汉坦病毒在Vero细胞上的适应传代及疫苗候选株的选育
作者：解燕乡 马本江 杭长寿
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所 北京，100052
关键词：肾综合征出血热；汉坦病毒株；Vero细胞；灭活疫苗
中华微生物学和免疫学杂志000617 【 摘要 】 目的 选育出在Vero细胞上繁殖力强、免疫原性和抗原性好的汉滩病毒及汉城病毒候选株。 方法 国内外分离的16株汉坦病毒(HV)在Vero细胞上进行连续终末稀释传代，研究各毒株的繁殖特性及传代后病毒滴度及抗原量的变化。 结果 经过5次终末稀释传代，选育出L99(汉城病毒)和84FLi(汉滩病毒)2株滴度高且稳定的病毒，在Vero细胞上具有良好的适应性，7～10 d毒力接近峰值。ELISA测抗原量高峰则在10～16 d。病毒繁殖与接种剂量明显相关，0.01～0.1 TCID50/细胞感染量最宜。用这两个毒株试制的原液苗免疫家兔，产生的免疫血清，对同型毒株的中和效价均>1∶10。 结论 选育出滴度高和抗原性好的HV并试制出原液苗，为利用Vero细胞生产浓缩纯化灭活疫苗准备了条件。
, 百拇医药
Adaptation of virus strains of hemorrhagic fever with renal syndromes to Vero cells and selection of candidate vaccine strains
XIE Yanxiang, MA Benjiang, HANG Changshou.
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective The adaptation of hemorrhagic fever with renal syndromes (HFRS) virus strains to the Vero cells and the cultivation of the bi-valent candidate vaccine strains. Methods 16 strains of HFRSVs isolated in China were continuously passaged on the Vero cells by the terminal dilution method to study the characteristics of virus multiplication and the changes of viral titers after serial passages. Results Out of 16 virus strains, L99 and 84FLi were selected as the candidate viruses for vaccines for their good adaptivity to Vero cells and stable multiplication with high titers. The virus titer reached peak 7-10 days after inoculation and ELISA peak ranged from 10 to 16 days. The multiplication of virus correlated to the inoculation dose and inoculum of 0.01-0.1 TCID50/cell was shown to be optimal. Rabbits immunized with the gross vaccines of 84FLi and L99 showed 100% antibody positive transition and the neutralization antibody reached 1∶10, as determined by plaque reduction neutralization test (PRNT). Conclusion Candidate virus strains 84FLi and L99 selected in this study with high titers were applicable to produce the HFRS vaccines and were the foundation for the production of the purified bi-valent HFRS vaccines on Vero cells.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Hemorrhagic fever with renal syndromes; HFRS Virus; Vero cells; Vaccine strains
肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒(HV)引起的一种危害严重的传染病，目前无有效的治疗方法。因此，应用疫苗是防制本病的重要手段。近20年来，国内外在HFRS疫苗的研制方面进展很快，乳鼠脑纯化疫苗和地鼠/沙鼠肾细胞疫苗的生产和应用为预防该病的发生和流行起到重要作用〔1〕。但以脑组织及原代细胞作为疫苗生产基质其来源复杂，需要大量动物，不利于机械化生产和质量控制〔2〕。用非致瘤性传代细胞生产疫苗已成为国内外生物制品技术发展的趋势。Vero细胞是非洲绿猴肾传代细胞株，是经WHO检定并推荐的疫苗生产首选基质，具有成本低，来源方便，质量可控，易于纯化及大规模生产等优点〔3〕。为建立基于Vero细胞的HFRS疫苗生产系统，我们研究了16株汉坦病毒在此细胞上的适应传代及繁殖特性，从中筛选出84FLi及L99两株疫苗候选毒株，并试制了原液苗，总结报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
细胞：Vero细胞来自ATCC，131代由中国药品生物制品检定所提供，于138～150代之间使用。
毒株：汉滩病毒A9、76-118、LuYou、Chen、H5、FT14、LuXu、84FLi、C4、H3、LR1、JR及汉城病毒UR、L99、R22、Gou3共16株病毒。其中L99为我国地鼠肾灭活疫苗生产用株，1984年从江西疫区罗赛(Losea)鼠体内分离〔4〕；84FLi分离自陕西胎儿肝脏组织〔5〕。其余均为本室保存的历史较清楚、有一定免疫学背景的毒株。
细胞的培养传代及病毒的选育保存：Vero细胞用含10%灭活小牛血清的MEM 37℃培养，常规消化传代。病毒经终末稀释法传代以提高其滴度。概言之，将HV以适当的稀释度感染24孔培养板中的Vero细胞，2 d后换含2%血清的MEM(维持液)继续培养。取7～10 d中出现IFA阳性孔的次高稀释度的上清为毒种，继续终末稀释传代，反复5次，直至选出达到理想稳定滴度的毒株。将毒种接种至Vero细胞悬液培养于方瓶中2～3 d，待细胞长满时换维持液，7 d后细胞刮片免疫荧光检测，荧光强度++～+++时收获上清，补充20%血清，冻存于-70℃。
, 百拇医药
接种乳鼠：昆明(KM)2日龄小白鼠购于中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所。腹腔接种病毒，取发病鼠脑组织。
病毒检测
免疫荧光试验(IFAT)：按本室方法进行〔6〕。
酶联免疫吸附试验(ELISA)：细胞成片后换含2%小牛血清的维持液，以后隔2～3 d换液1次，收获上清为标本，依文献〔6〕方法用本室生产的试剂盒进行。
空斑试验(PFT)及空斑减少中和试验(PRNT)：参见文献〔7〕。
原液苗的制备：病毒感染采用与细胞悬液混种的方法，即在细胞培养到3～4 d成致密单层以后，用消化液制成细胞悬液，按0.001左右MOI(每个细胞接种病毒感染剂量数)分别加入84FLi及L99病毒株，分装方瓶，在37℃培养，3～4 d细胞成片后弃培养液，喷洗充分，加入含0.2%人血清白蛋白的维持液，再3～4 d，IFA+++～++++时，收获上清。加1∶4 000 β-丙内酯(BPL)4℃灭活24 h，37℃水浴2 h，安全试验合格，即为原液苗成品。
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免疫血清的制备：纯白色家兔(雌雄均可)，体重2～2.5kg，为中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所提供。肌肉接种原液苗1ml，每株疫苗免疫4只，7 d后加强免疫，方法同前。免前和免后28 d分别采血，分离血清。
结果
1.HV对Vero细胞适应性的比较：16株来源不同的HV对Vero细胞均敏感，但适应能力和繁殖速度有一定差异。有些毒株如C4接种Vero细胞第1代7 d IFAT即可查见强荧光，而Gou3连续3次传代荧光仍较弱。各毒株在细胞上用常规方法连续传2～3代后，多数毒株虽滴度未见明显提高，但达到同一滴度的时间大为缩短，如A9最多相差18 d。可是，所有毒株毒力滴度均<105TCID50/ml，远远达不到试制疫苗(必须大于或等于107TCID50/ml)的要求。而后，我们采用了终末稀释、增殖及乳鼠传代相结合的方法，选择疫苗生产用毒株。
, 百拇医药
2.疫苗候选株的选育：经5次终末稀释传代，有5株病毒(L99，84FLi，C4，H5，FT14)的TCID50>6.0。84FLi和L99表现出良好的适应性，增殖2代，反传鼠脑3代，再至Vero细胞传代，病毒滴度基本平稳维持在7.0TCID50/ml左右(表1)，达到WHO生产传代细胞疫苗的要求。L99株同时也是我国已经生产使用的地鼠肾原代细胞及其纯化疫苗研制用毒株，证明是安全和有效的，另外L99略高于84FLi的滴度。
表1 终末稀释后选出高滴度病毒
Table 1. Selection of the candidate viruses with high titers by terminal dilution Strain
Passage No.
