应力松弛接骨板对骨折愈合胶原基因表达及细胞超微结构的影响
作者：张先龙 戴戎 汤亭亭
单位：张先龙(200011上海第二医科大学附属第九人民医院骨科；现在上海市第六人民医院骨科)；戴戎 汤亭亭(200011上海第二医科大学附属第九人民医院骨科)
关键词：骨折愈合；基因表达；成骨细胞
中华骨科杂志000612
【摘要】目的观察采用应力松弛接骨板固定对骨折愈合的影响及机制。方法对24只新西兰兔两侧胫骨干截骨，分别采用应力松弛接骨板和坚硬接骨板固定，术后2、4及8周采用核酸原位杂交技术和透射电镜观察骨折愈合过程中骨痂胶原mRNA的表达及细胞超微结构变化。结果骨折后2周，应力松弛接骨板组骨痂内见较多功能活跃的成骨细胞和成软骨细胞，分别表达Ⅰ型和Ⅱ型胶原mRNA；4周时成骨细胞数量明显增加，功能更加活跃，Ⅰ型胶原表达水平也达到高峰。此时活跃的破骨细胞开始出现；8周时仍可见到较多功能活跃的成骨细胞、破骨细胞及I型胶原mRNA表达。而坚硬接骨板组2、4周时，成骨细胞数量及功能均不及应力松弛接骨板组；8周时破骨细胞功能活跃，伴有相邻骨细胞骨溶解现象。结论应力松弛接骨板的应力松弛作用，促进了局部间充质细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化，并且高水平表达Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA，有利于骨痂改建的顺利进行。
, 百拇医药
The influence of stress-relaxation plate on collagen gene expression and cellular ultrastructure of fracture healing
ZHANG Xianlong，DAI Kerong，TANG Tingting.
(Department of Orthopaedics,The Ninth People's Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011,China)
【Abstract】 Objective To investigate the influence of stress-relaxation plate on fracture healing and its mechanism. Methods Twenty-four New Zealand rabbits were used in this study. Bilateral tibia were osteotomized in the middle and fixed with stress-relaxation plate (group SRP) and rigid plate (group RP) respectively. The transmission electron microscopy (TEM)examination and analysis of collagen mRNA expression in situ hybridization were compared between SRP group and RP group during 2-8 weeks postoperatively. Results In SRP group, the TEM observation and in situ hybridization study showed that a great number of osteoblasts and chondroblasts with high functional activity emerged and expressed high levels of typeⅠ andⅡ collagen mRNA respectively 2 weeks after operation. By 4 weeks after fracture, more and more osteoblasts appeared without chondroblasts, the level of expressing typeⅠ collagen mRNA also amounted to a peak. The active osteoclasts also emerged at this time. These signs continued until 8 weeks postoperatively. While in RP group, no chondroblasts could be seen at the early stage of fracture, both the number and functional activity of osteoblasts were lower than those of the SRP group. By 8 weeks after implantion, the osteoblasts were seldom found, meanwhile, the osteoclasts become more active accompanied with signs of osteocytic osteolysis, which indicate the prevailed resorption process in the remodelling stage. In addition, there were only expression of type Ⅰ collagen mRNA during the different periods after operation, and the level of expression was lower than that of the SRP group. Conclusion Stress-relaxation of SRP stimulates the osteogenetic cells differentiated into osteoblast and chondroblast, which express high level of type Ⅰ and type Ⅱ collagen mRNA respectively; it also benefits callus remodelling.
