地高辛素标记探针原位杂交法检测肝及肝外组织中的TTV DNA
作者：罗朝霞 郎振为 阎慧平 黄德庄 金荣华 贺丽香 赵秀英 周育森 王海涛
单位：罗朝霞(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；郎振为(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；阎慧平(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；黄德庄(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；金荣华(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；贺丽香(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；赵秀英(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；周育森(军事医学科学院微生物流行病研究所)；王海涛(军事医学科学院微生物流行病研究所)；
关键词：
中华医学杂志000611 1997年底，日本学者报道了一种与肝功能异常有关的新型病毒，并将之命名为输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)[1]。为了解我国病因不明患者肝及肝外组织中TTV感染状况，我们采用原位杂交的方法进行了检测，现报道如下。
, 百拇医药
一、对象与方法
1.标本来源: 选自北京佑安医院1996～1999年经血清学方法及肝组织的免疫组织化学法检测，排除了甲～庚型肝炎病毒感染的27例患者的肝穿组织。患者年龄20～68岁，男19例,女8例，均无饮酒史、自身免疫疾病及药物史。另又选取8例1990～1997年收集的非甲～庚的慢性肝病死亡病例尸检肝、肾、脾、胰、心肌及睾丸组织。每例组织经甲醛固定，石蜡包埋，5.0 μm厚连续切片于预涂有多聚赖氨酸的载玻片备检。
2.试剂及来源：地高辛试剂盒购自德国宝灵曼(Boehringer Mannheim)公司；免疫组织化学试剂盒购自北京中山生物公司；提取血清核酸试剂盒购自美国Promege公司；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，抗丙型肝炎病毒(HCV)试剂盒购自美国Abbott公司；杂交缓冲液等由本室制备。
3.TTV探针制备：以含有TTV基因序列的质粒为模板(质粒为军事医学科学院提供)引物为 P1：5′-CCAGGAGCATATACAGAC-3′；P2：5′-TGTACTTCTTGCTGGTGA-AAT-3′；由北京赛百盛生物工程公司合成。按参考文献[2]方法用聚合酶链反应(PCR)方法进行地高辛掺入标记(1 mmol dCTP，1 mmol dGTP，1 mmol dATP，O.65 mmol dTTP，0.35 mmol dUTP)，用PCR方法标记的TTV探针, 扩增产物为单一的特异性条带，通过电泳分离回收得到纯度较好的探针,标准DNA定量后约为100 ng/μl;对该探针进行不同浓度的预试验,使用1∶100的工作效价杂交较好。
, 百拇医药
4.原位杂交操作步骤：(1)多聚赖氨酸涂片制备的石蜡组织切片于60℃烘干3～5 h；(2)常规脱蜡，蛋白酶K(30 μg/ml)37℃消化15 min；(3)质量分数为0.04多聚甲醛固定；乙醇逐级脱水，预杂交10 min；(4)探针与预杂交液混匀
滴加5～10 μl/片，迅速加盖硅化盖玻片；(5)于湿盒内95℃变性10 min，移至水浴箱内68℃杂交16～20 h；(6)梯度标准枸橼酸盐水(SSC)洗片 ，羊血清/牛血清白蛋白(BSA)封闭；(7)加抗-Dig-Ap，37℃亲和1 h；(8)5-溴-4，3吲哚磷酸/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)避光显色,光镜下观察；待显色适度时(约1～2 h)终止，甘油明胶封片；同时以预杂交液及四氰基乙烯(TE)代替TTV探针为阴性对照,进行特异性验证。
二、结果
1.活检肝组织中TTV-DNA的原位杂交检测结果：细胞核或浆中出现紫蓝色的致密颗粒为阳性信号。检测27例活检肝组织中11例可见肝细胞核内有阳性信号，阳性细胞在肝小叶内呈散在弥散分布(图1)，慢性肝炎以汇管区较为密集。观察HE组织学切片，部分有一定程度病理改变。设置阴性对照对探针进行特异性确证，均无阳性结果，表明Dig-TTV DNA探针反应良好。
, 百拇医药
2.尸解肝及肝外组织中TTV的检出：另选取8例非甲～庚的慢性肝病死亡病例尸解的肝、心、肾、脾、胰、睾丸组织切片,检测结果：5例肝组织阳性，其中3例的肾、胰，2例心、脾与睾丸组织同时阳性；心肌、脾脏实质细胞、睾丸生精细胞都有阳性杂交信号(图2,3)。胰腺组织主要定位于胰腺腺泡细胞，多为核型表现，其中1例胞浆中有阳性信号(图4)；肾脏组织阳性信号在肾小球实质及间质细胞及肾小管上皮细胞内均可见阳性杂交信号(图5)；各阳性组织中，以肝组织中的阳性细胞分布较为广泛,信号较强。而肝外组织信号相对较弱，阳性细胞呈不规则分布。