Titer
, 百拇医药
TCID50
PFU
ELISA
84FLi
1
7.0
2×107
1∶ 8
2
7.0
3×107
1∶16
, 百拇医药
Post SM
7.0
2×107
>1∶32
1
4.5
5×104
1∶ 4
2
6.5
6×106
1∶ 8
, 百拇医药
3
7.0
4×107
1∶32
4
7.0
2×107
1∶32
L99
1
7.5
5×107
, http://www.100md.com 1∶16
2
7.5
7×108
1∶16
Post SM
8.5
4×108
>1∶32
1
7.5
1×107
, 百拇医药
1∶32
2
7.0
4×107
1∶16
3
7.0
6×107
1∶16
4
7.5
3×107
, 百拇医药 1∶32
Post SM∶ Viruses propagated 3 passages through the brains of the suckling mice
3.L99和84FLi在Vero细胞上的繁殖动态：由表2可见，L99和84FLi在Vero细胞上繁殖到7～10 d毒力接近峰值(7.0logTCID50/ml)。ELISA测抗原量高峰则在10～16 d。病毒繁殖与接种剂量明显相关，实验发现0.01～0.1 TCID50/细胞感染量最宜。
4.原液苗免疫家兔后中和抗体的测定：L99及84FLi制备的原液苗分别免疫4只家兔后的兔血清经PRNT法测定，对同型毒株的中和效价均>1∶10，达到继续试验的基本要求。另外，L99株疫苗对异型毒株亦有一定的中和抗体(表3)。
表2 84FLi和L99株在Vero细胞上的繁殖动态
, 百拇医药
Table 2. Growth dynamics of 84FLi and L99 on Vero cells Strain
Passages of
virus seed1
Infection
(TCID50/cell)
Days post
infection2
Titer
TCID50/ml
, http://www.100md.com
PFU/ml
IFA
ELISA
84FLi
1
3.0
7
4.5
2×105
+++
1∶16
2
0.01
, 百拇医药
7
5.5
1×105
++
1∶ 4
10
7.5
3×107
+++
1∶16
13
7.0
8×106
, 百拇医药
++++
1∶16
4
0.01
5
2.0
5×105
+～++
1∶ 1
7
5.0
2×105
++
, http://www.100md.com
1∶ 8
10
7.0
3×107
+++
1∶32
13
6.5
2×106
+++
1∶16
16
6.0
, 百拇医药
1.5×106
++++
1∶32
19
6.5
3×106
+++
1∶16
L99
1
1
7
6.5
, 百拇医药
3×107
++++
1∶32
2
0.01
7
6.5
5×107
+++
1∶16
10
7.5
4×107
, http://www.100md.com
++++
1∶32
13
7.0
9×106
++++
1∶32
15
6.5
6×106
+++
1∶32
4
, 百拇医药
0.01
5
2.5
3×103
++
1∶ 2
7
6.5
3×107
+++
1∶16
10
7.0
, 百拇医药
1.5×107
++++
1∶32
13
7.0
8×106
++++
1∶64
16
7.0
3×107
++++
, 百拇医药
1∶64
19
6.0
4×106
+++
1∶32
Note: 1. Passages refers to those after inoculation of suckling mouse brains; 2. Samples were collected after medium replacement 表3 原液灭活疫苗免疫家兔血清中和抗体的测定
Table 3. Neutralization titer in sera of rabbits immunized with HFRS inactivated vaccine Strain
, 百拇医药
Sera No.
