EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过TRAF2活化NF-κB
作者：王承兴 李晓艳 肖绘 邓锡云 曹亚
单位：王承兴 李晓艳 肖绘 邓锡云 曹亚(湖南医科大学肿瘤研究所，湖南长沙410078)
关键词：鼻咽肿瘤；LMP1；TRAF2；NF-κB
癌症000603
【摘要】目的：为了探讨EB病毒(EBV)中LMP1的致瘤机制，对鼻咽癌LMP1激活重要的核转录因子NF-κB的机制进行了研究。方法：①以LMP1阴性的鼻咽癌细胞系HNE2及表达载体(pSG5)的鼻咽癌细胞系HNE2-pSG5为对照，采用免疫共沉淀-Western-blotting方法在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1中证实LMP1与TRAF2是否直接结合形成免疫共沉淀复合物；②在HNE2-LMP1细胞系导入TRAF2表达质粒或不同剂量TRAF2显性负性突变体(TRAF2Δ6～86)表达质粒，以NF-κB报道基因方法确定LMP1是否通过TRAF2活化NF-κB；③将LMP1(1～231)(CTAR2缺失区)或LMP1Δ187～351(CTAR1缺失区)及不同剂量TRAF2Δ6～86瞬时导入HNE2中以证实LMP1CTAR1或CTAR2是否介导了这种效应；④以转染或未转染TRAF2Δ6～86的HNE2-LMP1细胞系为材料，应用免疫共沉淀-Western-blotting方法，确定TRAF2Δ6～86是否竞争性抑制TRAF2与LMP1结合。结果：①在HNE2-LMP1中LMP1与TRAF2形成复合物沉淀，而HNE2-pSG5和HNE2为阴性。②在HNE2-LMP1细胞系导入TRAF2表达质粒，NF-κB活性增高20倍，而导入不同剂量TRAF2Δ6～86表达质粒时，随着剂量增大，NF-κB活性递减。③TRAF2强烈抑制LMP1(1～231)活化NF-κB，而仅部分抑制LMP1Δ187～351活化NF-κB。④TRAF2Δ6～86竞争性抑制TRAF2与LMP1结合。结论：在鼻咽癌中LMP1通过TRAF2而激活NF-κB，其中LMP1的CTAR1区主要介导了这种效应。这为我们进一步从信号传导通路来探讨LMP1的致癌机制提供了新的线索。
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中图分类号：R739.3 文章标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0517-04
Epstein-barr virus-encoded latent membrane protein 1 activates NF-κ B via
a mechanism involving TRAF2 in nasopharyngeal carcinoma
WANG Cheng-xing, LI Xiao-yan, CAO Ya, et al.
Cancer Research Institute of Hunan Medical University, Changsha 410078,P.R.China
, 百拇医药
【 Abstract】 Objective: Our recent studies show the strong relationship between NF-κ B activation mediated by LMP1 and nasopharyngeal carcinoma (NPC) neoplastic phenotype. We are trying to identify the mechanism involved. Methods: A stable transfectant cell line established by introducing LMP1 cDNA into HNE2 cells,HNE2-LMP1,was used as cell model. The association of LMP1 with TRAF2 was detected with immunoprecipitation-Western-blotting in the HNE2-LMP1; the role of TRAF2 in LMP1, LMP1(1～ 231) or LMP1Δ 187～ 351-mediated NF-κ B activation was evaluated using TRAF2 dominant negative mutant TRAF2Δ 6～ 86 with reporter gene analysis; blocking of the association of TRAF2 with LMP1 by TRAF2Δ 6～ 86 was investigated by immunoprecipitation-western blotting. Results: TRAF2 was bound and coprecipitated to LMP1 in an HNE2-LMP1 cell line. A dominant negative TRAF2 inhibits NF-κ B activation from LMP1 and competes with TRAF2 for LMP1 binding. TRAF2Δ 6～ 86 inhibits NF-κ B activation mediated by LMP1(1～ 231) by more than 75% but inhibits NF-κ B activation through LMP1Δ 187～ 351 by less than 40% . Conclusion: These data implicate TRAF2 aggregation in NF-κ B activation by LMP1 and provide an experimental basis for our study beginning from the signal transduction pathway for elucidation of the mechanism of LMP1 carcinogenesis.