三、讨论
除甲、乙、丙、丁及戊型肝炎等5种肝炎病毒感染外，约有10%～20%的病毒性肝炎患者病因不明。1997年日本学者Nishizawa等[1]利用差异显示分析技术，从1例输血后肝炎患者体内分离出一种新的病毒基因组,命名为TTV,认为该病毒与输血后肝炎的发生有关。
, 百拇医药
大量资料显示人群中普遍存在TV感染，急慢性原因不明肝炎患者中也能检测到该病毒。日本Okamoto等[3]的研究表明，在非甲～非戊暴发性肝炎中，47%为TTV阳性；非甲～非戊慢性肝病中TTV阳性率为46%；我国研究表明非甲-非庚肝炎患者中，TTV阳性率为43%[4]。我们采用原位杂交技术检测的27例非甲～非庚肝炎患者肝组织11例(47%)TTV DNA阳性，表明非甲～非庚肝炎原因不明的患者中存在TTV的感染。
图1 TTV DNA定位于肝细胞核中，呈蓝紫色信号 ISH×200
图2 脾脏单个核细胞TTV DNA呈阳性表达 ISH×200
, 百拇医药
图3 睾丸组织生精细胞胞浆、胞核都有阳性杂交信号 ISH×200
图4 胰腺组织腺泡细胞核内检出TTV DNA阳性信号 ISH×200
图5 肾脏组织肾小球及肾小管均可见TTV DNA阳性信号 ISH×200
关于TTV的致病性尚无定论，本研究观察肝组织原位杂交阳性信号在肝小叶内呈散在弥散分布，慢性肝炎以汇管区较为密集。同时观察HE组织学切片，有一定程度的病理改变。研究肝和肝外组织，发现TTV DNA在肝组织中检出率最高，并且信号较强, 阳性细胞分布广泛，提示TTV是一种嗜肝病毒。
一个值得注意的现象是：最初人们认为肝炎病毒是特异性嗜肝的，并因此将HBV所代表的病毒属种称为嗜肝病毒科。但随着研究的不断深入，人们发现这些病毒如乙型肝炎病毒(HBV)、HCV，在肝外组织，如外周血单个核细胞、唾液腺、肾脏、心肌、胰腺、骨髓、淋巴结等脏器组织均能检测到[5，6]。为研究TTV在肝外组织的分布,我们以保守区段设计引物，标记地高辛探针，选出8例非甲～非庚型慢性肝病死亡的病例肝外组织(心、肾、脾、胰、睾丸)切片, 通过原位杂交技术在这些组织中也检测到TT病毒核酸，表明TTV也具有泛嗜性。TTV在人群中如此高的检出率，除血源途径外，可能尚有其它传播途径，而TTV对一些特殊部位的亲嗜性，如在睾丸中检出TTV，并发现TTV存在于各级生精细胞中，这一结果提示TTV可经垂直传播及性传播的可能。因本实验属探索性研究，TTV的泛嗜性及其意义还需积累更多的资料。
, http://www.100md.com
TTV是一种新发现的病毒，目前对TTV的研究大多局限于血清PCR，由于PCR方法的局限性，故不能全面了解TTV的临床及病理学特征。本研究采用地高辛标记的特异性探针直接检测肝及肝外组织TTV DNA，该方法不破坏组织结构，可直接观察到病毒在组织中的亲嗜细胞及感染范围，直接反应病毒存在，为探索TTV的组织学嗜性、致病性、复制部位提供了良好的手段。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900133)；北京市自然科学基金资助项目(7992023)
参考文献
1，Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K， et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase level in posttransfusion hepatitis of unkown etiology .Biochem Biophs Res Commun ,1997，24:92-97.
, 百拇医药
2，黄德庄，闫惠平，郎振为，等.地高辛标记探针原位杂交法检测肝组织中丙型肝炎病毒RNA.中华实验与病毒杂志，1996，10:262-266.
3，Okamoto H, Nishizawa T, Kayto N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus ( TTV ) associated with posttransfusion hepatitis of unkown etiology. Hepatol Res， 1998，10：1-16.
4，周育森，董京芳，周乙华，等. 中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学.中华预防医学杂志,1998，32:352-353.
5，Mason A, Markn W,White H ,et al. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology, 1993,18:781-789.
6，Sugiyama K,Kato W,Zkeda M, et al. Hepatitis C virus in pelvic lymph nodes and emale reproductive organs. Jpn J Cancer Res，1997，88:925-927.