76～118
UR
L99
1
1∶10
1∶40
2
<1∶10
1∶20
3
1∶10
>1∶40
, 百拇医药
4
<1∶10
1∶20
84FLi
1
1∶20
<1∶10
2
1∶20
<1∶10
3
1∶20
<1∶10
, 百拇医药
4
1∶40
1∶10
Note: Antibodies before immunization<1∶10讨论
肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒(HV)引起的急性自然疫源性疾病，为全球性的公共卫生问题，在中国尤为严重〔1,6〕。自病毒分离之初，即开始了疫苗的研制工作。现已研制成功灭活疫苗，基因工程苗和减毒活疫苗也取得一定进展〔1,8,9〕。后二者或由于抗原性较弱，或由于缺乏评价安全性的动物模型而应用受限。目前，只有灭活疫苗大量应用并发挥作用。根据疫苗生产基质，灭活疫苗分地鼠/沙鼠肾原代细胞疫苗，大/小白鼠乳鼠脑纯化疫苗。国外在80年代就开展以Vero细胞为代表的传代细胞系生产疫苗的研究。Vero细胞系始建于1962年，1979年由ATCC(American type culture collection)建成第124代的种库〔3〕。对Vero细胞的长期研究并未发现其转化致癌倾向，WHO亦放宽了对其残存DNA(<100pg/剂量)的限制。国内外已用Vero细胞为基质生产了脊髓灰质炎和狂犬病病毒疫苗〔3〕，用Vero细胞生产出血热病毒疫苗不仅利于纯化浓缩，更适合大规模自动化生产，提高质量，满足防病需要。
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选择适合在Vero细胞上生长的毒株是疫苗生产的关键。本研究在16株病毒中根据抗原滴度、病毒繁殖峰值时间等综合指标筛选到L99和84FLi两株疫苗候选株。据抗原性，L99为汉城病毒，84FLi为汉滩病毒〔4，5〕。HV不同型之间的宿主特异性较强，提示病毒与宿主之间有某种共进化(Co-evolution)关系〔10〕。不同动物对HV毒株的敏感性差异较大，有研究表明，可通过病毒在动物中不断传代以使其适应宿主〔11〕。为使原本适应鼠脑的病毒适应Vero细胞，需将病毒以终末稀释的方式将病毒在Vero细胞上连续传代，5代后选出滴度稳定(～107.0PFU/ml)、达到峰值时间短(7～10 d)的毒株。毒株再反传乳鼠，鼠脑毒种再在Vero细胞传两代作为种子毒种，第四代病毒建成生产种子库(Pool)，并对其进行内/外源因子、无菌试验、过敏原及支原体(PPLO)等检测，均符合疫苗生产规程要求(资料未显示)。
实验中发现病毒的接种量对生长有较大影响，以0.01～0.1TCID50/细胞较适宜，接种7 d后病毒滴度较高(表2)。接种量过低，则成熟时间延长；过高(1～10TCID50/细胞)反而产量很低。实验中曾发生用浓病毒接种连传3代后无法查出IFA的现象。另外，L99无论综合滴度还是达到峰值时间均优于84FLi，这可能与不同型别毒株本身的生物学特性有关。综上，本实验从16株HV中选出了汉滩病毒及汉城病毒，在Vero细胞上适应性及免疫原性均良好的毒株各一，并对其接种剂量、生长特性进行了研究，为流行性出血热Vero细胞纯化疫苗的生产创造了条件。
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参考文献
1，陈化新，叶克龙，张家驹，等.中国肾综合征出血热疫苗免疫效果评价和免疫策略研究.中国媒介生物学及控制杂志，1996, 7(4)：241-246.
2，Lin FT, Zeng FZ, Lu LM, et al. The primary hamster kidney cell rabies vaccine: adaptation of viral strain, production of vaccine. J Infect Dis, 1983, 147(3):467-473.
3，Montagnon B, Fanget B. Purified Vero cell vaccine for humans. In:Laboratory techniques in Rabies. F-X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski eds. (4th eds), WHO, 1996, P285-289.