, 百拇医药
【Key words】Fracture healing; Gene expression;Osteoblasts
坚硬接骨板(rigidplate,RP)强大的应力遮挡作用是造成固定骨段骨质疏松、骨折异常愈合以及再骨折的主要原因之一。为此，我们在传统坚硬接骨板螺孔内加一个具有蠕变性能的粘弹性聚乙烯垫圈，构成应力松弛接骨板(stress-relaxationplate,SRP)，体外力学测试研究表明，该系统的应力遮挡率可随固定时间的延长而逐渐下降[1]。动物实验研究发现，8周时垫圈已出现了明显的变形、撕裂和破坏，而应力松弛接骨板所导致的板下骨吸收和骨结构紊乱明显低于作为对照的坚硬接骨板组[2]。本实验以新西兰兔胫骨干截骨为骨折模型，采用透射电镜观察与核酸原位杂交技术，对SRP固定骨折愈合过程中细胞超微结构特征和胶原基因的表达进行系统研究，并与坚硬接骨板固定相比较，以阐明SRP固定对骨折愈合影响的细胞生物学和分子生物学基础。
, 百拇医药
图1 术后2周,SRP组见功能活跃的成骨细胞，周围有周期性胶原纤丝透射电镜×8000
材料与方法
一、接骨板与垫圈
以316L不锈钢制成四孔接骨板螺丝钉。接骨板规格为40mm×7mm×2mm，螺孔直径2.2mm，螺丝钉外径2mm，长12mm。另以超高分子聚乙烯制成空心垫圈，外径2.2mm，内径2mm，高1.5mm。
二、动物实验及观察方法
健康成年新西兰兔24只，体重2.5～3.0kg。质量浓度为2.5%戊巴比妥钠自耳缘静脉麻醉后，手术显露双侧胫骨中段，横形截骨后，左侧以坚硬接骨板内固定(RP)作为对照组，右侧在4个螺孔内均加放垫圈即应力松弛接骨板(SRP)内固定。螺丝钉均使用电动螺丝刀(800型，四川华昌机械厂制)以0.4N·cm统一扭矩拧紧。术后动物分笼饲养，自由活动，所有动物分为3组，每组8只，分别于术后2、4、8周处死取材，作如下观察。
, 百拇医药
(一)透射电镜观察:每组每批4只动物按期处死，在骨折端取2mm×2mm×2mm大小骨块(含连接骨痂和外骨痂)，透射电镜观察。
(二)骨痂组织Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA表达的原位杂交分析
1.组织切片制备:每组4只动物，按期处死，按原位杂交要求，无mRNA酶操作截取内侧两螺孔间骨段5mm，质量浓度为4%多聚甲醛固定，质量浓度为10%EDTA(pH7.4)脱钙10d，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做5μm纵向连续切片3张，置60℃温箱24h，移入4℃冰箱备用。
2.探针制备:含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原α1链cDNA片段的重组质粒分别是PHCAL1-U、RCOLα1-1、pHFS3(均由芬兰Turku大学赠送)，参照Sandberg等[3]文献资料，分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型重组质粒酶切制成胶原探针，长度为450bp、400bp及300bp左右，采用随机引物法，应用Dig-Highprime将探针标记上Dig-11-dUTP。
, 百拇医药
3.原位杂交:切片经二甲苯脱蜡，乙醇水化、蛋白酶K消化、醋酸酐酸化等杂交前处理后，每片滴加杂交液40μl(探针终浓度2μg/ml)，经杂交后漂洗，1∶1000Dig抗体孵育2h，显色液显色，HE复染，光镜观察。
4.对照设立:空白对照，相邻切片平行操作，杂交液中不加标记探针；阴性对照，杂交前以RNA消化酶处理切片。
结果
一、透射电镜观察
