青心酮对豚鼠离体气管条张力的影响及其机制
作者：叶笃筠 吴萍 黄云峰 洪志刚 熊宗斌 余尚斌
单位：同济医科大学病理生理教研室 武汉 430030
关键词：青心酮；气管；平滑肌；张力
中草药000621摘 要 采用气管条浴槽实验方法，观察青心酮(DHAP)对离体豚鼠气管 螺旋条张力的影响。结果发现：DHAP明显松弛豚鼠的离体气管平滑肌；抑制由乙酰胆碱(Ach )、组胺(His)和氯化钾所致离体豚鼠气管平滑肌的收缩反应；对5-羟色胺(5-HT)诱 发 的由内钙释放引起的Ⅰ相收缩和外钙内流所致的Ⅱ相气管平滑肌收缩均有一定的抑制作用。 3.96×10-5 mol/L DHAP则仅抑制Ⅱ相收缩。随着其剂量的增大(>10-4 mol/ L)，Ⅰ相收缩也被抑制，上述抑制作用均呈剂量依赖性；消炎痛对DHAP松驰离体气管平滑肌 作用无明显影响。提示DHAP这一效应可能与其钙拮抗有关，而与其抑制环加氧酶的作用关系 则不甚密切。
, 百拇医药
Effect of 3,4-Dihydroxyacetophenone on Isolated Guine a-Pig Trachea and Its Mechanism of Action
Ye Duyun, Wu Ping, Huang Yunfeng, Hong Zhigang, Xiong Zongbin a nd Yu Shangbin
(Department of Pathophysiology, Tongji University of Medical Sciences Wuhan 430030)
Abstract The Effects of 3,4-dihydroxyacetophenone (DHAP) o n the tension of isolated guinea-pig trachea spirals were studied by tension re cording method. It was found that DHAP relaxed the basal tension and markedly d e pressed the contractile response induced by the spasmogens (Ach, histamin, KCl, 5-HT) in a concentration-dependent manner. But indomethacin, a cyclooxygenase inhibitor, showed no influence on the relaxant effect of DHAP against the contra ction of the spirals caused by Ach. DHAP could abolish the contraction induced b y 5-HT both in phase 1 (release of intracellular calcium) and phase 2 (entrance of extracellular calcium). These results suggested that the relaxant effect of DHAP on isolated guinea-pig trachea spirals may be resulted from a decreased co ncentration of intracellular calcium.
, 百拇医药
Key words 3,4-dihydroxyacetophenone trachea smooth muscle tension
青心酮(又名3，4-二羟基苯乙酮，DHAP)是从中药毛冬青Ilex pubescens Hook. et Arn.根中提取的有效成分。它能有效抑制家兔离体肺血管环的缺氧性肺血管 收 缩反应(HPV)[1]和降低慢性阻塞性疾病(COPD)患者的肺血管阻力等[2]。 继发现DHAP对豚鼠在体气道内压呈双相调解后，本文观察了DHAP对豚鼠离体气管条张力的影 响，并对其调控机制进行了初步研究，旨在为DHAP治疗COPD及支气管哮喘等呼吸道疾病提供 实验及理论依据。
1 材料
1.1 动物：健康成年雄性豚鼠，体重300～600 g，由同济医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 药物：2%青心酮由北京医药制药工业研究所馈赠；乌拉坦(上海普扬第二中学化工厂) ；乙酰胆碱和组胺(美国Sigma公司)；氯化钾(重庆北碚化学试剂厂)；Krebs-Henseleit (K -H)液pH 7.4，成分(mmol/L): NaCl 119, KCl 4.7, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2， NaHCO3 24，Glucose 11。
1.3 仪器:JH-1B-25型张力传感器(航空工业部)，RM-6000多道生理记录仪(NTHON KOHD EN)。
2 方法