(收稿日期；1999-09-23), 百拇医药
单位：罗朝霞(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；郎振为(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；阎慧平(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；黄德庄(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；金荣华(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；贺丽香(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；赵秀英(北京市卫生局肝炎研究所 100054)；周育森(军事医学科学院微生物流行病研究所)；王海涛(军事医学科学院微生物流行病研究所)；
关键词：
中华医学杂志000611 1997年底，日本学者报道了一种与肝功能异常有关的新型病毒，并将之命名为输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)[1]。为了解我国病因不明患者肝及肝外组织中TTV感染状况，我们采用原位杂交的方法进行了检测，现报道如下。
, 百拇医药
一、对象与方法
1.标本来源: 选自北京佑安医院1996～1999年经血清学方法及肝组织的免疫组织化学法检测，排除了甲～庚型肝炎病毒感染的27例患者的肝穿组织。患者年龄20～68岁，男19例,女8例，均无饮酒史、自身免疫疾病及药物史。另又选取8例1990～1997年收集的非甲～庚的慢性肝病死亡病例尸检肝、肾、脾、胰、心肌及睾丸组织。每例组织经甲醛固定，石蜡包埋，5.0 μm厚连续切片于预涂有多聚赖氨酸的载玻片备检。
2.试剂及来源：地高辛试剂盒购自德国宝灵曼(Boehringer Mannheim)公司；免疫组织化学试剂盒购自北京中山生物公司；提取血清核酸试剂盒购自美国Promege公司；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，抗丙型肝炎病毒(HCV)试剂盒购自美国Abbott公司；杂交缓冲液等由本室制备。
3.TTV探针制备：以含有TTV基因序列的质粒为模板(质粒为军事医学科学院提供)引物为 P1：5′-CCAGGAGCATATACAGAC-3′；P2：5′-TGTACTTCTTGCTGGTGA-AAT-3′；由北京赛百盛生物工程公司合成。按参考文献[2]方法用聚合酶链反应(PCR)方法进行地高辛掺入标记(1 mmol dCTP，1 mmol dGTP，1 mmol dATP，O.65 mmol dTTP，0.35 mmol dUTP)，用PCR方法标记的TTV探针, 扩增产物为单一的特异性条带，通过电泳分离回收得到纯度较好的探针,标准DNA定量后约为100 ng/μl;对该探针进行不同浓度的预试验,使用1∶100的工作效价杂交较好。
, 百拇医药
4.原位杂交操作步骤：(1)多聚赖氨酸涂片制备的石蜡组织切片于60℃烘干3～5 h；(2)常规脱蜡，蛋白酶K(30 μg/ml)37℃消化15 min；(3)质量分数为0.04多聚甲醛固定；乙醇逐级脱水，预杂交10 min；(4)探针与预杂交液混匀
滴加5～10 μl/片，迅速加盖硅化盖玻片；(5)于湿盒内95℃变性10 min，移至水浴箱内68℃杂交16～20 h；(6)梯度标准枸橼酸盐水(SSC)洗片 ，羊血清/牛血清白蛋白(BSA)封闭；(7)加抗-Dig-Ap，37℃亲和1 h；(8)5-溴-4，3吲哚磷酸/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)避光显色,光镜下观察；待显色适度时(约1～2 h)终止，甘油明胶封片；同时以预杂交液及四氰基乙烯(TE)代替TTV探针为阴性对照,进行特异性验证。
二、结果
1.活检肝组织中TTV-DNA的原位杂交检测结果：细胞核或浆中出现紫蓝色的致密颗粒为阳性信号。检测27例活检肝组织中11例可见肝细胞核内有阳性信号，阳性细胞在肝小叶内呈散在弥散分布(图1)，慢性肝炎以汇管区较为密集。观察HE组织学切片，部分有一定程度病理改变。设置阴性对照对探针进行特异性确证，均无阳性结果，表明Dig-TTV DNA探针反应良好。
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2.尸解肝及肝外组织中TTV的检出：另选取8例非甲～庚的慢性肝病死亡病例尸解的肝、心、肾、脾、胰、睾丸组织切片,检测结果：5例肝组织阳性，其中3例的肾、胰，2例心、脾与睾丸组织同时阳性；心肌、脾脏实质细胞、睾丸生精细胞都有阳性杂交信号(图2,3)。胰腺组织主要定位于胰腺腺泡细胞，多为核型表现，其中1例胞浆中有阳性信号(图4)；肾脏组织阳性信号在肾小球实质及间质细胞及肾小管上皮细胞内均可见阳性杂交信号(图5)；各阳性组织中，以肝组织中的阳性细胞分布较为广泛,信号较强。而肝外组织信号相对较弱，阳性细胞呈不规则分布。
三、讨论
