洛沙坦抑制球囊损伤后内膜增生的机制初探
作者：宋卉 盛小刚 仇烨 李玉光
单位：宋卉(汕头大学医学院药理教研室 广东汕头 515031)；盛小刚(汕头大学医学院第一附属医院儿科 广东汕头 515041)；仇烨(汕头大学医学院第一附属医院儿科 广东汕头 515041)；李玉光(汕头大学医学院第一附属医院内科 广东汕头 515041)
关键词：球囊损伤 内膜增生 血管紧张素Ⅱ AT1受体 洛沙坦
广东药学000604 摘要 目的：初步探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)1亚型受体(AT1)拮抗剂洛沙坦(Losartan)对髂动脉球囊损伤后新生内膜的影响及其作用机制。方法：家兔36只，随机分为3组：对照组(con组，n=13),大剂量洛沙坦组(los H组，30mg/kg*d，n=13),小剂量洛沙坦组(los L组，7.5mg/kg*d，n=10)。1周后髂动脉球囊损伤手术，测定血浆丙二醛浓度(MDA)，平均动脉压(MAP)及术后4周的血管内膜面积等指标，并进行少量电镜观察。结果：los H组新生内膜面积较con组和los L组明显减小(P<0.01)；术后MDA较con组和los L组低(P<0.05);los H组和los L组MAP均较con组明显降低(P<0.05);los H组新生内膜的血管平滑肌细胞(VSMC)以收缩型为主，con组以分泌型为主。结论：洛沙坦对兔髂动脉球囊损伤所致的内膜增生有抑制作用，其机制似与降低血压无关。
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动脉球囊损伤诱导血管内膜增生、管腔狭窄，是经皮冠状动脉成形术(Percutenous transluminal coronary angioplasty,PTCA)术后再狭窄发生的重要机制。1989年Powell等[1]应用血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)西拉普利显著抑制了大鼠颈动脉球囊损伤术后内膜增生；此后，Rakugi等[2]发现损伤动脉局部AngⅡ合成增加，并引发一系列生长因子释放。这些研究提示，局部Ang Ⅱ的合成、释放增加可能是狭窄形成的重要原因之一。
我们在兔髂动脉球囊损伤模型上给予不同剂量的洛沙坦，观察洛沙坦对血管内皮球囊损伤引起血管组织学及生化变化的影响，并初步探讨洛沙坦对血管内膜增生的影响及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
, 百拇医药
健康家兔，雌雄不拘，共36只，体重2.00～2.25kg。
1.2 实验动物分组
动物随机分3组：①对照组(con组，n=13);普通饲料。②大剂量洛沙坦组(los H组，n=13)：洛沙坦30mg/kg*d(默沙东公司，批号HK-399531)。③小剂量洛沙坦组(los L组，n=10)；洛沙坦5mg/kg*d。将药物研磨后加入5～10ml水中灌胃，饲养5周。
1.3 建立兔髂动脉球囊损伤模型[3]
1周后用3%戊巴比妥钠1ml/kg经耳缘静脉麻醉，钝性分离右侧股动脉，结扎远侧段，近端拉线阻断血流，插管连接于八道电生理仪测定MAP，30min后，逆行插入PTCA球囊导管(Cordis公司产品，球囊直径2.0mm，长20mm)，深度约10cm，经压力推注泵向球囊内注入肝素生理盐水使其膨胀，并维持压力为4atm,缓慢回拉至入口处，抽空囊内液体，使压力降为零再送入导管，来回3遍后撤出导管，结扎动脉，缝合创口。术前静脉注射肝素300IU，术中、术后各肌注青霉素40万IU，所有手术过程均为无菌操作。
, 百拇医药
1.4 观察指标
1.4.1 MAP 给药前、术前及处死前经股动脉记录。
1.4.2 MDA 术前、术后2h取动脉血2ml，用硫代巴比妥酸显色法，按试剂盒(南京聚力生物工程研究所，批号9709、9712)操作测定。
1.4.3 病理观察 原位灌注及取材：术后4周将动物麻醉开腹，经上段腹主动脉插管恒压(110mmHg)灌注10%中性福尔马林20min后取髂动脉。组织处理：随机取髂动脉不同部位3～4处，每处连续切片2张，分别行苏木素-伊红(HE)及弹力纤维(VG)染色。
1.4.4 图像分析 将所有切片拍照、扫描后，以Sigmaplot图像处理软件测定新生内膜面积(为同一标本所有切片的均值)。
1.4.5 电镜观察 术后4周取los H组及con组各3只进行双侧髂动脉VSMC的透射电镜观察。
, 百拇医药
1.5 统计学处理
实验数据均以(
±s)表示，组内均数用配对资料的t检验，组间均数用完全随机设计资料的方差分析。
2 结果
2.1 MAP
术前及处死前，与con组相比，los H组和los L组均明显降低(表1)。
表1 各组血压变化比较(mmHg) 组别
例数(n)
给药前
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给药后1周
给药后5周
对照组
10
91.1±7.4
90.6±7.6
87.9±6.7