术后2周，SRP组:断端间隙骨痂与外骨痂内均见较多功能活跃的成骨细胞，细胞形态为长柱形，核呈梭形或长形，核仁明显，胞浆内有丰富的粗面内质网，细胞周围见640?周期胶原纤丝形成，排列整齐(图1)。外骨痂内可见较多功能仍较旺盛的成软骨细胞，核圆形或椭圆形，胞质内见有大量粗面内质网和高尔基体，胞膜呈扇蛤样或绒毛状，周围见许多细小的胶原纤丝，排列不整齐，无周期性。RP组:仅见成骨细胞，功能不活跃。两组2周时，均见有变性、老化的成纤维细胞，细胞器不发达。
, 百拇医药
术后4周,SRP组:外骨痂内成骨细胞不仅数量增多，而且功能极为活跃，并见成骨细胞分裂、增殖现象，无核膜，染色质集中于核心两端，中间呈环状。4周时大部分软骨细胞变性坏死(图2)，骨表面破骨细胞开始出现，多核，胞浆丰富，内见大量线粒体、高尔基体、微丝及小泡。周围有已被部分吸收的胶原纤丝(图3)。RP组:骨痂内见较多扁平状成骨细胞，细胞器不发达。
术后8周，SRP组:编织骨表面仍见较多成骨细胞，功能活跃，破骨细胞功能亦相当活跃，与骨接触面皱折缘明显，周围为钙化基质，吞饮小泡内见吞噬的钙盐颗粒。RP组:成骨细胞数量少，功能不活跃，破骨细胞功能活跃，皱折缘侧见较多吞噬的钙颗粒，相邻骨细胞呈溶骨相，陷窝扩大，核固缩、溶解，周围见崩解基质。
图2 术后4周,SRP组软骨细胞变性坏死透射电镜×3000
, 百拇医药
图3 术后4周,SRP组见功能活跃的破骨细胞透射电镜×10000
二、原位杂交分析
术后2周，SRP组见原始骨小梁表面成骨细胞和骨小梁之间骨髓生成细胞表达Ⅰ型胶原mRNA，阳性颗粒呈深紫色(图4)。并见许多软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA，主要限于软骨骨痂分化区和增殖区具有软骨细胞表型的细胞上。肥大软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平较低，未见Ⅲ型胶原mRNA表达。RP组:骨小梁表面亦见成骨细胞表达Ⅰ型mRNA，但表达水平不高，Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA未见表达。
图4 术后2周,SRP组骨小梁表面成骨细胞表达Ⅰ型胶原mRNA原位杂交×400 图5 术后4周,SRP组成骨细胞广泛表达Ⅰ型胶原mRNA，深紫色颗粒浓聚成团原位杂交×200
, http://www.100md.com
术后4周,SRP组:骨表面成骨细胞成层排列，广泛表达Ⅰ型胶原mRNA，部分成骨细胞内深紫色颗粒增多，密集，浓聚成团(图5)。此时，未见Ⅱ型胶原mRNA表达。RP组：成骨细胞表达Ⅰ型mRNA亦相应增多，但阳性杂交颗粒信号明显较SRP组弱。
术后8周SRP组，骨表达仍可见到表达Ⅰ型胶原mRNA的成骨细胞，但无论是细胞数量还是表达水平均不及术后4周。RP组则很少见到骨表面细胞表达Ⅰ型胶原mRNA。
讨论
一、应力松弛接骨板对骨折愈合细胞超微结构的影响
(一)成骨细胞和成软骨细胞
成骨细胞在骨折愈合过程中起着决定性的作用。研究发现SRP组功能活跃的成骨细胞大量出现在骨折后14d，且持续增加。4周时达顶峰。成骨细胞出现较早，数量多，功能活跃，持续时间长，为SRP固定、大量膜内成骨为骨痂的迅速形成提供了基础。此外，我们在术后2周SRP组骨痂中还观察到功能活跃的成软骨细胞，数量较多，持续时间短暂，至术后4周，大部分软骨细胞变性、坏死。
, 百拇医药
成软骨细胞的出现表明SRP固定骨折愈合确实经历了软骨内化骨阶段。
现代理论认为[4，5]，骨折早期骨折段细微运动促进骨折端骨痂的形成和钙化，显示了良好的骨诱导和骨传导作用。由于截骨间隙的存在和SRP的应力松弛作用，当动物早期自由活动时，骨折端不可避免地存在极细微的运动，骨折局部应力刺激增加。虽然我们在体内应力遮挡率变化研究中发现早期这种应力变化可能很小，但骨折部修复组织对力学环境的敏感性非常强，使这种较小的应力刺激仍可能通过促进局部释放生长因子等活性物质来调节细胞的活化、增殖和分化，促进骨基质形成。与上述变化形成鲜明对比的是RP固定组几乎见不到功能活跃的成骨细胞。骨折后不同时期均未见成软骨细胞或软骨细胞。说明稳定力学环境对骨折愈合细胞的分化和超微结构的变化影响不大。