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Key words:Nasopharyngeal neoplasms;Latent membrane protein 1;Tumor necrosis factor receptor associated factors 2;NF-κ B
EB病毒是一种与多种肿瘤发生密切相关的DNA致瘤病毒，除了与鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、移植术后淋巴瘤、传染性单核细胞增生症等病有关外，最近的进展证明EB病毒还与肺癌、胃癌、甚至与乳腺癌等多种肿瘤的发生有关。目前的研究发现，EBV编码的重要致瘤蛋白LMP1类似肿瘤坏死因子受体家族CD40，通过激活细胞内的信号传导通路而参与肿瘤的发生与发展[1]。
转录因子NF-κB是近年来研究的热点。在LMP1所介导的信号传导网络系统中，它处于信号传导枢纽。作为重要的转录调控因子，NF-κB被LMP1激活后，调节很多靶基因表达，这些基因参与细胞增殖、转化、分化、凋亡、免疫反应等多种生物学过程，因而与肿瘤的发生与发展有着密切关系[2]。
, 百拇医药
新近，我们的工作证实在鼻咽癌中LMP1能高水平持续激活NF-κB，且与细胞恶性表型密切相关[3]。在此基础之上，进一步研究LMP1如何激活NF-κB，确定何种效应分子介入了这种活化，以及探索其机制，将为深入探讨鼻咽癌中LMP1激活NF-κB的分子机制提供有意义的实验依据。
LMP1在淋巴细胞中介导的细胞内信号传导通路证实[1]LMP1通过与肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factors,TRAFs)或肿瘤坏死因子受体死亡结构域蛋白(tumor necrosis factor receptor associated death domain protein,TRADD)结合,促进IκB磷酸化，从而激活NF-κB。其中在LMP1羧基末端有两个结构域与功能密切相关，一个是位于194～231位氨基酸的CTAR1(carboxy terminal activating region1)；另一个是位于351～386位的CTAR2。CTAR1通过聚集TRAF1/TRAF2/TRAF3，激活大约25%NF-κB活性，而CTAR2通过聚集TRADD/TRAF2活化75%NF-κB。由于TRAF2内含锌指结构为NF-κB活化所必需[4]，而且CTAR1及CTAR2活化NF-κB皆为TRAF2所介导，因而它可能是鼻咽癌中LMP1激活NF-κB中的关键效应分子。由此，我们将以TRAF2为切入点，在鼻咽癌中探讨LMP1是否通过与TRAF2结合而有效地激活NF-κB。
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1.1 材料
1.1.1细胞系：鼻咽癌细胞系HNE2是本所建立的EB病毒阴性的低分化鳞癌细胞系，LMP1阴性[5],我们以转染空白载体为对照，分别将野生型B95-8来源的全长LMP1cDNA和新霉素选择标志Neo基因用电穿孔法共同导入HNE2中，G418筛选，挑单个克隆，鉴定，建立稳定表达LMP1鼻咽癌细胞系：HNE2-LMP1(野生型)及其空白载体的鼻咽癌细胞系HNE2-pSG5(空白载体型)。
1.1.2质粒：(1)LMP1及突变体表达质粒：(B346-FlAG-LMP11-386(野生型LMP1),(B462-FlAG-LMP11-386△187～351(CTAR1缺失型),③B467-FlAG-LMP1(1～231)(CTAR2缺失型),④pSG5-空白载体:由美国BrighamandWomen'sHospital,DrKennethMlzumi馈赠。(2)TRAF2及其显性负性突变体表达质粒:①PCR2FL-TRAF2(1-501)，由日本JuntendoUniversityDr.NiroyasuNakano馈赠;②PCR2FL-TRAF2Δ6～86由美国BrighamandWomen'sHospital,DrKennethMIzumi馈赠。(3)NF-κB报道基因质粒(pGL2-NF-κB-luc)由美国国立癌症研究院李建建博士馈赠。将质粒按常规方法转化大肠杆菌TG1，纯化质粒，酶切鉴定后，测定DNA浓度，置4℃保存。
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1.1.3抗体与试剂:LuciferaseAssaySystem购自美国Promega公司，PlasmidPurificationKit购自美国QIAGEN公司,LipofecTAMINE购自美国生命技术公司(GibcoBRL)。
1.2方法
1.2.1免疫共沉淀-Westernblotting:按ImmunoCATCHERkit说明操作，以B95-8细胞为阳性对照，将LMP1抗体与HNE2-LMP1、HNE2-pSG5、HNE2细胞裂解物温育，形成LMP1抗原-抗体复合物，12%SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至硝纤膜，再与TRAF2兔多克隆抗体温育12h，抗兔IgG-HRP温育1h，DAB显色法检测棕黄色条带。