2.1 气管环制备：20%乌拉坦(5 mL/kg)麻醉动物后，分离气管，按文献[3]方法 制成宽约5 mm、长20 mm螺旋条，悬挂于含K-H液浴槽中，通以95%O2+5%CO2的气体 以保持溶液中Po2>53.3 kPa，维持37 ℃恒温。气管条连接于张力换 能器，用生理记录仪记录 张力变化[4]。实验前气管条均在1.5 g初张力下平衡1 h，用Ach(20 μmol/L)预 收缩气管条2～3次，以达到最大收缩，新鲜K-H液冲冼、平衡后再进行实验。整个实验过程 中每15 min更换新鲜K-H液1次。
, 百拇医药
2.2 对气管条基础张力的影响：气管条经平衡后，分别在浴槽中加入不同剂量的DHAP (1 .98×10-5、3.96×10-5、7.92×10-5和1.58×10-4 mol/L) 。记录给药后1 h内张力变化。
2.3 对致痉剂收缩反应的影响：在浴槽中分别加入20 μmol/L Ach、20 μmol/L His和 15 μmol/L KCl等致痉剂以诱发气管条收缩并记录其张力，待收缩力达到坪值时，再在浴 槽中以累积给药法加入DHAP并观察张力变化，分别求出IC50。
2.4 消炎痛对DHAP扩张气管作用的影响：气管条经平衡后，分别在浴槽中加入1×10 -4 mol/L消炎痛或等容积溶媒，然后在浴槽中加入20 μmol/L Ach，待收缩达到坪值时 再在浴槽中以累加法加入DHAP，并观察张力变化。
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2.5 对5-羟色胺(5-HT)所致两种收缩成分的影响：以无钙K-H液温育气管条30 min后， 先加入5-HT 15 μmol/L，待收缩达到坪值时再加入CaCl2 2.5 mmol/L，使气管条进一 步收缩并稳定，换正常K-H液3次，平衡约30～45 min直至基线稳定，再分别加入3.98×10 -5和1×10-4 mol/L DHAP，温育10 min重复上述步骤，并观察张力的变化。
3 结果
3.1 对气管条基础张力的影响：给1.98×10-5 mol/L DHAP 10 min后，正常豚鼠 离体气管条张力一过性轻度增加，但无统计学意义(P>0.05)；随DHAP浓 度的累加，气管条张力呈剂量依赖性抑制(P<0.01)，持续时间>60 min (图1)。
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A-1.98×10-5 mol/L B-3.96×10-5 mol /L
C-7.92×10-5 mol/L D-1.58×10-4 mol/L
图1 不同浓度DHAP对豚鼠离体气管条
基础张力的影 响
3.2 对致痉剂收缩反应的影响：如图2所示，DHAP对Ach、His和KCl所致离体豚鼠气管收缩 呈剂量依赖性抑制。IC50值分别为：1.91×10-4、3.1×10-4及2 .1×10-4 mol/L。
, 百拇医药
A-K-H液 B，C，D-无钙K-H液 C-3.96×10-5μmol/L D HAP预处理 D-10-4 μmol/L DHAP预处理 a-加入CaCl2 25 mmol/L
图2 DHAP对5-HT(15 μmol/L)所致两种
收缩成分的影响
3.3 消炎痛对DHAP扩张气管作用的影响：结果表明消炎痛虽使DHAP抑制Ach所致气管收缩 的曲 线右移，但与对照组比较，二者IC50值及DHAP各浓度组抑制率经统计学处理均无明显 差异。
3.4 对5-HT所致两种收缩成分的影响：如图2所示，DHAP对5-HT所致气管平滑肌依内钙 释放引起的Ⅰ相收缩和对外钙内流引起的Ⅱ相收缩均有明显抑制。在DHAP的终浓度为3.96 ×10-4 μmol/L时，仅外钙内流引起的Ⅱ相收缩被抑制，随着其浓度的加大，DHAP对 内钙释放引起的Ⅰ相收缩也有明显抑制作用，其抑制率可达100%
, 百拇医药
3 讨论
本研究证实DHAP能松弛正常豚鼠离体气管条；对由Ach、His、KCl及5-HT等所致的豚鼠离体 气管收缩亦有一定的抑制作用。鉴于其对正常的气管张力和众多的致痉剂所致的气管痉挛均 有松弛作用，故推测DHAP扩张气管的作用环节极有可能在受体后而非抑制受体或/和拮抗第 一信使。
在以往对DHAP扩张血管的作用机制的研究中，DHAP抑制花生四烯酸代谢途径中环加氧酶的作 用被认为是其扩张血管的重要作用机制之一[6]，推测DHAP可能是一环加氧酶抑制 剂。然而，本实验发现经典的环加氧酶抑制剂消炎痛则对DHAP的松弛气管平滑肌的作用无明 显影响。由此可见，DHAP松弛气管的作用也许不是通过改变花生四烯酸代谢中的环加氧酶代 谢途径。有人认为DHAP的钙拮抗作用在DHAP扩张人脐血管机制中占有重要地位，推测DHAP为 一非竟争性外钙内流拮抗剂。但未对其是否有抑制内钙释放进行研究。5-HT能激活其受体 操纵钙通道，同时释放胞内侧结合钙和贮存钙[7]。本实验的结果也表明：DHAP在 低剂量能有效地抑制豚鼠离体气管平滑肌由5-HT诱发的外钙内流引起的Ⅱ相收缩，随着剂 量的增加其对内钙释放引起的Ⅰ相收缩也有明显抑制作用。故认为DHAP松弛豚鼠离体气管的 作用也与其钙拮抗作用有关，且以抑制外钙内流作用为主。
