Flt3基因在白血病中的表达及临床意义
作者：李东 顾庆礼 朱琬莹 姚利 曾皓明
单位：李东 曾皓明(南京江北人民医院血液科，江苏南京210048)；顾庆礼 朱琬莹 姚利(苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所，江苏苏州215006)
关键词：Flt3基因；白血病；基因表达；逆转录-聚合酶链反应
癌症000624
【摘要】目的：研究Flt3基因在不同类型、亚型白血病中mRNA表达、分布情况，以期阐明Flt3基因表达与疾病发生、发展的关系，探索Flt3基因作为白血病转归及预后指标的意义。方法：应用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法分离出外周血中原始细胞，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，检测Flt3基因在109例恶性血液病患者外周血中表达。结果：初治AML(急性髓细胞性白血病)中Flt3基因mRNA表达为91.4%;ALL(急性淋巴细胞性白血病)中表达率亦较高，为82.3%；在急性白血病的CR(完全缓解)病例中原Flt3阳性表达可转为阴性；而NR(未缓解)的患者则持续为阳性表达。CML(慢性髓细胞性白血病)中阳性表达为33.9%，仅见于急变期及加速期，在慢性阶段则无表达。6例CLL(慢性淋巴细胞性白血病)中的4例、4例MDS(骨髓增生异常综合征)中的2例表达Flt3。结论:Flt3基因有望在白血病诊治过程中成为标志性基因。
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中图分类号：R733 文献标识码：A
文章编号：10000-467X(2000)06-0589-05
Study on the expression of Flt3 gene in human
leukemias and its clinical significance
LI Dong
Department of Hematology,Nanjing Jiangbei People's Hospital， Nanjing 210048， P.R. China
GU Qing- li， ZHU Wan- ying， et al.
, 百拇医药
Jiangsu Institute of Hematology, the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006, P.R. China
【 Abstract】 Objectives: To investigate the expression of Flt3 gene in leukemia and indicate the relation between the expression of Flt3 gene and the occurrence or the development of the disease. Methods: The separation method of the Percoll discontinuous density gradient was applied to isolate the blast cells in peripheral blood. RT- PCR was used to detect the mRNA expressions of Flt3 in blast cells of peripheral blood from 109 malignant patients. Results: The high level of the Flt3 mRNA in primary AML blasts from 35 patients peripheral blood was 91.4% with no apparent predominance of any of the M1～ M6 subtypes, Flt3 mRNA in ALL also was found at high level in 82.4 % . When the patients were in complete remission(CR), their expression could be changed from positive to negative. But the positive rates was continual if the leukemia cases were non-remission (NR). The positive rate in CML sample was 33.9% which was attained merely to accelerated phase and blast crisis,whereas it was not found in chronic phase. Flt3 mRNA was detected in 4/6 cases of CLL and 2/4 cases of MDS. Conclusion:Flt3 gene will hopefully become a symbolic gene during the course of diagnosis and treatment in leukemias.
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Key words:Flt3 gene; Leukemia; Gene expression; RT-PCR