在鼻咽癌活检组织中LMP1与TRAF2信号分子共表达于癌细胞的胞膜及胞浆同一部位的基础上，进一步用免疫共沉淀-Western-blotting方法探讨在鼻咽癌细胞系中LMP1是否结合TRAF2发挥作用。
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以B95-8细胞为阳性对照，在HNE2-LMP1、HNE2-pSG5及HNE2细胞系中，应用免疫共沉淀-Western-blotting方法，先用LMP1抗体免疫共沉淀下与之作用的信号分子，再用TRAF2抗体进行Western-blotting杂交分析，以证实LMP1是否与TRAF2作用。
1.2.2LipofectTAMINE介导的瞬间转染:按LipofecTAMINE转染说明书，转染前24小时将细胞种植于6孔细胞培养板中,待细胞生长至50%～80%的融合度时弃培养基。取2μgDNA稀释到100μl无血清培养基中，加入10μlLipofectamine，混匀后室温静置15min。加入800μl完全培养至DNA-Lipofectamine混合物中，混匀。培养细胞经D-Hank's液漂洗后，再将DNA-lipofectamine混合物加入，混匀。5%CO2培养箱37℃培养3h后，用D-Hank's液洗涤细胞，加入完全培养基继续培养直到收获。
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图1 鼻咽癌细胞系中TRAF2表达的免疫共沉淀Western-blotting分析1：Bq5-8;2:HNE2-LMp1;3:HNE2-PSG5;4:HNE2
图2 鼻咽癌细胞系中LMP1通过TRAF2活化NF-κB的报道基因分析
图3鼻咽癌细胞系中LMP1(1～231)通过TRAF2活化
NF-κB的报道基因分析
LMP1(1～231)可将NF-κB活性升高5.1倍，而TRAF2Δ6～86最大抑制75%NF-κB活性。
1.2.3荧光素酶活性分析:用LipofecTAMINE的方法将报道质粒瞬间转染入细胞，24h后，按LuciferaseAssaySystem的说明，加入100μl1×lysisbuffer，室温下裂解15min，用细胞刮子将细胞刮下，移至Eppendorf管内，室温离心12000r/min10min,取20μl上清液，加入100μl反应底物，迅速推入单光子检测仪，检测cpm值。间隔10s，每一样本读两个数值，取均值。然后以导入HNE2系cpm值为基数，计算LMP1或突变体HNE2系cpm值倍数。
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2 结果
2.1鼻咽癌细胞系中LMP1与TRAF2结合形成复合物沉淀
在HNE2-LMP1中LMP1与TRAF2形成复合物沉淀，其大小分别为75kDa，而HNE2--pSG5和HNE2为阴性(图1)。这表明在鼻咽癌细胞系中，LMP1与TRAF2信号分子结合而介导下游信号传导反应。
2.2鼻咽癌细胞系中LMP1通过TRAF2活化NF-κB
用含有HIVLTRκB元件的CMV启动子启动荧光素酶基因的表达来衡量与κB元件结合NF-κB活性,比较在两种细胞系(HNE2-LMP1及HNE2-pSG5)中NF-κB活性改变，结果发现HNE2-LMP1细胞系中NF-κB活性高达HNE2-pSG5中的12.4倍，说明LMP1活化NF-κB。随后将不同剂量TRAF2显性突变体及NF-κB报道质粒瞬时转染于HNE2-LMP1细胞系中，发现随着TRAF2显性突变体剂量递增，NF-κB活性递减，最大可下降50%。而TRAF2高水平表达则可将NF-κB活性增高20倍(图2)。这表明LMP1通过TRAF2活化NF-κB。
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同时，将不同剂量TRAF2显性突变体TRAF2Δ6～86和NF-κB报道质粒瞬间转染入HNE2-LMP1Δ187～351、HNE2-LMP1(1～231)细胞系中，结果发现，0.2μgTRAF2Δ6～86抑制LMP1(1～231)介导的75%NF-κB活性，1μg则抑制80%NF-κB活性(图3)。相反，0.2μgTRAF2Δ6～86抑制20%LMP1Δ187～351介导的NF-κB活性，而1μg则抑制40%(图4)。因此，TRAF2Δ6～86对LMP1(1～231)介导的NF-κB活性有强烈的抑制效果，而对LMP1Δ187～351介导NF-κB活性仅部分抑制。
2.3TRAF2显性负性突变体通过竞争性阻断TRAF2与LMP1结合而抑制NF-κB活性
在上述证明LMP1通过结合TRAF2活化NF-κB的基础上，我们进一步确定TRAF2Δ6～86是否通过与LMP1结合，从而阻断TRAF2与LMP1结合而抑制NF-κB活性。以转染或未转染TRAF2Δ6～86的HNE2-LMP1细胞系为材料，应用免疫共沉淀-Western-blotting方法，先用LMP1抗体将与之形成的信号传导复合物共沉淀下来，再用TRAF2抗体进行Western-blotting杂交分析。结果发现在同等剂量的LMP1免疫沉淀复合物中，转染TRAF2Δ6～86HNE2-LMP1细胞系中较单独HNE2-LMP1细胞系中内源性TRAF2少(图5)。说明TRAF2Δ6～86竞争性抑制TRAF2与LMP1结合，因此而下调LMP1激活NF-κB活性，因为TRAF2锌指结构是TRAF2活化NF-κB所必需的[4]。