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总之，DHAP能松弛正常豚鼠的离体气管；抑制由Ach、His、NaCl和5-HT的离体豚鼠气管平 滑肌的收缩反应；抑制由5-HT诱发的气管平滑肌细胞由内钙释放和外钙内流引起的Ⅱ相收 缩；结合我们过去的实验已证明DHAP能扩张肺血管和降低肺血管阻力，表明DHAP有可能成为 治疗慢性阻塞性肺病、支气管哮喘和肺动脉高压等具有一定开发利用价值的药物。
叶笃筠 男，44岁，1982年毕业于同济医科大学，1987年获硕士学位，1989～1991年在德国 自由大学热带病研究所进修，现在同济医科大学病理生理教研室暨卫生部呼吸系统病重点实 验室工作，副教授。主要从事呼吸系疾病发病机制和活血化瘀中药药理机制研究。先后主持 国家自然科学基金课题3项、卫生部和湖北省卫生厅课题各1项。
参 考 文 献
1，Farman Ullah, et al. J Tongji Medical Uni, 1994, 14(3 ):252
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2，林春龙，等.中华结核与呼吸病杂志，1995，18(2)：97
3，杨秋火，等.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982：906
4，黄引平，等.中华妇产科杂志，1993，28(3)：333
5，洪志刚，等.实用肺科杂志，1998，5(4)：12
6，Yang D S, et al. Prostaglandins. 1989, 38(4):497
7，Janis R A, et al. J Med Chem, 1983, 26:775
(1999-11-29 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学病理生理教研室 武汉 430030
关键词：青心酮；气管；平滑肌；张力
中草药000621摘 要 采用气管条浴槽实验方法，观察青心酮(DHAP)对离体豚鼠气管 螺旋条张力的影响。结果发现：DHAP明显松弛豚鼠的离体气管平滑肌；抑制由乙酰胆碱(Ach )、组胺(His)和氯化钾所致离体豚鼠气管平滑肌的收缩反应；对5-羟色胺(5-HT)诱 发 的由内钙释放引起的Ⅰ相收缩和外钙内流所致的Ⅱ相气管平滑肌收缩均有一定的抑制作用。 3.96×10-5 mol/L DHAP则仅抑制Ⅱ相收缩。随着其剂量的增大(>10-4 mol/ L)，Ⅰ相收缩也被抑制，上述抑制作用均呈剂量依赖性；消炎痛对DHAP松驰离体气管平滑肌 作用无明显影响。提示DHAP这一效应可能与其钙拮抗有关，而与其抑制环加氧酶的作用关系 则不甚密切。
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Effect of 3,4-Dihydroxyacetophenone on Isolated Guine a-Pig Trachea and Its Mechanism of Action
Ye Duyun, Wu Ping, Huang Yunfeng, Hong Zhigang, Xiong Zongbin a nd Yu Shangbin
(Department of Pathophysiology, Tongji University of Medical Sciences Wuhan 430030)
Abstract The Effects of 3,4-dihydroxyacetophenone (DHAP) o n the tension of isolated guinea-pig trachea spirals were studied by tension re cording method. It was found that DHAP relaxed the basal tension and markedly d e pressed the contractile response induced by the spasmogens (Ach, histamin, KCl, 5-HT) in a concentration-dependent manner. But indomethacin, a cyclooxygenase inhibitor, showed no influence on the relaxant effect of DHAP against the contra ction of the spirals caused by Ach. DHAP could abolish the contraction induced b y 5-HT both in phase 1 (release of intracellular calcium) and phase 2 (entrance of extracellular calcium). These results suggested that the relaxant effect of DHAP on isolated guinea-pig trachea spirals may be resulted from a decreased co ncentration of intracellular calcium.