(二)破骨细胞与骨细胞
破骨细胞的出现，标志着骨痂改建的开始。实验中两组均在4周时出现破骨细胞，但SRP组破骨细胞功能活跃，皱折缘典型，透亮区小泡内见钙盐颗粒。这种现象到8周时尤为明显，说明此时骨吸收已相当明显。同时，骨表面成骨细胞功能也很活跃，表明SRP固定的骨痂骨改建已进入正常的良性循环。相反，RP组8周时，破骨细胞功能明显活跃，骨基质中新形成的骨细胞亦呈溶骨相。这种骨细胞性骨溶解现象的发生加剧了RP组骨痂改建中的骨吸收过程，骨改建呈现异常。实验结果证明，SRP应力松弛过程中，骨折端逐渐增加的应力刺激，不仅促进了骨折局部间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞，增强其合成代谢功能，而且亦有利于骨痂改建的顺利进行。
, http://www.100md.com
二、应力松弛接骨板对骨折愈合胶原mRNA表达的影响
实验结果表明，SRP对骨折愈合胶原mRNA表达类型和表达水平均有重要影响。SRP组2周时主要为Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA表达，其中Ⅱ型胶原mRNA表达进一步从分子水平证明了SRP固定下骨折愈合的确经历了软骨内化骨阶段。4周时，成骨细胞表达Ⅰ型胶原mRNA水平达到高峰，而RP组自始至终只有Ⅰ型胶原表达，且表达水平在2～4周时明显低于SRP组，这种胶原mRNA表达类型和表达水平上的差异可能与两种接骨板固定所建立的力学环境不同有关。众所周知，在骨折愈合过程中细胞的功能在早期是受力学环境控制的。SRP特有的应力松弛作用，使固定装置刚度逐渐下降，骨折较早承受了一定应力刺激，这种应力刺激促进了间充质细胞的分化和功能活跃，胶原表达增加。而RP固定,持续稳定在低应力环境下，细胞得不到应力刺激，因而功能亦不活跃，胶原表达水平不高。这一结果与超微结构研究的结果基本一致。
由此可见，应力松弛接骨板对骨折愈合的影响是通过影响细胞的分化和功能而得以实现的，这种对细胞功能的影响具体体现在细胞超微结构和胶原mRNA表达水平的变化上，二者的变化在时间和空间上密切相关，极为一致。而对于力学信号被骨细胞感受，转化为分子信号的过程，尚有待于进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470698)
参考文献
1，王开友,戴
戎，薛文东.应力松弛接骨板对骨应力遮挡率影响的实验研究.医用生物力学,1995,10:224-227.
2，戴戎，戴闽，王开友，等.应力松弛接骨板对骨几何形态和力学性能影响的实验研究.中华医学杂志,1995,75:414-416.
3，Sandberg M, Vuorio E. Localization of types Ⅰ ,Ⅱ and Ⅲ collagen mRNAs in developing human skeletal tissues by in situ hybridization. J Cell Biol, 1987, 104:1077-1084.
, http://www.100md.com
4，Kenwright J, Goodship AE. Controlled mechanical stimulation in the treatment of tibia fractures. Clin Orthop, 1989, (241):36-47.
5，Clase LE, Wilke HJ, Augat P, et al. Effect of dynamization on gap healing of diaphyseal fractures under external fixation. Clin Biomech, 1995, 10:227-233.