Flt3基因是近年发现的早期造血生长因子受体基因,其与KL(干细胞生长因子)的受体C-kit、CSF-1(巨噬细胞集落刺激因子)的受体c-fms同属于第三族酪氨酸激酶基因家族成员，调控早期造血，其中Flt3正常表达时期较后两者更早。已有报道c-kit和c-fms在白血病中有表达[1,2]。有关Flt3在白血病中的表达研究目前国内尚未见类似报道，为检测Flt3基因在中国人白血病不同类型、亚型白血病表达、分布情况。本文通过采用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法直接分离出外周血中原始细胞，运用RT-PCR检测方法，检测了Flt3mRNA在109例恶性血液病病人的外周血中的表达，旨在研究在白血病中Flt3基因的表达、分布与疾病发生、发展的关系；探索Flt3基因作为白血病转归及预后指标的意义，在白血病的诊治中提出一种新的检测和评估方法。
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1 材料和方法
1.1 临床病例和白血病细胞株
恶性血液病患者109例，其中AML(M1～M6)35例，ALL17例，CML47例，CLL6例，MDS4例；男58例，女51例；中位年龄37.5岁。并对6例急性白血病病人短期随访。对照组的外周血样本23例，包括献血员10例、非恶性血液病病人13例[ITP(特发性血小板减少性紫癜)7例、IDA(缺铁性贫血)5例、AA(再生障碍性贫血)1例]，以及5株白血病细胞株：原粒白血病细胞株KG-1，早幼粒白血病细胞株NB4，急性髓性白血病细胞株HL-60，慢性粒细胞白血病细胞株K562，淋巴性细胞株U937，以用作阴性及阳性对照。(由苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所白血病研究室提供)。
|1.2试剂
1.2.1细胞分离液Percoll(Pharmacia公司)，DextranT-500(Pharmacia公司)，SIP(贮存液)：9份Percoll加1份1.5mol/LNaCl作为贮存液。60%(V/V)SIP：用pH7.4去Ca2+、Mg2+之Dulbecco缓冲液稀释[SIP∶缓冲液(V/V)=6∶4]；50%(V/V)SIP∶用pH7.4去Ca2+、Mg2+之Dulbecco缓冲液稀释[SIP∶缓冲液(V/V)=5∶5]；1.5%DextranT-500∶DextranT-5001.5g溶于pH7.4去Ca2+、Mg2+之Dulbecco缓冲液100ml，置冰箱待用。
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1.2.2RNA制备试剂：溶液D(4mol/L异硫氰酸胍，25mol/L柠檬酸钠(pH7.0)，十二烷基肌氨酸钠,β-巯基乙醇)，醋酸钠，水饱和酚，氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇，DEPC(Gibco-BRL)。
1.2.3RPMI-1640培养基：按供应商(Gibco-BRL)推荐的方法配制，加入终浓度为10%的新生小牛血清(NCS，上海实生公司)，经0.22μm滤膜过滤。
1.2.4逆转录反应试剂：六随机引物(Sangon)及RNA酶抑制剂(上海华美)AMV逆转录酶(Promega)，5×合成第一链缓冲液(Promega)，10mmol/LdNTPs(上海生工公司)。
1.2.5PCR反应试剂：10×PCR缓冲液，25mmol/LMgCl2,TaqDNA聚合酶(Sangon)。
1.2.6标准分子量：PBR322DNABsuRI(HaeⅢ)，MBI公司(Fermentas)。
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1.2.7Flt3、β-actin、abl基因引物由上海生工公司合成。
Flt3(366bp)
R5：5’-TGTCGAGCAGTACTCTAAACA-3’(nt1487～1507)
R6：5’-ATCCTAGTACCTTCCCAAAACTC-3’(nt1831～1852)
β-actin(210bp)sense：5’-CTTCCTGGGCATGGAGAC-3’
antisense：5’-CGCTCAGGGAGGAGCAATGAT-3’
abl(185bp)sense：5’-TTCAGCGGCCAGCATCTGACTT-3’
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antisense：5’-GACCCGGAGCTTTTCACCTTTAGTT-3’
1.3实验方法
1.3.1细胞分离：采用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法[3，4]，分离出外周血中的单核细胞、淋巴细胞、粒细胞。将分得的单核、淋巴和粒细胞用pH7.4去Ca2+、Mg2+之Dulbecco缓冲液洗2～3次，除去残余的Percoll，计数，涂片，分类。
1.3.2RNA制备:采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA[5]。抽提的RNA用DEPC-H2O溶解,实验选用样本为经紫外分光光度计测定其RNA溶液A260/A280>1.8，且经RNA酶消化后在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察未发现有RNA及其它条带存在。-20℃保存备用。