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图4鼻咽癌细胞系中LMP1△187～351通过
TRAF2活化NF-κB的报道基因分析
LMP1Δ187～351可将NF-κB活性升高9.1倍，而TRAF2Δ6～86最大抑制45%NF-κB活性。
3 讨论
EB病毒是鼻咽癌发生的重要生物学因素，作为EB病毒的主要致瘤蛋白，LMP1在鼻咽癌发生过程中所起作用及机制一直是鼻咽癌分子致病机理中研究的热点。最近的研究表明，LMP1的作用与其介导细胞内的信号传导通路有关。在鼻咽癌中，我们已证实LMP1的表达能高水平持续激活NF-κB，这种活化与细胞恶性表型密切相关[3]。但是，LMP1激活NF-κB的机制尚不清楚。同时，还发现TRAF1在鼻咽癌中存在高表达，可能是LMP1通过NF-κB而促使之故。通过双染色法我们前期工作已确定鼻咽癌活检组织中LMP1与TRAF2共表达于鼻咽癌细胞同一胞膜或胞浆内。在此基础之上，我们采用免疫共沉淀-Western方法证实LMP1可直接与TRAF2结合,而在无LMP1表达的鼻咽癌细胞中，TRAF2弥散分布于细胞胞浆；进一步结合报道基因分析方法证实，在鼻咽癌中，LMP1通过TRAF2激活NF-κB。TRAF2显性负性突变体则通过与TRAF2竞争性结合LMP1而抑制LMP1介导的NF-κB活化。这表明在鼻咽癌中LMP1主要通过结合TRAF2而激活NF-κB。
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我们的实验进一步证实瞬时转染0.2μgTRAF2Δ6～86能阻止LMP1CTAR1介导的75%NF-κB活化，而转染1μgTRAF2△6～86仅阻止LMP1CTAR2介导的约40%NF-κB活化，提示LMP1主要是通过其CTAR1与TRAF2作用介导NF-κB活化，而CTAR2通过TRAF2仅介导部分NF-κB活化。这可能因为CTAR2先要聚集TRADD，TRADD进一步再聚集TRAF2才活化NF-κB；TRADD在此起着关键的作用。
这些证据进一步支持了LMP1类似TNFR的观点。象CD40、TNFRⅠ及TNFRⅡ一样，LMP1也主要通过TRAF2活化NF-κB。在无LMP1表达的HNE2中，TRAF2弥散于整个胞浆中，而在LMP1表达的HNE2中，LMP1发生聚集化而与TRAF2结合，这种结合可能是TRAF2活化NF-κB的关键步骤。这与以前的研究一致[4],即高表达的TRAF2因为能自身形成同源二聚体而诱导NF-κB活化。不过，TNFR通过与配体结合借助TRAF2对NF-κB激活可能是暂时的，而LMP1通过TRAF2激化NF-κB可能是持续性的。这种持续性活化的NF-κB进一步调节一些含κB基因表达，如抗凋亡蛋白A20、bcl-2、p53及一些细胞粘附分子(IFA1、ICAM2、IFA3)，从而参与细胞增殖、凋亡、分化及转化反应。这可能是作为EBV重复致瘤蛋白LMP1参与鼻咽癌癌变的重要机制之一。我们的实验将为我们进一步从信号传导通路来研究LMP1的致癌机制提供新的线索，也为我们以NF-κB为分子靶寻找鼻咽癌药物基因治疗途径提供重要的理论依据。
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基金项目：本课题受国家自然科学基金杰出青年基金(39525022)、美国中华医学基金(CMB96655)、国家自然科学基金重点项目(39830410)及国家重点基础研究发展规划(973)“恶性肿瘤发生发展的基础研究"项目资助
[参考文献]
1，王承兴,曹亚.EB病毒潜伏膜蛋白-1介导的信号传导[J].生物化学与生物物理学进展，1999,26(6),528～530.
2，Cahir E D,Farland M,Mosialos G,et al. Epstein-Barr virus transformation: involvement of latent membrane protein 1-mediated activation of NF-κ B [J]. Oncogene, 1999,18(19):6959～ 6964.
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3，潘雷，顾焕华，曹亚，等.鼻咽癌中EBVLMP1激活NF-κB的实验研究[J].中国耳鼻喉科颅底外科学杂志,1999,3(2):95～99.
4，Kaye K M, Devergne O, Harada J N, et al. TRAF2 is a mediator of NF-κ B activation by latent infection membrane protein 1, the Epstein-Barr virus transforming protein [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(5):11085～ 11090.
5，祝和成，姚开泰，李桂源，等.4株鼻咽癌上皮细胞株的建立及其生物学特性[J].湖南医科大学学报,1992,17(2)：103～107.