(收稿日期：1999-05-31), 百拇医药
单位：张先龙(200011上海第二医科大学附属第九人民医院骨科；现在上海市第六人民医院骨科)；戴戎 汤亭亭(200011上海第二医科大学附属第九人民医院骨科)
关键词：骨折愈合；基因表达；成骨细胞
中华骨科杂志000612
【摘要】目的观察采用应力松弛接骨板固定对骨折愈合的影响及机制。方法对24只新西兰兔两侧胫骨干截骨，分别采用应力松弛接骨板和坚硬接骨板固定，术后2、4及8周采用核酸原位杂交技术和透射电镜观察骨折愈合过程中骨痂胶原mRNA的表达及细胞超微结构变化。结果骨折后2周，应力松弛接骨板组骨痂内见较多功能活跃的成骨细胞和成软骨细胞，分别表达Ⅰ型和Ⅱ型胶原mRNA；4周时成骨细胞数量明显增加，功能更加活跃，Ⅰ型胶原表达水平也达到高峰。此时活跃的破骨细胞开始出现；8周时仍可见到较多功能活跃的成骨细胞、破骨细胞及I型胶原mRNA表达。而坚硬接骨板组2、4周时，成骨细胞数量及功能均不及应力松弛接骨板组；8周时破骨细胞功能活跃，伴有相邻骨细胞骨溶解现象。结论应力松弛接骨板的应力松弛作用，促进了局部间充质细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化，并且高水平表达Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA，有利于骨痂改建的顺利进行。
, 百拇医药
The influence of stress-relaxation plate on collagen gene expression and cellular ultrastructure of fracture healing
ZHANG Xianlong，DAI Kerong，TANG Tingting.
(Department of Orthopaedics,The Ninth People's Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011,China)
【Abstract】 Objective To investigate the influence of stress-relaxation plate on fracture healing and its mechanism. Methods Twenty-four New Zealand rabbits were used in this study. Bilateral tibia were osteotomized in the middle and fixed with stress-relaxation plate (group SRP) and rigid plate (group RP) respectively. The transmission electron microscopy (TEM)examination and analysis of collagen mRNA expression in situ hybridization were compared between SRP group and RP group during 2-8 weeks postoperatively. Results In SRP group, the TEM observation and in situ hybridization study showed that a great number of osteoblasts and chondroblasts with high functional activity emerged and expressed high levels of typeⅠ andⅡ collagen mRNA respectively 2 weeks after operation. By 4 weeks after fracture, more and more osteoblasts appeared without chondroblasts, the level of expressing typeⅠ collagen mRNA also amounted to a peak. The active osteoclasts also emerged at this time. These signs continued until 8 weeks postoperatively. While in RP group, no chondroblasts could be seen at the early stage of fracture, both the number and functional activity of osteoblasts were lower than those of the SRP group. By 8 weeks after implantion, the osteoblasts were seldom found, meanwhile, the osteoclasts become more active accompanied with signs of osteocytic osteolysis, which indicate the prevailed resorption process in the remodelling stage. In addition, there were only expression of type Ⅰ collagen mRNA during the different periods after operation, and the level of expression was lower than that of the SRP group. Conclusion Stress-relaxation of SRP stimulates the osteogenetic cells differentiated into osteoblast and chondroblast, which express high level of type Ⅰ and type Ⅱ collagen mRNA respectively; it also benefits callus remodelling.