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1.3.3逆转录反应：标本总RNA2μg，六随机引物100ng，加DEPC处理水至20μl，72℃变性5分钟，另加5×合成第一链缓冲液8μl，10mmol/LdNTP1μl，RNA酶抑制剂RNasin50U，10mmAMV10U，总逆转录体系40μl，37℃反应60min，4℃保存。
1.3.4PCR反应：(按BoehringerMannheim厂商试剂盒方法稍加修改)反应体系50μl，取cDNA10μl，分别加入40pmol引物R5和R6，及β-actin的sense链和antisense链引物,10×PCRbuffer5μl，MgCl25μl，10mmol/LdNTPs1μl,TaqDNA聚合酶2U。PCR反应时间为：预热94℃5min；随后58℃45s、72℃60s、94℃30s，共35个循环；72℃延伸10min钟；4℃保存。
1.3.5RNA质量监测:样本采用abl引物扩增[6]，若只有一条185bp的条带，表明该模板RNA是完整的。
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1.3.6统计学检验：采用卡方检验，四格表精确概率检验法。
图1 细胞株Flt3基因的表达
M:Marker,1:HL-60,2:K562,3:U937,4:NB4,5:KG-1
图2 PCR灵敏度检测
1～10:NB4细胞RNA20～2-9
图3 单核细胞性白血病细胞(×1250)
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图4 淋巴性白血病细胞(×1250)
图5 粒细胞性白血病细胞(×1250)
2 结果
2.1细胞系细胞株的表达情况
在5种白血病细胞株中，Flt3基因的表达见图1。HL-60、KG-1、NB4表达为阳性，可见一条366pb的产物，及内对照一条210pbβ-actin基因产物，K562、U937两个细胞株为阴性表达。
2.2PCR灵敏度检测
Flt3基因经PCR及产物检测灵敏度达2-5，见图2所示。
2.3正常人外周血Flt3基因的表达
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单核细胞、淋巴细胞、粒细胞分离纯度达90%以上，分别提取RNA经RT-PCR扩增检测Flt3表达，结果均未见阳性表达。
2.4恶性细胞Flt3基因的表达
恶性细胞经上述方法分离，细胞得率为45%～60%，纯度为90%以上，分别见图3、4、5。提取RNA进行RT-PCR扩增，产物在1%琼脂糖凝胶电泳，观察、记录、摄影。
2.4.1急性白血病中Flt3的表达：初治52例病例中AML35例(M1～M6)中Flt3表达32例(91.4%)，其中M13(3)，M24(5)，M310(10)，M44(4)，M510(12)，M61(1)。初治ALL17例中Flt3表达14例(82.3%)。Flt3的表达在急性白血病组与正常对照组间差异有显著统计学意义(P<0.01)。短期观察6例经化疗4例CR(1例M3，1例M4，2例ALL)均转为阴性。1例ALL及1例M3病人未能CR仍持续Flt3表达。(见图6)
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2.4.2慢性白血病中Flt3的表达：53例病例中Flt3的表达18例(33.9%)。47例CML中在慢性阶段未见Flt3的表达，但于急变期13例中11例(淋巴性3例、髓性6例、混合细胞性2例)有表达；5例加速期中，3例有表达。CLL中6例，有4例阳性。Flt3的表达在慢性白血病组与正常对照组间差异有显著统计学意义(P<0.01)。慢性与急性白血病组间差异亦有显著统计学意义(P<0.01)。(见图7)
2.4.3MDS中Flt3的表达：4例MDS中有2例表达，阳性率50%。为难治性贫血伴原始细胞增多-转变型(RAEB-T)。(见图8)
表1 恶性血液病人外周血中Flt3基因的表达 疾病分类
n
Flt3mRNA表达(%)
急性白血病
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52
42(88.5)
AMLtotal
35
32(91.4)
M1
3
3(100)
M2
6
4(80)
M3
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10
10(100)
M4
4
4(100)
M5
12
10(83.3)
M6
1
1(100)
ALL
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17
14(82.3)
慢性白血病
53
18(33.9)
CGL
47
14(29.8)
CLL
6
4(66.6)
MDS
4
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2(50)
图6 RT-PCR检测AML中Flt3的表达
1:HL-60,2:U937,3:空白对照,4～6:阳性表达,7:阴性表达,8～9:M3初治、CR,10～11:ALL初治、CR
图7CML中的Flt3基因的表达
1:HL-60,2:NB4,3:KG-1,4:U938,5～10:CML阳性表达,11～12:阴性表达
图8 MDS中的Flt3基因的表达
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1:NB4,2:HL-60,3:U938,4:KG-1,5～6:MDS阳性表达,7～8:MDS阴性表达
2.5 Flt3基因的突变