大剂量组
10
92.1±6.8
82.2±4.7*△
76.2±5.5☆★
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小剂量组
10
89.6±7.1
83.5±8.3*△
81.5±8.6*△
注：与对照组比：*P<0.05,☆P<0.01；与给药前组比：△P<0.05,★P<0.01 2.2 MDA
各组术后2h较术前升高，但los H组较los L组及con组低(P<0.01)(表2)。
表2 各组血浆MDA浓度变化(nmol/ml) 组别
, 百拇医药
例数(n)
术前
术后2h
对照组
10
4.17±0.34
5.68±0.56
大剂量组
10
4.23±0.28
5.09±0.37*△
小剂量组
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10
4.35±0.32
5.51±0.44
注：与对照组比：*P<0.05；与小剂量组比：△P<0.052.3 图像分析
管腔面积：los H组明显大于con 组(P<0.01);新生内膜面积：los H组明显小于con组(P<0.01)；los L组与con组的管腔与新生内膜面积无明显差异(表3，图1～2)。
2.4 电镜观察
未损伤动脉血管中VSMC含大量肌丝，较少细胞器，呈收缩型VSMC；内膜损伤4周后，con组的VSMC中含大量细胞器而少肌丝呈分泌型VSMC，而los H组细胞器相对较少，肌丝较多(图3～4)。
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表3 各组血管组织学变化 组别
例数(n)
管腔面积
新生内膜面积
对照组
10
0.189±0.039
0.169±0.032
大剂量组
10
0.271±0.021*△
0.097±0.019*△
, 百拇医药
小剂量组
10
0.195±0.012
0.153±0.024
注：与对照组比：*P<0.01；与小剂量组比：△P<0.01
图1 对照组球囊损伤术后4周(VG染色)×33，?显示新生内膜明显增厚；?内弹力板
, 百拇医药
图2 大剂量洛沙坦组球囊损伤术后4周(VG染色)
×33，?显示新生内膜；?内弹力板
图3 对照组球囊损伤术后4周VSMC(透射电镜)
X5K，见胞体增大，细胞器增多，肌丝减少
图4 大剂量洛沙坦组术后4周VSMC(透射电镜)
X5K，见细胞器相对较少，肌丝较多
, 百拇医药
3 讨论
本研究观察到，从球囊损伤术前1周至术后4周，应用洛沙坦30mg/kg*d可明显抑制兔髂动脉的新生内膜形成。其机制可能主要是通过拮抗血管局部AT1受体而阻断了AngⅡ的促内膜增生效应，而似与其降低血压关系不大。
AngⅡ与AT1受体结合后，可产生血压调节、促细胞生长等一系列生物学效应。AngⅡ与AT1受体结合引发其他生长因子的合成、分泌及VSMC胞内信号传递物质的增加等多种途径引起VSMC增殖、肥大、内膜下迁移，是血管新生内膜增厚、管腔狭窄的重要原因之一[4] 。洛沙坦作为一种新型、口服有效的非肽类AngⅡ的AT1受体拮抗剂，可特异性地与AT1受体的氨基酸结合，占据其多肽链螺旋空间，因此可在受体水平上阻断任何途径来源的AngⅡ，目前在临床上主要用于高血压病的治疗。本研究中发现，尽管小剂量的洛沙坦可明显降低家兔血压，但未能减少新生内膜面积。大剂量洛沙坦可明显减少新生内膜增生，扩大管腔面积，其机制可能与其抗过氧化损伤、抑制损伤诱导的VSMC由收缩型转为分泌型[5]，从而减少胞外基质形成有关。
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尽管目前尚无将其应用于临床防治再狭窄，但令人鼓舞的是最近发现洛沙坦能明显抑制AngⅡ诱导的人冠状动脉VSMC的蛋白合成和胞内Ca2+的增加[6]。洛沙坦抑制新生内膜增生的作用机制尚需进一步探讨。
参考文献
1，Powell JS,Clozel JP,Muller RK,Kuhn,H.Hefti F,Hosang M，Baumgather HR.Inhibitors of angiotensin-converting enzyme prevent myointimal proliferation after vascular injury.Science,1989,245:186～188
2，Rakugi H,Kim DK,Krieger JE,Wang DS,Dauz VJ，Pratt RE.Induction of angiotensinconvrting enzyme in the neointima after vascular injury.Possible role in restenosis.J Clin Invest,1994,93:339～346
, 百拇医药
3，Janiak P,Libert O,Vilaine JP.Role of the renin-angiotensin system in neointima formation after injury in rabbits.Hypertension.1994,24:671～678