, 百拇医药
【Key words】Fracture healing; Gene expression;Osteoblasts
坚硬接骨板(rigidplate,RP)强大的应力遮挡作用是造成固定骨段骨质疏松、骨折异常愈合以及再骨折的主要原因之一。为此，我们在传统坚硬接骨板螺孔内加一个具有蠕变性能的粘弹性聚乙烯垫圈，构成应力松弛接骨板(stress-relaxationplate,SRP)，体外力学测试研究表明，该系统的应力遮挡率可随固定时间的延长而逐渐下降[1]。动物实验研究发现，8周时垫圈已出现了明显的变形、撕裂和破坏，而应力松弛接骨板所导致的板下骨吸收和骨结构紊乱明显低于作为对照的坚硬接骨板组[2]。本实验以新西兰兔胫骨干截骨为骨折模型，采用透射电镜观察与核酸原位杂交技术，对SRP固定骨折愈合过程中细胞超微结构特征和胶原基因的表达进行系统研究，并与坚硬接骨板固定相比较，以阐明SRP固定对骨折愈合影响的细胞生物学和分子生物学基础。
, 百拇医药
图1 术后2周,SRP组见功能活跃的成骨细胞，周围有周期性胶原纤丝透射电镜×8000
材料与方法
一、接骨板与垫圈
以316L不锈钢制成四孔接骨板螺丝钉。接骨板规格为40mm×7mm×2mm，螺孔直径2.2mm，螺丝钉外径2mm，长12mm。另以超高分子聚乙烯制成空心垫圈，外径2.2mm，内径2mm，高1.5mm。
二、动物实验及观察方法
健康成年新西兰兔24只，体重2.5～3.0kg。质量浓度为2.5%戊巴比妥钠自耳缘静脉麻醉后，手术显露双侧胫骨中段，横形截骨后，左侧以坚硬接骨板内固定(RP)作为对照组，右侧在4个螺孔内均加放垫圈即应力松弛接骨板(SRP)内固定。螺丝钉均使用电动螺丝刀(800型，四川华昌机械厂制)以0.4N·cm统一扭矩拧紧。术后动物分笼饲养，自由活动，所有动物分为3组，每组8只，分别于术后2、4、8周处死取材，作如下观察。
, 百拇医药
(一)透射电镜观察:每组每批4只动物按期处死，在骨折端取2mm×2mm×2mm大小骨块(含连接骨痂和外骨痂)，透射电镜观察。
(二)骨痂组织Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA表达的原位杂交分析
1.组织切片制备:每组4只动物，按期处死，按原位杂交要求，无mRNA酶操作截取内侧两螺孔间骨段5mm，质量浓度为4%多聚甲醛固定，质量浓度为10%EDTA(pH7.4)脱钙10d，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做5μm纵向连续切片3张，置60℃温箱24h，移入4℃冰箱备用。
2.探针制备:含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原α1链cDNA片段的重组质粒分别是PHCAL1-U、RCOLα1-1、pHFS3(均由芬兰Turku大学赠送)，参照Sandberg等[3]文献资料，分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型重组质粒酶切制成胶原探针，长度为450bp、400bp及300bp左右，采用随机引物法，应用Dig-Highprime将探针标记上Dig-11-dUTP。
, 百拇医药
3.原位杂交:切片经二甲苯脱蜡，乙醇水化、蛋白酶K消化、醋酸酐酸化等杂交前处理后，每片滴加杂交液40μl(探针终浓度2μg/ml)，经杂交后漂洗，1∶1000Dig抗体孵育2h，显色液显色，HE复染，光镜观察。
4.对照设立:空白对照，相邻切片平行操作，杂交液中不加标记探针；阴性对照，杂交前以RNA消化酶处理切片。
结果
一、透射电镜观察