在病例检测中有6例AML出现一条质量比Flt3更大的产物条带(见图6中第5泳道)，可能为Flt3基因的突变[7]。将作另文报道。
实验中的109例恶性血液病人外周血中Flt3基因的表达情况见表1，急性白血病呈高表达88.5%(42/52),Flt3基因与急性白血病密切相关。慢性白血病为33.9%(18/53)，见于一些特定阶段。我们亦对4例MDS进行了检测，2例RAEB-T阳性表达。
3 讨论
成熟血细胞是由自身更新造血干/祖细胞群通过增殖和分化而生成，由能与特异细胞表面受体结合的造血生长因子网所调控。而造血细胞克隆扩增、分化障碍都会导致白血病细胞的增殖，这种分化和死亡程序及对信号分子反应的变化是基因改变的结果，其基因的产物就是一些造血生长因子受体，并在造血细胞膜上表达。在正常骨髓中，Flt3基因在所有CD34+细胞中限制性地低水平表达，外周血的血细胞不表达。外周血的检测可排除CD34+细胞表达的可能，从而直接显示恶性细胞的表达情况。本试验通过RT-PCR方法检测Flt3mRNA结果显示，在非恶性血液病病人外周血中未能检测到产物。正常外周血的单核、淋巴、中性粒细胞Flt3无表达，Brasel等认为Flt3mRNA表达仅限于造血祖细胞，而定向、分化细胞则不表达[8]，本文结果与之相符。通过采用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法直接分离出外周血中原始细胞进行检测。提高了灵敏度,因而能既方便又能更客观地反映恶性细胞的表达情况。
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在初治的AML中:Flt3基因编码受体Flt3的mRNA在AML外周血的原始细胞中呈高表达,为91.4%,AMLM1～M6中均有表达。在ALL中表达率亦较高为82.3%(见表1)，Meierhoff等报道ALL中B-ALL呈高表达为100%，而T-ALL则比例较低[9]，本文实验未进行免疫分型的分类故未作定论。1例ALL及1例M3病人经多种方案治疗未缓解，复查仍为阳性表达，可能与多药耐药(multidrugresistance，MDR)相关。4例AML(缓解)检测为阴性，亦说明其表达与疾病转归相关。Carow等曾报导指出的在缓解期AMLFlt3表达可能是复发的敏感标志[10]。
在慢性白血病中:CML中为33.9%仅见于急变期及加速期，在慢性阶段则无表达。在CML中仅于淋巴、髓性、混合细胞性变及加速期有表达，Flt3与CML疾病发展相关。CLL中表达较高，因病例不多，尚难说明问题。MDS4例中有2例阳性均为转化期。提示可能与MDS向白血病转变有关[11]。
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Flt3异常表达与白血病恶性细胞数量呈正相关，白血病中Flt3表达方式与c-kit及c-fms表达不同，AML和CML髓细胞性急变中c-kit表达高水平，而B-All和T-All无表达；c-fms则仅在一些AML和T-ALL中表达。近年来国外的研究已显示Flt3的促有丝分裂作用及信号传递特征；Flt3分子通过与FL结合而呈二聚体化，并使细胞外酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的Flt3通过各种细胞浆相关蛋白传导激活信号，其中包括一个生物化学级联反应。并能提供增殖刺激；原型Flt3蛋白代表主要的效应分子，即Flt3为功能性受体，Flt3与FL相互作用能促进白血病恶性细胞克隆的增殖与维持[12]。因而，Flt3基因是一个与白血病，尤其是急性白血病密切相关的基因。
MRD(微小残留病灶)是白血病复发的原因,及时检测MRD,尽早清除MRD,才能降低白血病的复发率,达到治愈的目的。MRD占血细胞总数的1/1000～1/10000以下，常规的细胞形态学检查不能检测出来。荧光原位杂交(FISH)灵敏度为1/100，流式细胞术检测MRD尚存在确定阳性阈值的问题。用RT-PCR检测异位后的融合基因如：PML-RARα、AML1-ETO、MLL等作为MRD的标志，敏感度和特异性均很强，但选择标志不易。而Flt3基因在急性白血病有广泛高表达，在慢性白血病中见于一些特定阶段，并与疾病的转归相关，本试验建立的检测Flt3的mRNA的方法，灵敏度为2-5，因此，Flt3基因有望成为白血病的泛基因，在MRD的检测中发挥重要作用。
, 百拇医药
[参考文献]
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2，Torres H, Dubreuil P, Falzetti F, et al. c-fms expression in acute leukemias with complex phenotypes [J]. Leukemia,1990,4(10):673～ 677.
3，张明,顾庆礼.DNA指纹图在急性白血病中的应用[J].中华血液学杂志,1997,18:276～277.
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4，顾庆礼,张箐,张健.血细胞的Percoll不连续密度梯度分离法[J].苏州医学院学报,1991,11:50.
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6，Watzinger F,Lion T.Multiplex PCR for quality control of template RNA/cDNA in RT-PCR assays [J]. Leukemia, 1998, 12(12):1984～ 1986.
