纳豆激酶活性测定方法
作者：谢秋玲 郭勇 林剑
单位：谢秋玲(暨南大学生物工程所 广州 510632)；郭勇(暨南大学生物工程所 广州 510632)；林剑(华南理工大学食品与生物工程学院 广州 510641)
关键词：纳豆激酶 溶血栓活性 活性测定
广东药学000605 摘要 对先后建立的纤维平板法等几种测定纳豆激酶活性的方法进行概括总结介绍。
纳豆是由枯草杆菌(acillus subtilis)或纳豆菌(Bacillus natto)发酵大豆而成，在日本的食用历史已有2000年，深受日本人民的喜爱。很久以来，民间还将其作为预防和治疗心血管疾病的药品[1]。1987年须见洋行等首次从纳豆中提取了一种具有溶血栓作用的酶制剂，命名为纳豆激酶(简称NK)[2]。10年来对于纳豆激酶的特性、药理及生产等方面都有了进一步的研究[3～8]。而纳豆激酶活性测定方法作为研究的基础，也不断地建立并得到改进。现已有的活性测定方法包括以下几种。
, 百拇医药
1 纤维蛋白平板法
纤维蛋白平板法是最早用于NK活性测定的方法之一[2]，它是参照尿激酶(UK)或组织纤溶酶原激活剂(tPA)的测活方法而建立的。其原理是以凝血酶和纤维蛋白原作用制成人工血栓平板，注入NK，用溶解面积来表示NK的溶纤维活性[9]。
在培养皿中加入血纤维蛋白原(fibrinogen)溶液和凝血酶溶液，搅拌使其凝固制成平板。取不同浓度NK样品点于平板上，37℃恒温孵育18h，测其溶解圈直径。可以发现酶量与溶解面积成直线关系。
以标准NK或UK或纤溶酶(Plasimin)作为标准品作标准曲线。NK的活性单位定义为：在37℃ 1min内分解1 nmol溶解于0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)中的浓度5×10-4mol/L的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的NK量为1U。或者以UK或纤溶酶的活性单位来表示。
, 百拇医药
纤维蛋白平板法以测得的纤维溶解面积来表示NK的活性，完全是表观值。如恒温孵育时间变化，测定值的变化很大。随着恒温时间的增加，所对应的值显著减少。比之NK精制产品，粗制酶活性测定受孵育时间影响更大，这可能是粗酶中杂质的影响。因此对恒温时间的控制是十分重要的。
2 纤维蛋白块溶解时间法
此法简称CLT法。纤溶酶、tPA、UK等溶血栓物质都以此方法来测定活性。测定NK活性的方法就是根据以上各种方法稍加变动而建立的[9]。
0℃下，在小试管中依次加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲溶液、NK溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌，置于37℃恒温水浴。从纤维蛋白形成开始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停止时，作为纤维蛋白溶解时间(CLT)。
同样以标准NK或UK或纤溶酶作为标准品，以CLT对NK浓度的对数作图，发现在10～70μg范围内有很好的线性关系。
, 百拇医药
比较于平板法，CLT法迅速快捷，有较大的分辨率，且更适于粗酶的活性测定。但随着灵敏度的提高，溶解时间的判定也更加困难。除非有新型、方便的计时装置，否则同时测定多个样品是比较困难的。
3 四肽底物法
纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，具有275个氨基酸，与枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)同源性极高，其中与枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶 Carlsberg的同源性分别为85%和69%；而与枯草杆菌蛋白酶E只有两个氨基酸的差异[4]。而且NK与枯草杆菌蛋白酶E的催化中心和结合中心相同，因此有人用测定枯草杆菌蛋白酶E的方法来测定NK的活性[7]。其具体操作也可参照枯草杆菌蛋白酶E的测活方法[10]。
在四肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶液中加入NK酶液，在37℃水浴中孵育1min；测定单位时间内410nm处光吸收的变化。
, http://www.100md.com
NK的活性定义为1min，水解Suc-AAPF-pNA时生成1μl-硝基苯胺的NK量为1U。