收稿日期：2000-04-10;修回日期：2000-04-29, 百拇医药
单位：王承兴 李晓艳 肖绘 邓锡云 曹亚(湖南医科大学肿瘤研究所，湖南长沙410078)
关键词：鼻咽肿瘤；LMP1；TRAF2；NF-κB
癌症000603
【摘要】目的：为了探讨EB病毒(EBV)中LMP1的致瘤机制，对鼻咽癌LMP1激活重要的核转录因子NF-κB的机制进行了研究。方法：①以LMP1阴性的鼻咽癌细胞系HNE2及表达载体(pSG5)的鼻咽癌细胞系HNE2-pSG5为对照，采用免疫共沉淀-Western-blotting方法在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1中证实LMP1与TRAF2是否直接结合形成免疫共沉淀复合物；②在HNE2-LMP1细胞系导入TRAF2表达质粒或不同剂量TRAF2显性负性突变体(TRAF2Δ6～86)表达质粒，以NF-κB报道基因方法确定LMP1是否通过TRAF2活化NF-κB；③将LMP1(1～231)(CTAR2缺失区)或LMP1Δ187～351(CTAR1缺失区)及不同剂量TRAF2Δ6～86瞬时导入HNE2中以证实LMP1CTAR1或CTAR2是否介导了这种效应；④以转染或未转染TRAF2Δ6～86的HNE2-LMP1细胞系为材料，应用免疫共沉淀-Western-blotting方法，确定TRAF2Δ6～86是否竞争性抑制TRAF2与LMP1结合。结果：①在HNE2-LMP1中LMP1与TRAF2形成复合物沉淀，而HNE2-pSG5和HNE2为阴性。②在HNE2-LMP1细胞系导入TRAF2表达质粒，NF-κB活性增高20倍，而导入不同剂量TRAF2Δ6～86表达质粒时，随着剂量增大，NF-κB活性递减。③TRAF2强烈抑制LMP1(1～231)活化NF-κB，而仅部分抑制LMP1Δ187～351活化NF-κB。④TRAF2Δ6～86竞争性抑制TRAF2与LMP1结合。结论：在鼻咽癌中LMP1通过TRAF2而激活NF-κB，其中LMP1的CTAR1区主要介导了这种效应。这为我们进一步从信号传导通路来探讨LMP1的致癌机制提供了新的线索。
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中图分类号：R739.3 文章标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0517-04
Epstein-barr virus-encoded latent membrane protein 1 activates NF-κ B via
a mechanism involving TRAF2 in nasopharyngeal carcinoma
WANG Cheng-xing, LI Xiao-yan, CAO Ya, et al.
Cancer Research Institute of Hunan Medical University, Changsha 410078,P.R.China
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【 Abstract】 Objective: Our recent studies show the strong relationship between NF-κ B activation mediated by LMP1 and nasopharyngeal carcinoma (NPC) neoplastic phenotype. We are trying to identify the mechanism involved. Methods: A stable transfectant cell line established by introducing LMP1 cDNA into HNE2 cells,HNE2-LMP1,was used as cell model. The association of LMP1 with TRAF2 was detected with immunoprecipitation-Western-blotting in the HNE2-LMP1; the role of TRAF2 in LMP1, LMP1(1～ 231) or LMP1Δ 187～ 351-mediated NF-κ B activation was evaluated using TRAF2 dominant negative mutant TRAF2Δ 6～ 86 with reporter gene analysis; blocking of the association of TRAF2 with LMP1 by TRAF2Δ 6～ 86 was investigated by immunoprecipitation-western blotting. Results: TRAF2 was bound and coprecipitated to LMP1 in an HNE2-LMP1 cell line. A dominant negative TRAF2 inhibits NF-κ B activation from LMP1 and competes with TRAF2 for LMP1 binding. TRAF2Δ 6～ 86 inhibits NF-κ B activation mediated by LMP1(1～ 231) by more than 75% but inhibits NF-κ B activation through LMP1Δ 187～ 351 by less than 40% . Conclusion: These data implicate TRAF2 aggregation in NF-κ B activation by LMP1 and provide an experimental basis for our study beginning from the signal transduction pathway for elucidation of the mechanism of LMP1 carcinogenesis.