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, 百拇医药
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12，Drexler HG. Expression of FLT3 receptor and response to FLT3 ligand by leukemic cells [J]. Leukemia,1996,10(4): 588～ 599.
收稿日期：1999-12-06；修回日期：2000-02-25, 百拇医药
单位：李东 曾皓明(南京江北人民医院血液科，江苏南京210048)；顾庆礼 朱琬莹 姚利(苏州医学院附属第一医院江苏省血液研究所，江苏苏州215006)
关键词：Flt3基因；白血病；基因表达；逆转录-聚合酶链反应
癌症000624
【摘要】目的：研究Flt3基因在不同类型、亚型白血病中mRNA表达、分布情况，以期阐明Flt3基因表达与疾病发生、发展的关系，探索Flt3基因作为白血病转归及预后指标的意义。方法：应用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法分离出外周血中原始细胞，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，检测Flt3基因在109例恶性血液病患者外周血中表达。结果：初治AML(急性髓细胞性白血病)中Flt3基因mRNA表达为91.4%;ALL(急性淋巴细胞性白血病)中表达率亦较高，为82.3%；在急性白血病的CR(完全缓解)病例中原Flt3阳性表达可转为阴性；而NR(未缓解)的患者则持续为阳性表达。CML(慢性髓细胞性白血病)中阳性表达为33.9%，仅见于急变期及加速期，在慢性阶段则无表达。6例CLL(慢性淋巴细胞性白血病)中的4例、4例MDS(骨髓增生异常综合征)中的2例表达Flt3。结论:Flt3基因有望在白血病诊治过程中成为标志性基因。
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中图分类号：R733 文献标识码：A
文章编号：10000-467X(2000)06-0589-05
Study on the expression of Flt3 gene in human
leukemias and its clinical significance
LI Dong
Department of Hematology,Nanjing Jiangbei People's Hospital， Nanjing 210048， P.R. China
GU Qing- li， ZHU Wan- ying， et al.
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Jiangsu Institute of Hematology, the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006, P.R. China
【 Abstract】 Objectives: To investigate the expression of Flt3 gene in leukemia and indicate the relation between the expression of Flt3 gene and the occurrence or the development of the disease. Methods: The separation method of the Percoll discontinuous density gradient was applied to isolate the blast cells in peripheral blood. RT- PCR was used to detect the mRNA expressions of Flt3 in blast cells of peripheral blood from 109 malignant patients. Results: The high level of the Flt3 mRNA in primary AML blasts from 35 patients peripheral blood was 91.4% with no apparent predominance of any of the M1～ M6 subtypes, Flt3 mRNA in ALL also was found at high level in 82.4 % . When the patients were in complete remission(CR), their expression could be changed from positive to negative. But the positive rates was continual if the leukemia cases were non-remission (NR). The positive rate in CML sample was 33.9% which was attained merely to accelerated phase and blast crisis,whereas it was not found in chronic phase. Flt3 mRNA was detected in 4/6 cases of CLL and 2/4 cases of MDS. Conclusion:Flt3 gene will hopefully become a symbolic gene during the course of diagnosis and treatment in leukemias.