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Key words 3,4-dihydroxyacetophenone trachea smooth muscle tension
青心酮(又名3，4-二羟基苯乙酮，DHAP)是从中药毛冬青Ilex pubescens Hook. et Arn.根中提取的有效成分。它能有效抑制家兔离体肺血管环的缺氧性肺血管 收 缩反应(HPV)[1]和降低慢性阻塞性疾病(COPD)患者的肺血管阻力等[2]。 继发现DHAP对豚鼠在体气道内压呈双相调解后，本文观察了DHAP对豚鼠离体气管条张力的影 响，并对其调控机制进行了初步研究，旨在为DHAP治疗COPD及支气管哮喘等呼吸道疾病提供 实验及理论依据。
1 材料
1.1 动物：健康成年雄性豚鼠，体重300～600 g，由同济医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 药物：2%青心酮由北京医药制药工业研究所馈赠；乌拉坦(上海普扬第二中学化工厂) ；乙酰胆碱和组胺(美国Sigma公司)；氯化钾(重庆北碚化学试剂厂)；Krebs-Henseleit (K -H)液pH 7.4，成分(mmol/L): NaCl 119, KCl 4.7, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2， NaHCO3 24，Glucose 11。
1.3 仪器:JH-1B-25型张力传感器(航空工业部)，RM-6000多道生理记录仪(NTHON KOHD EN)。
2 方法
2.1 气管环制备：20%乌拉坦(5 mL/kg)麻醉动物后，分离气管，按文献[3]方法 制成宽约5 mm、长20 mm螺旋条，悬挂于含K-H液浴槽中，通以95%O2+5%CO2的气体 以保持溶液中Po2>53.3 kPa，维持37 ℃恒温。气管条连接于张力换 能器，用生理记录仪记录 张力变化[4]。实验前气管条均在1.5 g初张力下平衡1 h，用Ach(20 μmol/L)预 收缩气管条2～3次，以达到最大收缩，新鲜K-H液冲冼、平衡后再进行实验。整个实验过程 中每15 min更换新鲜K-H液1次。
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2.2 对气管条基础张力的影响：气管条经平衡后，分别在浴槽中加入不同剂量的DHAP (1 .98×10-5、3.96×10-5、7.92×10-5和1.58×10-4 mol/L) 。记录给药后1 h内张力变化。
2.3 对致痉剂收缩反应的影响：在浴槽中分别加入20 μmol/L Ach、20 μmol/L His和 15 μmol/L KCl等致痉剂以诱发气管条收缩并记录其张力，待收缩力达到坪值时，再在浴 槽中以累积给药法加入DHAP并观察张力变化，分别求出IC50。
2.4 消炎痛对DHAP扩张气管作用的影响：气管条经平衡后，分别在浴槽中加入1×10 -4 mol/L消炎痛或等容积溶媒，然后在浴槽中加入20 μmol/L Ach，待收缩达到坪值时 再在浴槽中以累加法加入DHAP，并观察张力变化。
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2.5 对5-羟色胺(5-HT)所致两种收缩成分的影响：以无钙K-H液温育气管条30 min后， 先加入5-HT 15 μmol/L，待收缩达到坪值时再加入CaCl2 2.5 mmol/L，使气管条进一 步收缩并稳定，换正常K-H液3次，平衡约30～45 min直至基线稳定，再分别加入3.98×10 -5和1×10-4 mol/L DHAP，温育10 min重复上述步骤，并观察张力的变化。
3 结果
3.1 对气管条基础张力的影响：给1.98×10-5 mol/L DHAP 10 min后，正常豚鼠 离体气管条张力一过性轻度增加，但无统计学意义(P>0.05)；随DHAP浓 度的累加，气管条张力呈剂量依赖性抑制(P<0.01)，持续时间>60 min (图1)。
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A-1.98×10-5 mol/L B-3.96×10-5 mol /L
C-7.92×10-5 mol/L D-1.58×10-4 mol/L
图1 不同浓度DHAP对豚鼠离体气管条
基础张力的影 响