, 百拇医药
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5，Liang MF, Li DX, Xiao SY, et al. Antigenic and molecular characterization of Hantavirus isolates from China. Virus Res, 1994, 31:219-233.
6，宋干主编. 流行性出血热防治手册. 第二版， 北京：人民卫生出版社，1998，P111-116.
7，Tsai TF, Bauer SP, Sasso DR, et al. Serological and virological evidence of Hantann virus-related enzootic in the United States. J Infect Dis, 1985, 152(1):126-134.
, 百拇医药
8，王华. 肾综合征出血热的流行病学及疫苗研制进展. 中国媒介生物学及控制杂志，1993, 4(特3):1-7.
9，杭长寿. 流行性出血热病毒基因工程疫苗研究展望. 中国公共卫生学报，1990, 9(5):313-318.
10，顾先仕. 汉坦病毒研究进展. 中国媒介生物学及控制杂志，1993, 4(特3):14-18.
11，Govrilovskaya IN, Chumakov MP, Apekina NS, et al. Adaptation to laboratory and wild animals of the haemorrhagic fever with renal syndrome virus present in the foci of European. USSR Arch Vriol, 1983, 77:87-90.
(收稿日期：1999-04-07), 百拇医药
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所 北京，100052
关键词：肾综合征出血热；汉坦病毒株；Vero细胞；灭活疫苗
中华微生物学和免疫学杂志000617 【 摘要 】 目的 选育出在Vero细胞上繁殖力强、免疫原性和抗原性好的汉滩病毒及汉城病毒候选株。 方法 国内外分离的16株汉坦病毒(HV)在Vero细胞上进行连续终末稀释传代，研究各毒株的繁殖特性及传代后病毒滴度及抗原量的变化。 结果 经过5次终末稀释传代，选育出L99(汉城病毒)和84FLi(汉滩病毒)2株滴度高且稳定的病毒，在Vero细胞上具有良好的适应性，7～10 d毒力接近峰值。ELISA测抗原量高峰则在10～16 d。病毒繁殖与接种剂量明显相关，0.01～0.1 TCID50/细胞感染量最宜。用这两个毒株试制的原液苗免疫家兔，产生的免疫血清，对同型毒株的中和效价均>1∶10。 结论 选育出滴度高和抗原性好的HV并试制出原液苗，为利用Vero细胞生产浓缩纯化灭活疫苗准备了条件。
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Adaptation of virus strains of hemorrhagic fever with renal syndromes to Vero cells and selection of candidate vaccine strains
XIE Yanxiang, MA Benjiang, HANG Changshou.
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective The adaptation of hemorrhagic fever with renal syndromes (HFRS) virus strains to the Vero cells and the cultivation of the bi-valent candidate vaccine strains. Methods 16 strains of HFRSVs isolated in China were continuously passaged on the Vero cells by the terminal dilution method to study the characteristics of virus multiplication and the changes of viral titers after serial passages. Results Out of 16 virus strains, L99 and 84FLi were selected as the candidate viruses for vaccines for their good adaptivity to Vero cells and stable multiplication with high titers. The virus titer reached peak 7-10 days after inoculation and ELISA peak ranged from 10 to 16 days. The multiplication of virus correlated to the inoculation dose and inoculum of 0.01-0.1 TCID50/cell was shown to be optimal. Rabbits immunized with the gross vaccines of 84FLi and L99 showed 100% antibody positive transition and the neutralization antibody reached 1∶10, as determined by plaque reduction neutralization test (PRNT). Conclusion Candidate virus strains 84FLi and L99 selected in this study with high titers were applicable to produce the HFRS vaccines and were the foundation for the production of the purified bi-valent HFRS vaccines on Vero cells.