4，Shiota.N,Okuishi H,Fukamizu A,Sakonjo H.Activation of two agiotensin generating systems in the balloon injured artery.FEBS Lett.1993,323:239
5，祁哲，高润霖，黄文英，等.去纤酶/764-3和肝素对血管成型术后平滑肌细胞增殖影响的实验研究.中国循环杂志.1996,74：232～235
6，Hafizi S,Chester AH,Allen SP,Morgan K,Yacoub MH.Growth response of human coronary smooth muscle cells to angiotensin Ⅱand influence of angiotensin AT1 receptor blockade.Coron Artery Dis.1998,9:167～175
收稿日期：2000-03-22
修回日期：2000-06-14, 百拇医药
单位：宋卉(汕头大学医学院药理教研室 广东汕头 515031)；盛小刚(汕头大学医学院第一附属医院儿科 广东汕头 515041)；仇烨(汕头大学医学院第一附属医院儿科 广东汕头 515041)；李玉光(汕头大学医学院第一附属医院内科 广东汕头 515041)
关键词：球囊损伤 内膜增生 血管紧张素Ⅱ AT1受体 洛沙坦
广东药学000604 摘要 目的：初步探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)1亚型受体(AT1)拮抗剂洛沙坦(Losartan)对髂动脉球囊损伤后新生内膜的影响及其作用机制。方法：家兔36只，随机分为3组：对照组(con组，n=13),大剂量洛沙坦组(los H组，30mg/kg*d，n=13),小剂量洛沙坦组(los L组，7.5mg/kg*d，n=10)。1周后髂动脉球囊损伤手术，测定血浆丙二醛浓度(MDA)，平均动脉压(MAP)及术后4周的血管内膜面积等指标，并进行少量电镜观察。结果：los H组新生内膜面积较con组和los L组明显减小(P<0.01)；术后MDA较con组和los L组低(P<0.05);los H组和los L组MAP均较con组明显降低(P<0.05);los H组新生内膜的血管平滑肌细胞(VSMC)以收缩型为主，con组以分泌型为主。结论：洛沙坦对兔髂动脉球囊损伤所致的内膜增生有抑制作用，其机制似与降低血压无关。
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动脉球囊损伤诱导血管内膜增生、管腔狭窄，是经皮冠状动脉成形术(Percutenous transluminal coronary angioplasty,PTCA)术后再狭窄发生的重要机制。1989年Powell等[1]应用血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)西拉普利显著抑制了大鼠颈动脉球囊损伤术后内膜增生；此后，Rakugi等[2]发现损伤动脉局部AngⅡ合成增加，并引发一系列生长因子释放。这些研究提示，局部Ang Ⅱ的合成、释放增加可能是狭窄形成的重要原因之一。
我们在兔髂动脉球囊损伤模型上给予不同剂量的洛沙坦，观察洛沙坦对血管内皮球囊损伤引起血管组织学及生化变化的影响，并初步探讨洛沙坦对血管内膜增生的影响及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
, 百拇医药
健康家兔，雌雄不拘，共36只，体重2.00～2.25kg。
1.2 实验动物分组
动物随机分3组：①对照组(con组，n=13);普通饲料。②大剂量洛沙坦组(los H组，n=13)：洛沙坦30mg/kg*d(默沙东公司，批号HK-399531)。③小剂量洛沙坦组(los L组，n=10)；洛沙坦5mg/kg*d。将药物研磨后加入5～10ml水中灌胃，饲养5周。
1.3 建立兔髂动脉球囊损伤模型[3]
1周后用3%戊巴比妥钠1ml/kg经耳缘静脉麻醉，钝性分离右侧股动脉，结扎远侧段，近端拉线阻断血流，插管连接于八道电生理仪测定MAP，30min后，逆行插入PTCA球囊导管(Cordis公司产品，球囊直径2.0mm，长20mm)，深度约10cm，经压力推注泵向球囊内注入肝素生理盐水使其膨胀，并维持压力为4atm,缓慢回拉至入口处，抽空囊内液体，使压力降为零再送入导管，来回3遍后撤出导管，结扎动脉，缝合创口。术前静脉注射肝素300IU，术中、术后各肌注青霉素40万IU，所有手术过程均为无菌操作。
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1.4 观察指标
1.4.1 MAP 给药前、术前及处死前经股动脉记录。
1.4.2 MDA 术前、术后2h取动脉血2ml，用硫代巴比妥酸显色法，按试剂盒(南京聚力生物工程研究所，批号9709、9712)操作测定。