该方法简便易行，可迅速测定酶的活性。缺点是该方法所得到的蛋白酶活性并不能完全表示其溶纤维活性，二者之间是否有相关性有待进一步试验。
4 血清板法
血清板法是纤维平板法的改进[11]。其原理是，纤维形成初始，在655nm处的吸光度最大，随着NK的加入，使纤维溶解，从而吸光度下降。试验发现，吸光度的减少同NK的浓度成线性关系。
在血清板的小孔内依照平板法的制作方法，制成微型纤维平板，然后在每个孔内加入不同浓度的标准NK。反应开始4h内，每30min测定一次OD655值；计算出每个时间的OD655值同初始OD655值的差-ΔOD655，利用最小二乘法算出直线的斜率―-ΔOD655/h。以此斜率同NK浓度的对数作图，可得到良好的线性关系。
, 百拇医药
该方法的优点是，可以同时测多个样品，而且在4h内可对酶活性进行测定，操作简便、快捷，样品消耗小，成本低。另外，-ΔOD655值的变异系数CV%在5%以内，可信度高。
应注意的一点是，人工血栓的制作对消光值的测定是有影响的。不过如果反应开始时小孔内的血栓的吸光值在0.2以上，那么人工血栓的调制对OD655值几乎没有太大的影响。
5 酶联免疫吸附法(ELISA)[12]
该法是以对NK有特异性的单克降抗体与NK发生特异结合，然后再同连有标志酶的多克隆抗体结合，形成一种类似三明治的结构，通过标志酶――即过氧化物酶的反应而测定NK的活性。
先将抗NK的单克隆抗体同NK酶孵育，之后再同多克隆抗体结合。加入新配制的底物溶液和2N H2SO4,测定490nm的吸光值。
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该法灵敏度很好，可达到0.1ng/ml。同时特异性好，同枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的交叉反应系数分别为0.0002%和0.00002%，由此可看出，具特异性的单克隆抗体同酶的结合位点不是催化中心。以经典的平板法所得出的NK溶血栓活性同ELISA法测得的NK量之间具有线性关系，回归方程为
Y(ELISA)=8.00X(平板法)-18.98，相关系数为0.967
这说明ELISA法可以很好地反映NK的溶血栓活性。
同时ELISA法同圆二色性谱等其他方法的结果相结合，对NK的结构探索提供了一定的参考数据，从中可以看出，温度的提高使NK活性下降，不是因为NK一级结构的破坏，而可能是破坏了酶的二级结构，包括α-螺旋和β-折叠。该法的缺点是操作复杂，成本高。
综上所述，NK的测活方法多样，各有优缺点。如今普遍使用的仍是经典的平板法和CLT法。得到一个更精确、更灵敏、更简便、更经济的NK测活方法是一个有待继续研究的课题。
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参考文献
1，须见洋行.日本酿造协会志.1990，85(8)：518～524
2，Suni,H.et al.Experientia.1987,43:1110～1111
3，须见洋行.化学与生物.1991，29(2)：119～123
4，Fujita,M.et al.Biochem.Biophy.Res.Commun.1993,197(3):1340～1347
5，Fujita,M.et al.Biol.Pharm.Bull.1995,18(9):1194～1196
6，Fujita,M.et al.Biol.Pharm.Bull.1995,18(10):1387～1391
, http://www.100md.com
7，三?悟，竹内尚人.日本公开特许公报.94，153，977
8，傅俐，等.生物工程进展.1997，17(3)：31～33
9，须见洋行，等.日本酿造协会志.1993，88(6)：482～486
10，王贤舜，等.生物化学与生物物理进展.1992，19(5)：398～400
11，原敏夫，等.日本食品科学杂志.1996，43(2)：172～175
12，Yoshikazu,Y.et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.1994,58(2):366～370
收稿日期：2000-04-26
修回日期：2000-06-13, 百拇医药
单位：谢秋玲(暨南大学生物工程所 广州 510632)；郭勇(暨南大学生物工程所 广州 510632)；林剑(华南理工大学食品与生物工程学院 广州 510641)