3.2 对致痉剂收缩反应的影响：如图2所示，DHAP对Ach、His和KCl所致离体豚鼠气管收缩 呈剂量依赖性抑制。IC50值分别为：1.91×10-4、3.1×10-4及2 .1×10-4 mol/L。
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A-K-H液 B，C，D-无钙K-H液 C-3.96×10-5μmol/L D HAP预处理 D-10-4 μmol/L DHAP预处理 a-加入CaCl2 25 mmol/L
图2 DHAP对5-HT(15 μmol/L)所致两种
收缩成分的影响
3.3 消炎痛对DHAP扩张气管作用的影响：结果表明消炎痛虽使DHAP抑制Ach所致气管收缩 的曲 线右移，但与对照组比较，二者IC50值及DHAP各浓度组抑制率经统计学处理均无明显 差异。
3.4 对5-HT所致两种收缩成分的影响：如图2所示，DHAP对5-HT所致气管平滑肌依内钙 释放引起的Ⅰ相收缩和对外钙内流引起的Ⅱ相收缩均有明显抑制。在DHAP的终浓度为3.96 ×10-4 μmol/L时，仅外钙内流引起的Ⅱ相收缩被抑制，随着其浓度的加大，DHAP对 内钙释放引起的Ⅰ相收缩也有明显抑制作用，其抑制率可达100%
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3 讨论
本研究证实DHAP能松弛正常豚鼠离体气管条；对由Ach、His、KCl及5-HT等所致的豚鼠离体 气管收缩亦有一定的抑制作用。鉴于其对正常的气管张力和众多的致痉剂所致的气管痉挛均 有松弛作用，故推测DHAP扩张气管的作用环节极有可能在受体后而非抑制受体或/和拮抗第 一信使。
在以往对DHAP扩张血管的作用机制的研究中，DHAP抑制花生四烯酸代谢途径中环加氧酶的作 用被认为是其扩张血管的重要作用机制之一[6]，推测DHAP可能是一环加氧酶抑制 剂。然而，本实验发现经典的环加氧酶抑制剂消炎痛则对DHAP的松弛气管平滑肌的作用无明 显影响。由此可见，DHAP松弛气管的作用也许不是通过改变花生四烯酸代谢中的环加氧酶代 谢途径。有人认为DHAP的钙拮抗作用在DHAP扩张人脐血管机制中占有重要地位，推测DHAP为 一非竟争性外钙内流拮抗剂。但未对其是否有抑制内钙释放进行研究。5-HT能激活其受体 操纵钙通道，同时释放胞内侧结合钙和贮存钙[7]。本实验的结果也表明：DHAP在 低剂量能有效地抑制豚鼠离体气管平滑肌由5-HT诱发的外钙内流引起的Ⅱ相收缩，随着剂 量的增加其对内钙释放引起的Ⅰ相收缩也有明显抑制作用。故认为DHAP松弛豚鼠离体气管的 作用也与其钙拮抗作用有关，且以抑制外钙内流作用为主。
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总之，DHAP能松弛正常豚鼠的离体气管；抑制由Ach、His、NaCl和5-HT的离体豚鼠气管平 滑肌的收缩反应；抑制由5-HT诱发的气管平滑肌细胞由内钙释放和外钙内流引起的Ⅱ相收 缩；结合我们过去的实验已证明DHAP能扩张肺血管和降低肺血管阻力，表明DHAP有可能成为 治疗慢性阻塞性肺病、支气管哮喘和肺动脉高压等具有一定开发利用价值的药物。
叶笃筠 男，44岁，1982年毕业于同济医科大学，1987年获硕士学位，1989～1991年在德国 自由大学热带病研究所进修，现在同济医科大学病理生理教研室暨卫生部呼吸系统病重点实 验室工作，副教授。主要从事呼吸系疾病发病机制和活血化瘀中药药理机制研究。先后主持 国家自然科学基金课题3项、卫生部和湖北省卫生厅课题各1项。
参 考 文 献
1，Farman Ullah, et al. J Tongji Medical Uni, 1994, 14(3 ):252
, http://www.100md.com
2，林春龙，等.中华结核与呼吸病杂志，1995，18(2)：97
3，杨秋火，等.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982：906
4，黄引平，等.中华妇产科杂志，1993，28(3)：333
5，洪志刚，等.实用肺科杂志，1998，5(4)：12
6，Yang D S, et al. Prostaglandins. 1989, 38(4):497
7，Janis R A, et al. J Med Chem, 1983, 26:775
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