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Key words:Nasopharyngeal neoplasms;Latent membrane protein 1;Tumor necrosis factor receptor associated factors 2;NF-κ B
EB病毒是一种与多种肿瘤发生密切相关的DNA致瘤病毒，除了与鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、移植术后淋巴瘤、传染性单核细胞增生症等病有关外，最近的进展证明EB病毒还与肺癌、胃癌、甚至与乳腺癌等多种肿瘤的发生有关。目前的研究发现，EBV编码的重要致瘤蛋白LMP1类似肿瘤坏死因子受体家族CD40，通过激活细胞内的信号传导通路而参与肿瘤的发生与发展[1]。
转录因子NF-κB是近年来研究的热点。在LMP1所介导的信号传导网络系统中，它处于信号传导枢纽。作为重要的转录调控因子，NF-κB被LMP1激活后，调节很多靶基因表达，这些基因参与细胞增殖、转化、分化、凋亡、免疫反应等多种生物学过程，因而与肿瘤的发生与发展有着密切关系[2]。
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新近，我们的工作证实在鼻咽癌中LMP1能高水平持续激活NF-κB，且与细胞恶性表型密切相关[3]。在此基础之上，进一步研究LMP1如何激活NF-κB，确定何种效应分子介入了这种活化，以及探索其机制，将为深入探讨鼻咽癌中LMP1激活NF-κB的分子机制提供有意义的实验依据。
LMP1在淋巴细胞中介导的细胞内信号传导通路证实[1]LMP1通过与肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factors,TRAFs)或肿瘤坏死因子受体死亡结构域蛋白(tumor necrosis factor receptor associated death domain protein,TRADD)结合,促进IκB磷酸化，从而激活NF-κB。其中在LMP1羧基末端有两个结构域与功能密切相关，一个是位于194～231位氨基酸的CTAR1(carboxy terminal activating region1)；另一个是位于351～386位的CTAR2。CTAR1通过聚集TRAF1/TRAF2/TRAF3，激活大约25%NF-κB活性，而CTAR2通过聚集TRADD/TRAF2活化75%NF-κB。由于TRAF2内含锌指结构为NF-κB活化所必需[4]，而且CTAR1及CTAR2活化NF-κB皆为TRAF2所介导，因而它可能是鼻咽癌中LMP1激活NF-κB中的关键效应分子。由此，我们将以TRAF2为切入点，在鼻咽癌中探讨LMP1是否通过与TRAF2结合而有效地激活NF-κB。
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1.1 材料
1.1.1细胞系：鼻咽癌细胞系HNE2是本所建立的EB病毒阴性的低分化鳞癌细胞系，LMP1阴性[5],我们以转染空白载体为对照，分别将野生型B95-8来源的全长LMP1cDNA和新霉素选择标志Neo基因用电穿孔法共同导入HNE2中，G418筛选，挑单个克隆，鉴定，建立稳定表达LMP1鼻咽癌细胞系：HNE2-LMP1(野生型)及其空白载体的鼻咽癌细胞系HNE2-pSG5(空白载体型)。
1.1.2质粒：(1)LMP1及突变体表达质粒：(B346-FlAG-LMP11-386(野生型LMP1),(B462-FlAG-LMP11-386△187～351(CTAR1缺失型),③B467-FlAG-LMP1(1～231)(CTAR2缺失型),④pSG5-空白载体:由美国BrighamandWomen'sHospital,DrKennethMlzumi馈赠。(2)TRAF2及其显性负性突变体表达质粒:①PCR2FL-TRAF2(1-501)，由日本JuntendoUniversityDr.NiroyasuNakano馈赠;②PCR2FL-TRAF2Δ6～86由美国BrighamandWomen'sHospital,DrKennethMIzumi馈赠。(3)NF-κB报道基因质粒(pGL2-NF-κB-luc)由美国国立癌症研究院李建建博士馈赠。将质粒按常规方法转化大肠杆菌TG1，纯化质粒，酶切鉴定后，测定DNA浓度，置4℃保存。
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1.1.3抗体与试剂:LuciferaseAssaySystem购自美国Promega公司，PlasmidPurificationKit购自美国QIAGEN公司,LipofecTAMINE购自美国生命技术公司(GibcoBRL)。
1.2方法
1.2.1免疫共沉淀-Westernblotting:按ImmunoCATCHERkit说明操作，以B95-8细胞为阳性对照，将LMP1抗体与HNE2-LMP1、HNE2-pSG5、HNE2细胞裂解物温育，形成LMP1抗原-抗体复合物，12%SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至硝纤膜，再与TRAF2兔多克隆抗体温育12h，抗兔IgG-HRP温育1h，DAB显色法检测棕黄色条带。