关键词：纳豆激酶 溶血栓活性 活性测定
广东药学000605 摘要 对先后建立的纤维平板法等几种测定纳豆激酶活性的方法进行概括总结介绍。
纳豆是由枯草杆菌(acillus subtilis)或纳豆菌(Bacillus natto)发酵大豆而成，在日本的食用历史已有2000年，深受日本人民的喜爱。很久以来，民间还将其作为预防和治疗心血管疾病的药品[1]。1987年须见洋行等首次从纳豆中提取了一种具有溶血栓作用的酶制剂，命名为纳豆激酶(简称NK)[2]。10年来对于纳豆激酶的特性、药理及生产等方面都有了进一步的研究[3～8]。而纳豆激酶活性测定方法作为研究的基础，也不断地建立并得到改进。现已有的活性测定方法包括以下几种。
, 百拇医药
1 纤维蛋白平板法
纤维蛋白平板法是最早用于NK活性测定的方法之一[2]，它是参照尿激酶(UK)或组织纤溶酶原激活剂(tPA)的测活方法而建立的。其原理是以凝血酶和纤维蛋白原作用制成人工血栓平板，注入NK，用溶解面积来表示NK的溶纤维活性[9]。
在培养皿中加入血纤维蛋白原(fibrinogen)溶液和凝血酶溶液，搅拌使其凝固制成平板。取不同浓度NK样品点于平板上，37℃恒温孵育18h，测其溶解圈直径。可以发现酶量与溶解面积成直线关系。
以标准NK或UK或纤溶酶(Plasimin)作为标准品作标准曲线。NK的活性单位定义为：在37℃ 1min内分解1 nmol溶解于0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)中的浓度5×10-4mol/L的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的NK量为1U。或者以UK或纤溶酶的活性单位来表示。
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纤维蛋白平板法以测得的纤维溶解面积来表示NK的活性，完全是表观值。如恒温孵育时间变化，测定值的变化很大。随着恒温时间的增加，所对应的值显著减少。比之NK精制产品，粗制酶活性测定受孵育时间影响更大，这可能是粗酶中杂质的影响。因此对恒温时间的控制是十分重要的。
2 纤维蛋白块溶解时间法
此法简称CLT法。纤溶酶、tPA、UK等溶血栓物质都以此方法来测定活性。测定NK活性的方法就是根据以上各种方法稍加变动而建立的[9]。
0℃下，在小试管中依次加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲溶液、NK溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌，置于37℃恒温水浴。从纤维蛋白形成开始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停止时，作为纤维蛋白溶解时间(CLT)。
同样以标准NK或UK或纤溶酶作为标准品，以CLT对NK浓度的对数作图，发现在10～70μg范围内有很好的线性关系。
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比较于平板法，CLT法迅速快捷，有较大的分辨率，且更适于粗酶的活性测定。但随着灵敏度的提高，溶解时间的判定也更加困难。除非有新型、方便的计时装置，否则同时测定多个样品是比较困难的。
3 四肽底物法
纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，具有275个氨基酸，与枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)同源性极高，其中与枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶 Carlsberg的同源性分别为85%和69%；而与枯草杆菌蛋白酶E只有两个氨基酸的差异[4]。而且NK与枯草杆菌蛋白酶E的催化中心和结合中心相同，因此有人用测定枯草杆菌蛋白酶E的方法来测定NK的活性[7]。其具体操作也可参照枯草杆菌蛋白酶E的测活方法[10]。
在四肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶液中加入NK酶液，在37℃水浴中孵育1min；测定单位时间内410nm处光吸收的变化。
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NK的活性定义为1min，水解Suc-AAPF-pNA时生成1μl-硝基苯胺的NK量为1U。
