加肌原纤维ATP酶活性。本实验表明钙增敏剂MCI-154比较适合于脓毒症/感染性休克心功能障碍的治疗，值得开展临床试验。
基金项目：全军“九五”攻关项目(96L041)
作者简介：梅建民(1966-)，男，湖北省麻城市人，博士，主治医师，现在北京军区总医院肝胆外科，主要从事休克的病理生理及防治方面的研究，发表论文17篇。电话：(010)66721629-8090
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收稿日期：1999-06-11；修回日期：2000-03-13, 百拇医药