术后2周，SRP组:断端间隙骨痂与外骨痂内均见较多功能活跃的成骨细胞，细胞形态为长柱形，核呈梭形或长形，核仁明显，胞浆内有丰富的粗面内质网，细胞周围见640?周期胶原纤丝形成，排列整齐(图1)。外骨痂内可见较多功能仍较旺盛的成软骨细胞，核圆形或椭圆形，胞质内见有大量粗面内质网和高尔基体，胞膜呈扇蛤样或绒毛状，周围见许多细小的胶原纤丝，排列不整齐，无周期性。RP组:仅见成骨细胞，功能不活跃。两组2周时，均见有变性、老化的成纤维细胞，细胞器不发达。
, 百拇医药
术后4周,SRP组:外骨痂内成骨细胞不仅数量增多，而且功能极为活跃，并见成骨细胞分裂、增殖现象，无核膜，染色质集中于核心两端，中间呈环状。4周时大部分软骨细胞变性坏死(图2)，骨表面破骨细胞开始出现，多核，胞浆丰富，内见大量线粒体、高尔基体、微丝及小泡。周围有已被部分吸收的胶原纤丝(图3)。RP组:骨痂内见较多扁平状成骨细胞，细胞器不发达。
术后8周，SRP组:编织骨表面仍见较多成骨细胞，功能活跃，破骨细胞功能亦相当活跃，与骨接触面皱折缘明显，周围为钙化基质，吞饮小泡内见吞噬的钙盐颗粒。RP组:成骨细胞数量少，功能不活跃，破骨细胞功能活跃，皱折缘侧见较多吞噬的钙颗粒，相邻骨细胞呈溶骨相，陷窝扩大，核固缩、溶解，周围见崩解基质。
图2 术后4周,SRP组软骨细胞变性坏死透射电镜×3000
, 百拇医药
图3 术后4周,SRP组见功能活跃的破骨细胞透射电镜×10000
二、原位杂交分析
术后2周，SRP组见原始骨小梁表面成骨细胞和骨小梁之间骨髓生成细胞表达Ⅰ型胶原mRNA，阳性颗粒呈深紫色(图4)。并见许多软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA，主要限于软骨骨痂分化区和增殖区具有软骨细胞表型的细胞上。肥大软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平较低，未见Ⅲ型胶原mRNA表达。RP组:骨小梁表面亦见成骨细胞表达Ⅰ型mRNA，但表达水平不高，Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA未见表达。
图4 术后2周,SRP组骨小梁表面成骨细胞表达Ⅰ型胶原mRNA原位杂交×400 图5 术后4周,SRP组成骨细胞广泛表达Ⅰ型胶原mRNA，深紫色颗粒浓聚成团原位杂交×200
, http://www.100md.com
术后4周,SRP组:骨表面成骨细胞成层排列，广泛表达Ⅰ型胶原mRNA，部分成骨细胞内深紫色颗粒增多，密集，浓聚成团(图5)。此时，未见Ⅱ型胶原mRNA表达。RP组：成骨细胞表达Ⅰ型mRNA亦相应增多，但阳性杂交颗粒信号明显较SRP组弱。
术后8周SRP组，骨表达仍可见到表达Ⅰ型胶原mRNA的成骨细胞，但无论是细胞数量还是表达水平均不及术后4周。RP组则很少见到骨表面细胞表达Ⅰ型胶原mRNA。
讨论
一、应力松弛接骨板对骨折愈合细胞超微结构的影响
(一)成骨细胞和成软骨细胞
成骨细胞在骨折愈合过程中起着决定性的作用。研究发现SRP组功能活跃的成骨细胞大量出现在骨折后14d，且持续增加。4周时达顶峰。成骨细胞出现较早，数量多，功能活跃，持续时间长，为SRP固定、大量膜内成骨为骨痂的迅速形成提供了基础。此外，我们在术后2周SRP组骨痂中还观察到功能活跃的成软骨细胞，数量较多，持续时间短暂，至术后4周，大部分软骨细胞变性、坏死。
, 百拇医药
成软骨细胞的出现表明SRP固定骨折愈合确实经历了软骨内化骨阶段。
现代理论认为[4，5]，骨折早期骨折段细微运动促进骨折端骨痂的形成和钙化，显示了良好的骨诱导和骨传导作用。由于截骨间隙的存在和SRP的应力松弛作用，当动物早期自由活动时，骨折端不可避免地存在极细微的运动，骨折局部应力刺激增加。虽然我们在体内应力遮挡率变化研究中发现早期这种应力变化可能很小，但骨折部修复组织对力学环境的敏感性非常强，使这种较小的应力刺激仍可能通过促进局部释放生长因子等活性物质来调节细胞的活化、增殖和分化，促进骨基质形成。与上述变化形成鲜明对比的是RP固定组几乎见不到功能活跃的成骨细胞。骨折后不同时期均未见成软骨细胞或软骨细胞。说明稳定力学环境对骨折愈合细胞的分化和超微结构的变化影响不大。