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【 Subject words 】 Hemorrhagic fever with renal syndromes; HFRS Virus; Vero cells; Vaccine strains
肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒(HV)引起的一种危害严重的传染病，目前无有效的治疗方法。因此，应用疫苗是防制本病的重要手段。近20年来，国内外在HFRS疫苗的研制方面进展很快，乳鼠脑纯化疫苗和地鼠/沙鼠肾细胞疫苗的生产和应用为预防该病的发生和流行起到重要作用〔1〕。但以脑组织及原代细胞作为疫苗生产基质其来源复杂，需要大量动物，不利于机械化生产和质量控制〔2〕。用非致瘤性传代细胞生产疫苗已成为国内外生物制品技术发展的趋势。Vero细胞是非洲绿猴肾传代细胞株，是经WHO检定并推荐的疫苗生产首选基质，具有成本低，来源方便，质量可控，易于纯化及大规模生产等优点〔3〕。为建立基于Vero细胞的HFRS疫苗生产系统，我们研究了16株汉坦病毒在此细胞上的适应传代及繁殖特性，从中筛选出84FLi及L99两株疫苗候选毒株，并试制了原液苗，总结报告如下。
, 百拇医药
材料与方法
细胞：Vero细胞来自ATCC，131代由中国药品生物制品检定所提供，于138～150代之间使用。
毒株：汉滩病毒A9、76-118、LuYou、Chen、H5、FT14、LuXu、84FLi、C4、H3、LR1、JR及汉城病毒UR、L99、R22、Gou3共16株病毒。其中L99为我国地鼠肾灭活疫苗生产用株，1984年从江西疫区罗赛(Losea)鼠体内分离〔4〕；84FLi分离自陕西胎儿肝脏组织〔5〕。其余均为本室保存的历史较清楚、有一定免疫学背景的毒株。
细胞的培养传代及病毒的选育保存：Vero细胞用含10%灭活小牛血清的MEM 37℃培养，常规消化传代。病毒经终末稀释法传代以提高其滴度。概言之，将HV以适当的稀释度感染24孔培养板中的Vero细胞，2 d后换含2%血清的MEM(维持液)继续培养。取7～10 d中出现IFA阳性孔的次高稀释度的上清为毒种，继续终末稀释传代，反复5次，直至选出达到理想稳定滴度的毒株。将毒种接种至Vero细胞悬液培养于方瓶中2～3 d，待细胞长满时换维持液，7 d后细胞刮片免疫荧光检测，荧光强度++～+++时收获上清，补充20%血清，冻存于-70℃。
, 百拇医药
接种乳鼠：昆明(KM)2日龄小白鼠购于中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所。腹腔接种病毒，取发病鼠脑组织。
病毒检测
免疫荧光试验(IFAT)：按本室方法进行〔6〕。
酶联免疫吸附试验(ELISA)：细胞成片后换含2%小牛血清的维持液，以后隔2～3 d换液1次，收获上清为标本，依文献〔6〕方法用本室生产的试剂盒进行。
空斑试验(PFT)及空斑减少中和试验(PRNT)：参见文献〔7〕。
原液苗的制备：病毒感染采用与细胞悬液混种的方法，即在细胞培养到3～4 d成致密单层以后，用消化液制成细胞悬液，按0.001左右MOI(每个细胞接种病毒感染剂量数)分别加入84FLi及L99病毒株，分装方瓶，在37℃培养，3～4 d细胞成片后弃培养液，喷洗充分，加入含0.2%人血清白蛋白的维持液，再3～4 d，IFA+++～++++时，收获上清。加1∶4 000 β-丙内酯(BPL)4℃灭活24 h，37℃水浴2 h，安全试验合格，即为原液苗成品。
, 百拇医药
免疫血清的制备：纯白色家兔(雌雄均可)，体重2～2.5kg，为中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所提供。肌肉接种原液苗1ml，每株疫苗免疫4只，7 d后加强免疫，方法同前。免前和免后28 d分别采血，分离血清。
结果
1.HV对Vero细胞适应性的比较：16株来源不同的HV对Vero细胞均敏感，但适应能力和繁殖速度有一定差异。有些毒株如C4接种Vero细胞第1代7 d IFAT即可查见强荧光，而Gou3连续3次传代荧光仍较弱。各毒株在细胞上用常规方法连续传2～3代后，多数毒株虽滴度未见明显提高，但达到同一滴度的时间大为缩短，如A9最多相差18 d。可是，所有毒株毒力滴度均<105TCID50/ml，远远达不到试制疫苗(必须大于或等于107TCID50/ml)的要求。而后，我们采用了终末稀释、增殖及乳鼠传代相结合的方法，选择疫苗生产用毒株。
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2.疫苗候选株的选育：经5次终末稀释传代，有5株病毒(L99，84FLi，C4，H5，FT14)的TCID50>6.0。84FLi和L99表现出良好的适应性，增殖2代，反传鼠脑3代，再至Vero细胞传代，病毒滴度基本平稳维持在7.0TCID50/ml左右(表1)，达到WHO生产传代细胞疫苗的要求。L99株同时也是我国已经生产使用的地鼠肾原代细胞及其纯化疫苗研制用毒株，证明是安全和有效的，另外L99略高于84FLi的滴度。
表1 终末稀释后选出高滴度病毒