在鼻咽癌活检组织中LMP1与TRAF2信号分子共表达于癌细胞的胞膜及胞浆同一部位的基础上，进一步用免疫共沉淀-Western-blotting方法探讨在鼻咽癌细胞系中LMP1是否结合TRAF2发挥作用。
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以B95-8细胞为阳性对照，在HNE2-LMP1、HNE2-pSG5及HNE2细胞系中，应用免疫共沉淀-Western-blotting方法，先用LMP1抗体免疫共沉淀下与之作用的信号分子，再用TRAF2抗体进行Western-blotting杂交分析，以证实LMP1是否与TRAF2作用。
1.2.2LipofectTAMINE介导的瞬间转染:按LipofecTAMINE转染说明书，转染前24小时将细胞种植于6孔细胞培养板中,待细胞生长至50%～80%的融合度时弃培养基。取2μgDNA稀释到100μl无血清培养基中，加入10μlLipofectamine，混匀后室温静置15min。加入800μl完全培养至DNA-Lipofectamine混合物中，混匀。培养细胞经D-Hank's液漂洗后，再将DNA-lipofectamine混合物加入，混匀。5%CO2培养箱37℃培养3h后，用D-Hank's液洗涤细胞，加入完全培养基继续培养直到收获。
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图1 鼻咽癌细胞系中TRAF2表达的免疫共沉淀Western-blotting分析1：Bq5-8;2:HNE2-LMp1;3:HNE2-PSG5;4:HNE2
图2 鼻咽癌细胞系中LMP1通过TRAF2活化NF-κB的报道基因分析
图3鼻咽癌细胞系中LMP1(1～231)通过TRAF2活化
NF-κB的报道基因分析
LMP1(1～231)可将NF-κB活性升高5.1倍，而TRAF2Δ6～86最大抑制75%NF-κB活性。
1.2.3荧光素酶活性分析:用LipofecTAMINE的方法将报道质粒瞬间转染入细胞，24h后，按LuciferaseAssaySystem的说明，加入100μl1×lysisbuffer，室温下裂解15min，用细胞刮子将细胞刮下，移至Eppendorf管内，室温离心12000r/min10min,取20μl上清液，加入100μl反应底物，迅速推入单光子检测仪，检测cpm值。间隔10s，每一样本读两个数值，取均值。然后以导入HNE2系cpm值为基数，计算LMP1或突变体HNE2系cpm值倍数。
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2 结果
2.1鼻咽癌细胞系中LMP1与TRAF2结合形成复合物沉淀
在HNE2-LMP1中LMP1与TRAF2形成复合物沉淀，其大小分别为75kDa，而HNE2--pSG5和HNE2为阴性(图1)。这表明在鼻咽癌细胞系中，LMP1与TRAF2信号分子结合而介导下游信号传导反应。
2.2鼻咽癌细胞系中LMP1通过TRAF2活化NF-κB
用含有HIVLTRκB元件的CMV启动子启动荧光素酶基因的表达来衡量与κB元件结合NF-κB活性,比较在两种细胞系(HNE2-LMP1及HNE2-pSG5)中NF-κB活性改变，结果发现HNE2-LMP1细胞系中NF-κB活性高达HNE2-pSG5中的12.4倍，说明LMP1活化NF-κB。随后将不同剂量TRAF2显性突变体及NF-κB报道质粒瞬时转染于HNE2-LMP1细胞系中，发现随着TRAF2显性突变体剂量递增，NF-κB活性递减，最大可下降50%。而TRAF2高水平表达则可将NF-κB活性增高20倍(图2)。这表明LMP1通过TRAF2活化NF-κB。
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同时，将不同剂量TRAF2显性突变体TRAF2Δ6～86和NF-κB报道质粒瞬间转染入HNE2-LMP1Δ187～351、HNE2-LMP1(1～231)细胞系中，结果发现，0.2μgTRAF2Δ6～86抑制LMP1(1～231)介导的75%NF-κB活性，1μg则抑制80%NF-κB活性(图3)。相反，0.2μgTRAF2Δ6～86抑制20%LMP1Δ187～351介导的NF-κB活性，而1μg则抑制40%(图4)。因此，TRAF2Δ6～86对LMP1(1～231)介导的NF-κB活性有强烈的抑制效果，而对LMP1Δ187～351介导NF-κB活性仅部分抑制。
2.3TRAF2显性负性突变体通过竞争性阻断TRAF2与LMP1结合而抑制NF-κB活性
在上述证明LMP1通过结合TRAF2活化NF-κB的基础上，我们进一步确定TRAF2Δ6～86是否通过与LMP1结合，从而阻断TRAF2与LMP1结合而抑制NF-κB活性。以转染或未转染TRAF2Δ6～86的HNE2-LMP1细胞系为材料，应用免疫共沉淀-Western-blotting方法，先用LMP1抗体将与之形成的信号传导复合物共沉淀下来，再用TRAF2抗体进行Western-blotting杂交分析。结果发现在同等剂量的LMP1免疫沉淀复合物中，转染TRAF2Δ6～86HNE2-LMP1细胞系中较单独HNE2-LMP1细胞系中内源性TRAF2少(图5)。说明TRAF2Δ6～86竞争性抑制TRAF2与LMP1结合，因此而下调LMP1激活NF-κB活性，因为TRAF2锌指结构是TRAF2活化NF-κB所必需的[4]。