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Key words:Flt3 gene; Leukemia; Gene expression; RT-PCR
Flt3基因是近年发现的早期造血生长因子受体基因,其与KL(干细胞生长因子)的受体C-kit、CSF-1(巨噬细胞集落刺激因子)的受体c-fms同属于第三族酪氨酸激酶基因家族成员，调控早期造血，其中Flt3正常表达时期较后两者更早。已有报道c-kit和c-fms在白血病中有表达[1,2]。有关Flt3在白血病中的表达研究目前国内尚未见类似报道，为检测Flt3基因在中国人白血病不同类型、亚型白血病表达、分布情况。本文通过采用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法直接分离出外周血中原始细胞，运用RT-PCR检测方法，检测了Flt3mRNA在109例恶性血液病病人的外周血中的表达，旨在研究在白血病中Flt3基因的表达、分布与疾病发生、发展的关系；探索Flt3基因作为白血病转归及预后指标的意义，在白血病的诊治中提出一种新的检测和评估方法。
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1 材料和方法
1.1 临床病例和白血病细胞株
恶性血液病患者109例，其中AML(M1～M6)35例，ALL17例，CML47例，CLL6例，MDS4例；男58例，女51例；中位年龄37.5岁。并对6例急性白血病病人短期随访。对照组的外周血样本23例，包括献血员10例、非恶性血液病病人13例[ITP(特发性血小板减少性紫癜)7例、IDA(缺铁性贫血)5例、AA(再生障碍性贫血)1例]，以及5株白血病细胞株：原粒白血病细胞株KG-1，早幼粒白血病细胞株NB4，急性髓性白血病细胞株HL-60，慢性粒细胞白血病细胞株K562，淋巴性细胞株U937，以用作阴性及阳性对照。(由苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所白血病研究室提供)。
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1.2.1细胞分离液Percoll(Pharmacia公司)，DextranT-500(Pharmacia公司)，SIP(贮存液)：9份Percoll加1份1.5mol/LNaCl作为贮存液。60%(V/V)SIP：用pH7.4去Ca2+、Mg2+之Dulbecco缓冲液稀释[SIP∶缓冲液(V/V)=6∶4]；50%(V/V)SIP∶用pH7.4去Ca2+、Mg2+之Dulbecco缓冲液稀释[SIP∶缓冲液(V/V)=5∶5]；1.5%DextranT-500∶DextranT-5001.5g溶于pH7.4去Ca2+、Mg2+之Dulbecco缓冲液100ml，置冰箱待用。
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1.2.2RNA制备试剂：溶液D(4mol/L异硫氰酸胍，25mol/L柠檬酸钠(pH7.0)，十二烷基肌氨酸钠,β-巯基乙醇)，醋酸钠，水饱和酚，氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇，DEPC(Gibco-BRL)。
1.2.3RPMI-1640培养基：按供应商(Gibco-BRL)推荐的方法配制，加入终浓度为10%的新生小牛血清(NCS，上海实生公司)，经0.22μm滤膜过滤。
1.2.4逆转录反应试剂：六随机引物(Sangon)及RNA酶抑制剂(上海华美)AMV逆转录酶(Promega)，5×合成第一链缓冲液(Promega)，10mmol/LdNTPs(上海生工公司)。
1.2.5PCR反应试剂：10×PCR缓冲液，25mmol/LMgCl2,TaqDNA聚合酶(Sangon)。
1.2.6标准分子量：PBR322DNABsuRI(HaeⅢ)，MBI公司(Fermentas)。
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1.2.7Flt3、β-actin、abl基因引物由上海生工公司合成。
Flt3(366bp)
R5：5’-TGTCGAGCAGTACTCTAAACA-3’(nt1487～1507)
R6：5’-ATCCTAGTACCTTCCCAAAACTC-3’(nt1831～1852)
β-actin(210bp)sense：5’-CTTCCTGGGCATGGAGAC-3’
antisense：5’-CGCTCAGGGAGGAGCAATGAT-3’
abl(185bp)sense：5’-TTCAGCGGCCAGCATCTGACTT-3’
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antisense：5’-GACCCGGAGCTTTTCACCTTTAGTT-3’
1.3实验方法
1.3.1细胞分离：采用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法[3，4]，分离出外周血中的单核细胞、淋巴细胞、粒细胞。将分得的单核、淋巴和粒细胞用pH7.4去Ca2+、Mg2+之Dulbecco缓冲液洗2～3次，除去残余的Percoll，计数，涂片，分类。
1.3.2RNA制备:采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA[5]。抽提的RNA用DEPC-H2O溶解,实验选用样本为经紫外分光光度计测定其RNA溶液A260/A280>1.8，且经RNA酶消化后在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察未发现有RNA及其它条带存在。-20℃保存备用。