除甲、乙、丙、丁及戊型肝炎等5种肝炎病毒感染外，约有10%～20%的病毒性肝炎患者病因不明。1997年日本学者Nishizawa等[1]利用差异显示分析技术，从1例输血后肝炎患者体内分离出一种新的病毒基因组,命名为TTV,认为该病毒与输血后肝炎的发生有关。
, 百拇医药
大量资料显示人群中普遍存在TV感染，急慢性原因不明肝炎患者中也能检测到该病毒。日本Okamoto等[3]的研究表明，在非甲～非戊暴发性肝炎中，47%为TTV阳性；非甲～非戊慢性肝病中TTV阳性率为46%；我国研究表明非甲-非庚肝炎患者中，TTV阳性率为43%[4]。我们采用原位杂交技术检测的27例非甲～非庚肝炎患者肝组织11例(47%)TTV DNA阳性，表明非甲～非庚肝炎原因不明的患者中存在TTV的感染。
图1 TTV DNA定位于肝细胞核中，呈蓝紫色信号 ISH×200
图2 脾脏单个核细胞TTV DNA呈阳性表达 ISH×200
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图3 睾丸组织生精细胞胞浆、胞核都有阳性杂交信号 ISH×200
图4 胰腺组织腺泡细胞核内检出TTV DNA阳性信号 ISH×200
图5 肾脏组织肾小球及肾小管均可见TTV DNA阳性信号 ISH×200
关于TTV的致病性尚无定论，本研究观察肝组织原位杂交阳性信号在肝小叶内呈散在弥散分布，慢性肝炎以汇管区较为密集。同时观察HE组织学切片，有一定程度的病理改变。研究肝和肝外组织，发现TTV DNA在肝组织中检出率最高，并且信号较强, 阳性细胞分布广泛，提示TTV是一种嗜肝病毒。
一个值得注意的现象是：最初人们认为肝炎病毒是特异性嗜肝的，并因此将HBV所代表的病毒属种称为嗜肝病毒科。但随着研究的不断深入，人们发现这些病毒如乙型肝炎病毒(HBV)、HCV，在肝外组织，如外周血单个核细胞、唾液腺、肾脏、心肌、胰腺、骨髓、淋巴结等脏器组织均能检测到[5，6]。为研究TTV在肝外组织的分布,我们以保守区段设计引物，标记地高辛探针，选出8例非甲～非庚型慢性肝病死亡的病例肝外组织(心、肾、脾、胰、睾丸)切片, 通过原位杂交技术在这些组织中也检测到TT病毒核酸，表明TTV也具有泛嗜性。TTV在人群中如此高的检出率，除血源途径外，可能尚有其它传播途径，而TTV对一些特殊部位的亲嗜性，如在睾丸中检出TTV，并发现TTV存在于各级生精细胞中，这一结果提示TTV可经垂直传播及性传播的可能。因本实验属探索性研究，TTV的泛嗜性及其意义还需积累更多的资料。
, http://www.100md.com
TTV是一种新发现的病毒，目前对TTV的研究大多局限于血清PCR，由于PCR方法的局限性，故不能全面了解TTV的临床及病理学特征。本研究采用地高辛标记的特异性探针直接检测肝及肝外组织TTV DNA，该方法不破坏组织结构，可直接观察到病毒在组织中的亲嗜细胞及感染范围，直接反应病毒存在，为探索TTV的组织学嗜性、致病性、复制部位提供了良好的手段。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900133)；北京市自然科学基金资助项目(7992023)
参考文献
1，Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K， et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase level in posttransfusion hepatitis of unkown etiology .Biochem Biophs Res Commun ,1997，24:92-97.
, 百拇医药
2，黄德庄，闫惠平，郎振为，等.地高辛标记探针原位杂交法检测肝组织中丙型肝炎病毒RNA.中华实验与病毒杂志，1996，10:262-266.
3，Okamoto H, Nishizawa T, Kayto N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus ( TTV ) associated with posttransfusion hepatitis of unkown etiology. Hepatol Res， 1998，10：1-16.
4，周育森，董京芳，周乙华，等. 中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学.中华预防医学杂志,1998，32:352-353.
5，Mason A, Markn W,White H ,et al. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology, 1993,18:781-789.
6，Sugiyama K,Kato W,Zkeda M, et al. Hepatitis C virus in pelvic lymph nodes and emale reproductive organs. Jpn J Cancer Res，1997，88:925-927.
(收稿日期；1999-09-23), 百拇医药