该方法简便易行，可迅速测定酶的活性。缺点是该方法所得到的蛋白酶活性并不能完全表示其溶纤维活性，二者之间是否有相关性有待进一步试验。
4 血清板法
血清板法是纤维平板法的改进[11]。其原理是，纤维形成初始，在655nm处的吸光度最大，随着NK的加入，使纤维溶解，从而吸光度下降。试验发现，吸光度的减少同NK的浓度成线性关系。
在血清板的小孔内依照平板法的制作方法，制成微型纤维平板，然后在每个孔内加入不同浓度的标准NK。反应开始4h内，每30min测定一次OD655值；计算出每个时间的OD655值同初始OD655值的差-ΔOD655，利用最小二乘法算出直线的斜率―-ΔOD655/h。以此斜率同NK浓度的对数作图，可得到良好的线性关系。
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该方法的优点是，可以同时测多个样品，而且在4h内可对酶活性进行测定，操作简便、快捷，样品消耗小，成本低。另外，-ΔOD655值的变异系数CV%在5%以内，可信度高。
应注意的一点是，人工血栓的制作对消光值的测定是有影响的。不过如果反应开始时小孔内的血栓的吸光值在0.2以上，那么人工血栓的调制对OD655值几乎没有太大的影响。
5 酶联免疫吸附法(ELISA)[12]
该法是以对NK有特异性的单克降抗体与NK发生特异结合，然后再同连有标志酶的多克隆抗体结合，形成一种类似三明治的结构，通过标志酶――即过氧化物酶的反应而测定NK的活性。
先将抗NK的单克隆抗体同NK酶孵育，之后再同多克隆抗体结合。加入新配制的底物溶液和2N H2SO4,测定490nm的吸光值。
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该法灵敏度很好，可达到0.1ng/ml。同时特异性好，同枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的交叉反应系数分别为0.0002%和0.00002%，由此可看出，具特异性的单克隆抗体同酶的结合位点不是催化中心。以经典的平板法所得出的NK溶血栓活性同ELISA法测得的NK量之间具有线性关系，回归方程为
Y(ELISA)=8.00X(平板法)-18.98，相关系数为0.967
这说明ELISA法可以很好地反映NK的溶血栓活性。
同时ELISA法同圆二色性谱等其他方法的结果相结合，对NK的结构探索提供了一定的参考数据，从中可以看出，温度的提高使NK活性下降，不是因为NK一级结构的破坏，而可能是破坏了酶的二级结构，包括α-螺旋和β-折叠。该法的缺点是操作复杂，成本高。
综上所述，NK的测活方法多样，各有优缺点。如今普遍使用的仍是经典的平板法和CLT法。得到一个更精确、更灵敏、更简便、更经济的NK测活方法是一个有待继续研究的课题。
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参考文献
1，须见洋行.日本酿造协会志.1990，85(8)：518～524
2，Suni,H.et al.Experientia.1987,43:1110～1111
3，须见洋行.化学与生物.1991，29(2)：119～123
4，Fujita,M.et al.Biochem.Biophy.Res.Commun.1993,197(3):1340～1347
5，Fujita,M.et al.Biol.Pharm.Bull.1995,18(9):1194～1196
6，Fujita,M.et al.Biol.Pharm.Bull.1995,18(10):1387～1391
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7，三?悟，竹内尚人.日本公开特许公报.94，153，977
8，傅俐，等.生物工程进展.1997，17(3)：31～33
9，须见洋行，等.日本酿造协会志.1993，88(6)：482～486
10，王贤舜，等.生物化学与生物物理进展.1992，19(5)：398～400
11，原敏夫，等.日本食品科学杂志.1996，43(2)：172～175
12，Yoshikazu,Y.et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.1994,58(2):366～370
收稿日期：2000-04-26
修回日期：2000-06-13, 百拇医药