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1.3.3逆转录反应：标本总RNA2μg，六随机引物100ng，加DEPC处理水至20μl，72℃变性5分钟，另加5×合成第一链缓冲液8μl，10mmol/LdNTP1μl，RNA酶抑制剂RNasin50U，10mmAMV10U，总逆转录体系40μl，37℃反应60min，4℃保存。
1.3.4PCR反应：(按BoehringerMannheim厂商试剂盒方法稍加修改)反应体系50μl，取cDNA10μl，分别加入40pmol引物R5和R6，及β-actin的sense链和antisense链引物,10×PCRbuffer5μl，MgCl25μl，10mmol/LdNTPs1μl,TaqDNA聚合酶2U。PCR反应时间为：预热94℃5min；随后58℃45s、72℃60s、94℃30s，共35个循环；72℃延伸10min钟；4℃保存。
1.3.5RNA质量监测:样本采用abl引物扩增[6]，若只有一条185bp的条带，表明该模板RNA是完整的。
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1.3.6统计学检验：采用卡方检验，四格表精确概率检验法。
图1 细胞株Flt3基因的表达
M:Marker,1:HL-60,2:K562,3:U937,4:NB4,5:KG-1
图2 PCR灵敏度检测
1～10:NB4细胞RNA20～2-9
图3 单核细胞性白血病细胞(×1250)
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图4 淋巴性白血病细胞(×1250)
图5 粒细胞性白血病细胞(×1250)
2 结果
2.1细胞系细胞株的表达情况
在5种白血病细胞株中，Flt3基因的表达见图1。HL-60、KG-1、NB4表达为阳性，可见一条366pb的产物，及内对照一条210pbβ-actin基因产物，K562、U937两个细胞株为阴性表达。
2.2PCR灵敏度检测
Flt3基因经PCR及产物检测灵敏度达2-5，见图2所示。
2.3正常人外周血Flt3基因的表达
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单核细胞、淋巴细胞、粒细胞分离纯度达90%以上，分别提取RNA经RT-PCR扩增检测Flt3表达，结果均未见阳性表达。
2.4恶性细胞Flt3基因的表达
恶性细胞经上述方法分离，细胞得率为45%～60%，纯度为90%以上，分别见图3、4、5。提取RNA进行RT-PCR扩增，产物在1%琼脂糖凝胶电泳，观察、记录、摄影。
2.4.1急性白血病中Flt3的表达：初治52例病例中AML35例(M1～M6)中Flt3表达32例(91.4%)，其中M13(3)，M24(5)，M310(10)，M44(4)，M510(12)，M61(1)。初治ALL17例中Flt3表达14例(82.3%)。Flt3的表达在急性白血病组与正常对照组间差异有显著统计学意义(P<0.01)。短期观察6例经化疗4例CR(1例M3，1例M4，2例ALL)均转为阴性。1例ALL及1例M3病人未能CR仍持续Flt3表达。(见图6)
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2.4.2慢性白血病中Flt3的表达：53例病例中Flt3的表达18例(33.9%)。47例CML中在慢性阶段未见Flt3的表达，但于急变期13例中11例(淋巴性3例、髓性6例、混合细胞性2例)有表达；5例加速期中，3例有表达。CLL中6例，有4例阳性。Flt3的表达在慢性白血病组与正常对照组间差异有显著统计学意义(P<0.01)。慢性与急性白血病组间差异亦有显著统计学意义(P<0.01)。(见图7)
2.4.3MDS中Flt3的表达：4例MDS中有2例表达，阳性率50%。为难治性贫血伴原始细胞增多-转变型(RAEB-T)。(见图8)
表1 恶性血液病人外周血中Flt3基因的表达 疾病分类
n
Flt3mRNA表达(%)
急性白血病
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52
42(88.5)
AMLtotal
35
32(91.4)
M1
3
3(100)
M2
6
4(80)
M3
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10
10(100)
M4
4
4(100)
M5
12
10(83.3)
M6
1
1(100)
ALL
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17
14(82.3)
慢性白血病
53
18(33.9)
CGL
47
14(29.8)
CLL
6
4(66.6)
MDS
4
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2(50)
图6 RT-PCR检测AML中Flt3的表达
1:HL-60,2:U937,3:空白对照,4～6:阳性表达,7:阴性表达,8～9:M3初治、CR,10～11:ALL初治、CR
图7CML中的Flt3基因的表达
1:HL-60,2:NB4,3:KG-1,4:U938,5～10:CML阳性表达,11～12:阴性表达
图8 MDS中的Flt3基因的表达