(二)破骨细胞与骨细胞
破骨细胞的出现，标志着骨痂改建的开始。实验中两组均在4周时出现破骨细胞，但SRP组破骨细胞功能活跃，皱折缘典型，透亮区小泡内见钙盐颗粒。这种现象到8周时尤为明显，说明此时骨吸收已相当明显。同时，骨表面成骨细胞功能也很活跃，表明SRP固定的骨痂骨改建已进入正常的良性循环。相反，RP组8周时，破骨细胞功能明显活跃，骨基质中新形成的骨细胞亦呈溶骨相。这种骨细胞性骨溶解现象的发生加剧了RP组骨痂改建中的骨吸收过程，骨改建呈现异常。实验结果证明，SRP应力松弛过程中，骨折端逐渐增加的应力刺激，不仅促进了骨折局部间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞，增强其合成代谢功能，而且亦有利于骨痂改建的顺利进行。
, http://www.100md.com
二、应力松弛接骨板对骨折愈合胶原mRNA表达的影响
实验结果表明，SRP对骨折愈合胶原mRNA表达类型和表达水平均有重要影响。SRP组2周时主要为Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA表达，其中Ⅱ型胶原mRNA表达进一步从分子水平证明了SRP固定下骨折愈合的确经历了软骨内化骨阶段。4周时，成骨细胞表达Ⅰ型胶原mRNA水平达到高峰，而RP组自始至终只有Ⅰ型胶原表达，且表达水平在2～4周时明显低于SRP组，这种胶原mRNA表达类型和表达水平上的差异可能与两种接骨板固定所建立的力学环境不同有关。众所周知，在骨折愈合过程中细胞的功能在早期是受力学环境控制的。SRP特有的应力松弛作用，使固定装置刚度逐渐下降，骨折较早承受了一定应力刺激，这种应力刺激促进了间充质细胞的分化和功能活跃，胶原表达增加。而RP固定,持续稳定在低应力环境下，细胞得不到应力刺激，因而功能亦不活跃，胶原表达水平不高。这一结果与超微结构研究的结果基本一致。
由此可见，应力松弛接骨板对骨折愈合的影响是通过影响细胞的分化和功能而得以实现的，这种对细胞功能的影响具体体现在细胞超微结构和胶原mRNA表达水平的变化上，二者的变化在时间和空间上密切相关，极为一致。而对于力学信号被骨细胞感受，转化为分子信号的过程，尚有待于进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470698)
参考文献
1，王开友,戴
戎，薛文东.应力松弛接骨板对骨应力遮挡率影响的实验研究.医用生物力学,1995,10:224-227.2，戴
戎，戴闽，王开友，等.应力松弛接骨板对骨几何形态和力学性能影响的实验研究.中华医学杂志,1995,75:414-416.3，Sandberg M, Vuorio E. Localization of types Ⅰ ,Ⅱ and Ⅲ collagen mRNAs in developing human skeletal tissues by in situ hybridization. J Cell Biol, 1987, 104:1077-1084.
, http://www.100md.com
4，Kenwright J, Goodship AE. Controlled mechanical stimulation in the treatment of tibia fractures. Clin Orthop, 1989, (241):36-47.
5，Clase LE, Wilke HJ, Augat P, et al. Effect of dynamization on gap healing of diaphyseal fractures under external fixation. Clin Biomech, 1995, 10:227-233.
(收稿日期：1999-05-31), 百拇医药