Table 1. Selection of the candidate viruses with high titers by terminal dilution Strain
Passage No.
Titer
, 百拇医药
TCID50
PFU
ELISA
84FLi
1
7.0
2×107
1∶ 8
2
7.0
3×107
1∶16
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Post SM
7.0
2×107
>1∶32
1
4.5
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L99
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2
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1∶16
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1
7.5
1×107
, 百拇医药
1∶32
2
7.0
4×107
1∶16
3
7.0
6×107
1∶16
4
7.5
3×107
, 百拇医药 1∶32
Post SM∶ Viruses propagated 3 passages through the brains of the suckling mice
3.L99和84FLi在Vero细胞上的繁殖动态：由表2可见，L99和84FLi在Vero细胞上繁殖到7～10 d毒力接近峰值(7.0logTCID50/ml)。ELISA测抗原量高峰则在10～16 d。病毒繁殖与接种剂量明显相关，实验发现0.01～0.1 TCID50/细胞感染量最宜。
4.原液苗免疫家兔后中和抗体的测定：L99及84FLi制备的原液苗分别免疫4只家兔后的兔血清经PRNT法测定，对同型毒株的中和效价均>1∶10，达到继续试验的基本要求。另外，L99株疫苗对异型毒株亦有一定的中和抗体(表3)。
表2 84FLi和L99株在Vero细胞上的繁殖动态
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Table 2. Growth dynamics of 84FLi and L99 on Vero cells Strain
Passages of
virus seed1
Infection
(TCID50/cell)
Days post
infection2
Titer
TCID50/ml
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PFU/ml
IFA
ELISA
84FLi
1
3.0
7
4.5
2×105
+++
1∶16
2
0.01
, 百拇医药
7
5.5
1×105
++
1∶ 4
10
7.5
3×107
+++
1∶16
13
7.0
8×106
, 百拇医药
++++
1∶16
4
0.01
5
2.0
5×105
+～++
1∶ 1
7
5.0
2×105
++
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1∶ 8
10
7.0
3×107
+++
1∶32
13
6.5
2×106
+++
1∶16
16
6.0
, 百拇医药
1.5×106
++++
1∶32
19
6.5
3×106
+++
1∶16
L99
1
1
7
6.5
, 百拇医药
3×107
++++
1∶32
2
0.01
7
6.5
5×107
+++
1∶16
10
7.5
4×107
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++++
1∶32
13
7.0
9×106
++++
1∶32
15
6.5
6×106
+++
1∶32
4
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0.01
5
2.5
3×103
++
1∶ 2
7
6.5
3×107
+++
1∶16
10
7.0
, 百拇医药
1.5×107
++++
1∶32
13
7.0
8×106
++++
1∶64
16
7.0
3×107
++++
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1∶64
19
6.0
4×106
+++
1∶32
Note: 1. Passages refers to those after inoculation of suckling mouse brains; 2. Samples were collected after medium replacement 表3 原液灭活疫苗免疫家兔血清中和抗体的测定
Table 3. Neutralization titer in sera of rabbits immunized with HFRS inactivated vaccine Strain
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Sera No.