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1:NB4,2:HL-60,3:U938,4:KG-1,5～6:MDS阳性表达,7～8:MDS阴性表达
2.5 Flt3基因的突变
在病例检测中有6例AML出现一条质量比Flt3更大的产物条带(见图6中第5泳道)，可能为Flt3基因的突变[7]。将作另文报道。
实验中的109例恶性血液病人外周血中Flt3基因的表达情况见表1，急性白血病呈高表达88.5%(42/52),Flt3基因与急性白血病密切相关。慢性白血病为33.9%(18/53)，见于一些特定阶段。我们亦对4例MDS进行了检测，2例RAEB-T阳性表达。
3 讨论
成熟血细胞是由自身更新造血干/祖细胞群通过增殖和分化而生成，由能与特异细胞表面受体结合的造血生长因子网所调控。而造血细胞克隆扩增、分化障碍都会导致白血病细胞的增殖，这种分化和死亡程序及对信号分子反应的变化是基因改变的结果，其基因的产物就是一些造血生长因子受体，并在造血细胞膜上表达。在正常骨髓中，Flt3基因在所有CD34+细胞中限制性地低水平表达，外周血的血细胞不表达。外周血的检测可排除CD34+细胞表达的可能，从而直接显示恶性细胞的表达情况。本试验通过RT-PCR方法检测Flt3mRNA结果显示，在非恶性血液病病人外周血中未能检测到产物。正常外周血的单核、淋巴、中性粒细胞Flt3无表达，Brasel等认为Flt3mRNA表达仅限于造血祖细胞，而定向、分化细胞则不表达[8]，本文结果与之相符。通过采用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法直接分离出外周血中原始细胞进行检测。提高了灵敏度,因而能既方便又能更客观地反映恶性细胞的表达情况。
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在初治的AML中:Flt3基因编码受体Flt3的mRNA在AML外周血的原始细胞中呈高表达,为91.4%,AMLM1～M6中均有表达。在ALL中表达率亦较高为82.3%(见表1)，Meierhoff等报道ALL中B-ALL呈高表达为100%，而T-ALL则比例较低[9]，本文实验未进行免疫分型的分类故未作定论。1例ALL及1例M3病人经多种方案治疗未缓解，复查仍为阳性表达，可能与多药耐药(multidrugresistance，MDR)相关。4例AML(缓解)检测为阴性，亦说明其表达与疾病转归相关。Carow等曾报导指出的在缓解期AMLFlt3表达可能是复发的敏感标志[10]。
在慢性白血病中:CML中为33.9%仅见于急变期及加速期，在慢性阶段则无表达。在CML中仅于淋巴、髓性、混合细胞性变及加速期有表达，Flt3与CML疾病发展相关。CLL中表达较高，因病例不多，尚难说明问题。MDS4例中有2例阳性均为转化期。提示可能与MDS向白血病转变有关[11]。
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Flt3异常表达与白血病恶性细胞数量呈正相关，白血病中Flt3表达方式与c-kit及c-fms表达不同，AML和CML髓细胞性急变中c-kit表达高水平，而B-All和T-All无表达；c-fms则仅在一些AML和T-ALL中表达。近年来国外的研究已显示Flt3的促有丝分裂作用及信号传递特征；Flt3分子通过与FL结合而呈二聚体化，并使细胞外酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的Flt3通过各种细胞浆相关蛋白传导激活信号，其中包括一个生物化学级联反应。并能提供增殖刺激；原型Flt3蛋白代表主要的效应分子，即Flt3为功能性受体，Flt3与FL相互作用能促进白血病恶性细胞克隆的增殖与维持[12]。因而，Flt3基因是一个与白血病，尤其是急性白血病密切相关的基因。
MRD(微小残留病灶)是白血病复发的原因,及时检测MRD,尽早清除MRD,才能降低白血病的复发率,达到治愈的目的。MRD占血细胞总数的1/1000～1/10000以下，常规的细胞形态学检查不能检测出来。荧光原位杂交(FISH)灵敏度为1/100，流式细胞术检测MRD尚存在确定阳性阈值的问题。用RT-PCR检测异位后的融合基因如：PML-RARα、AML1-ETO、MLL等作为MRD的标志，敏感度和特异性均很强，但选择标志不易。而Flt3基因在急性白血病有广泛高表达，在慢性白血病中见于一些特定阶段，并与疾病的转归相关，本试验建立的检测Flt3的mRNA的方法，灵敏度为2-5，因此，Flt3基因有望成为白血病的泛基因，在MRD的检测中发挥重要作用。
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1，Kanakura Y,Ikeda H, Kitayama H, et al. Expression, function and activation of the proto-oncogene c-kit product in human leukemia cells [J]. Leuk Lymphoma, 1993, 10:35～ 41.
2，Torres H, Dubreuil P, Falzetti F, et al. c-fms expression in acute leukemias with complex phenotypes [J]. Leukemia,1990,4(10):673～ 677.
3，张明,顾庆礼.DNA指纹图在急性白血病中的应用[J].中华血液学杂志,1997,18:276～277.
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收稿日期：1999-12-06；修回日期：2000-02-25, 百拇医药