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图4鼻咽癌细胞系中LMP1△187～351通过
TRAF2活化NF-κB的报道基因分析
LMP1Δ187～351可将NF-κB活性升高9.1倍，而TRAF2Δ6～86最大抑制45%NF-κB活性。
3 讨论
EB病毒是鼻咽癌发生的重要生物学因素，作为EB病毒的主要致瘤蛋白，LMP1在鼻咽癌发生过程中所起作用及机制一直是鼻咽癌分子致病机理中研究的热点。最近的研究表明，LMP1的作用与其介导细胞内的信号传导通路有关。在鼻咽癌中，我们已证实LMP1的表达能高水平持续激活NF-κB，这种活化与细胞恶性表型密切相关[3]。但是，LMP1激活NF-κB的机制尚不清楚。同时，还发现TRAF1在鼻咽癌中存在高表达，可能是LMP1通过NF-κB而促使之故。通过双染色法我们前期工作已确定鼻咽癌活检组织中LMP1与TRAF2共表达于鼻咽癌细胞同一胞膜或胞浆内。在此基础之上，我们采用免疫共沉淀-Western方法证实LMP1可直接与TRAF2结合,而在无LMP1表达的鼻咽癌细胞中，TRAF2弥散分布于细胞胞浆；进一步结合报道基因分析方法证实，在鼻咽癌中，LMP1通过TRAF2激活NF-κB。TRAF2显性负性突变体则通过与TRAF2竞争性结合LMP1而抑制LMP1介导的NF-κB活化。这表明在鼻咽癌中LMP1主要通过结合TRAF2而激活NF-κB。
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我们的实验进一步证实瞬时转染0.2μgTRAF2Δ6～86能阻止LMP1CTAR1介导的75%NF-κB活化，而转染1μgTRAF2△6～86仅阻止LMP1CTAR2介导的约40%NF-κB活化，提示LMP1主要是通过其CTAR1与TRAF2作用介导NF-κB活化，而CTAR2通过TRAF2仅介导部分NF-κB活化。这可能因为CTAR2先要聚集TRADD，TRADD进一步再聚集TRAF2才活化NF-κB；TRADD在此起着关键的作用。
这些证据进一步支持了LMP1类似TNFR的观点。象CD40、TNFRⅠ及TNFRⅡ一样，LMP1也主要通过TRAF2活化NF-κB。在无LMP1表达的HNE2中，TRAF2弥散于整个胞浆中，而在LMP1表达的HNE2中，LMP1发生聚集化而与TRAF2结合，这种结合可能是TRAF2活化NF-κB的关键步骤。这与以前的研究一致[4],即高表达的TRAF2因为能自身形成同源二聚体而诱导NF-κB活化。不过，TNFR通过与配体结合借助TRAF2对NF-κB激活可能是暂时的，而LMP1通过TRAF2激化NF-κB可能是持续性的。这种持续性活化的NF-κB进一步调节一些含κB基因表达，如抗凋亡蛋白A20、bcl-2、p53及一些细胞粘附分子(IFA1、ICAM2、IFA3)，从而参与细胞增殖、凋亡、分化及转化反应。这可能是作为EBV重复致瘤蛋白LMP1参与鼻咽癌癌变的重要机制之一。我们的实验将为我们进一步从信号传导通路来研究LMP1的致癌机制提供新的线索，也为我们以NF-κB为分子靶寻找鼻咽癌药物基因治疗途径提供重要的理论依据。
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基金项目：本课题受国家自然科学基金杰出青年基金(39525022)、美国中华医学基金(CMB96655)、国家自然科学基金重点项目(39830410)及国家重点基础研究发展规划(973)“恶性肿瘤发生发展的基础研究"项目资助
[参考文献]
1，王承兴,曹亚.EB病毒潜伏膜蛋白-1介导的信号传导[J].生物化学与生物物理学进展，1999,26(6),528～530.
2，Cahir E D,Farland M,Mosialos G,et al. Epstein-Barr virus transformation: involvement of latent membrane protein 1-mediated activation of NF-κ B [J]. Oncogene, 1999,18(19):6959～ 6964.
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3，潘雷，顾焕华，曹亚，等.鼻咽癌中EBVLMP1激活NF-κB的实验研究[J].中国耳鼻喉科颅底外科学杂志,1999,3(2):95～99.
4，Kaye K M, Devergne O, Harada J N, et al. TRAF2 is a mediator of NF-κ B activation by latent infection membrane protein 1, the Epstein-Barr virus transforming protein [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(5):11085～ 11090.
5，祝和成，姚开泰，李桂源，等.4株鼻咽癌上皮细胞株的建立及其生物学特性[J].湖南医科大学学报,1992,17(2)：103～107.
收稿日期：2000-04-10;修回日期：2000-04-29, 百拇医药