76～118
UR
L99
1
1∶10
1∶40
2
<1∶10
1∶20
3
1∶10
>1∶40
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4
<1∶10
1∶20
84FLi
1
1∶20
<1∶10
2
1∶20
<1∶10
3
1∶20
<1∶10
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4
1∶40
1∶10
Note: Antibodies before immunization<1∶10讨论
肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒(HV)引起的急性自然疫源性疾病，为全球性的公共卫生问题，在中国尤为严重〔1,6〕。自病毒分离之初，即开始了疫苗的研制工作。现已研制成功灭活疫苗，基因工程苗和减毒活疫苗也取得一定进展〔1,8,9〕。后二者或由于抗原性较弱，或由于缺乏评价安全性的动物模型而应用受限。目前，只有灭活疫苗大量应用并发挥作用。根据疫苗生产基质，灭活疫苗分地鼠/沙鼠肾原代细胞疫苗，大/小白鼠乳鼠脑纯化疫苗。国外在80年代就开展以Vero细胞为代表的传代细胞系生产疫苗的研究。Vero细胞系始建于1962年，1979年由ATCC(American type culture collection)建成第124代的种库〔3〕。对Vero细胞的长期研究并未发现其转化致癌倾向，WHO亦放宽了对其残存DNA(<100pg/剂量)的限制。国内外已用Vero细胞为基质生产了脊髓灰质炎和狂犬病病毒疫苗〔3〕，用Vero细胞生产出血热病毒疫苗不仅利于纯化浓缩，更适合大规模自动化生产，提高质量，满足防病需要。
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选择适合在Vero细胞上生长的毒株是疫苗生产的关键。本研究在16株病毒中根据抗原滴度、病毒繁殖峰值时间等综合指标筛选到L99和84FLi两株疫苗候选株。据抗原性，L99为汉城病毒，84FLi为汉滩病毒〔4，5〕。HV不同型之间的宿主特异性较强，提示病毒与宿主之间有某种共进化(Co-evolution)关系〔10〕。不同动物对HV毒株的敏感性差异较大，有研究表明，可通过病毒在动物中不断传代以使其适应宿主〔11〕。为使原本适应鼠脑的病毒适应Vero细胞，需将病毒以终末稀释的方式将病毒在Vero细胞上连续传代，5代后选出滴度稳定(～107.0PFU/ml)、达到峰值时间短(7～10 d)的毒株。毒株再反传乳鼠，鼠脑毒种再在Vero细胞传两代作为种子毒种，第四代病毒建成生产种子库(Pool)，并对其进行内/外源因子、无菌试验、过敏原及支原体(PPLO)等检测，均符合疫苗生产规程要求(资料未显示)。
实验中发现病毒的接种量对生长有较大影响，以0.01～0.1TCID50/细胞较适宜，接种7 d后病毒滴度较高(表2)。接种量过低，则成熟时间延长；过高(1～10TCID50/细胞)反而产量很低。实验中曾发生用浓病毒接种连传3代后无法查出IFA的现象。另外，L99无论综合滴度还是达到峰值时间均优于84FLi，这可能与不同型别毒株本身的生物学特性有关。综上，本实验从16株HV中选出了汉滩病毒及汉城病毒，在Vero细胞上适应性及免疫原性均良好的毒株各一，并对其接种剂量、生长特性进行了研究，为流行性出血热Vero细胞纯化疫苗的生产创造了条件。
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参考文献
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(收稿日期：1999-04-07), 百拇医药