1.4.3 病理观察 原位灌注及取材：术后4周将动物麻醉开腹，经上段腹主动脉插管恒压(110mmHg)灌注10%中性福尔马林20min后取髂动脉。组织处理：随机取髂动脉不同部位3～4处，每处连续切片2张，分别行苏木素-伊红(HE)及弹力纤维(VG)染色。
1.4.4 图像分析 将所有切片拍照、扫描后，以Sigmaplot图像处理软件测定新生内膜面积(为同一标本所有切片的均值)。
1.4.5 电镜观察 术后4周取los H组及con组各3只进行双侧髂动脉VSMC的透射电镜观察。
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1.5 统计学处理
实验数据均以(
±s)表示，组内均数用配对资料的t检验，组间均数用完全随机设计资料的方差分析。2 结果
2.1 MAP
术前及处死前，与con组相比，los H组和los L组均明显降低(表1)。
表1 各组血压变化比较(mmHg) 组别
例数(n)
给药前
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给药后1周
给药后5周
对照组
10
91.1±7.4
90.6±7.6
87.9±6.7
大剂量组
10
92.1±6.8
82.2±4.7*△
76.2±5.5☆★
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小剂量组
10
89.6±7.1
83.5±8.3*△
81.5±8.6*△
注：与对照组比：*P<0.05,☆P<0.01；与给药前组比：△P<0.05,★P<0.01 2.2 MDA
各组术后2h较术前升高，但los H组较los L组及con组低(P<0.01)(表2)。
表2 各组血浆MDA浓度变化(nmol/ml) 组别
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例数(n)
术前
术后2h
对照组
10
4.17±0.34
5.68±0.56
大剂量组
10
4.23±0.28
5.09±0.37*△
小剂量组
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10
4.35±0.32
5.51±0.44
注：与对照组比：*P<0.05；与小剂量组比：△P<0.052.3 图像分析
管腔面积：los H组明显大于con 组(P<0.01);新生内膜面积：los H组明显小于con组(P<0.01)；los L组与con组的管腔与新生内膜面积无明显差异(表3，图1～2)。
2.4 电镜观察
未损伤动脉血管中VSMC含大量肌丝，较少细胞器，呈收缩型VSMC；内膜损伤4周后，con组的VSMC中含大量细胞器而少肌丝呈分泌型VSMC，而los H组细胞器相对较少，肌丝较多(图3～4)。
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表3 各组血管组织学变化 组别
例数(n)
管腔面积
新生内膜面积
对照组
10
0.189±0.039
0.169±0.032
大剂量组
10
0.271±0.021*△
0.097±0.019*△
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小剂量组
10
0.195±0.012
0.153±0.024
注：与对照组比：*P<0.01；与小剂量组比：△P<0.01
图1 对照组球囊损伤术后4周(VG染色)×33，?显示新生内膜明显增厚；?内弹力板
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图2 大剂量洛沙坦组球囊损伤术后4周(VG染色)
×33，?显示新生内膜；?内弹力板
图3 对照组球囊损伤术后4周VSMC(透射电镜)
X5K，见胞体增大，细胞器增多，肌丝减少
图4 大剂量洛沙坦组术后4周VSMC(透射电镜)
X5K，见细胞器相对较少，肌丝较多
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3 讨论
本研究观察到，从球囊损伤术前1周至术后4周，应用洛沙坦30mg/kg*d可明显抑制兔髂动脉的新生内膜形成。其机制可能主要是通过拮抗血管局部AT1受体而阻断了AngⅡ的促内膜增生效应，而似与其降低血压关系不大。
AngⅡ与AT1受体结合后，可产生血压调节、促细胞生长等一系列生物学效应。AngⅡ与AT1受体结合引发其他生长因子的合成、分泌及VSMC胞内信号传递物质的增加等多种途径引起VSMC增殖、肥大、内膜下迁移，是血管新生内膜增厚、管腔狭窄的重要原因之一[4] 。洛沙坦作为一种新型、口服有效的非肽类AngⅡ的AT1受体拮抗剂，可特异性地与AT1受体的氨基酸结合，占据其多肽链螺旋空间，因此可在受体水平上阻断任何途径来源的AngⅡ，目前在临床上主要用于高血压病的治疗。本研究中发现，尽管小剂量的洛沙坦可明显降低家兔血压，但未能减少新生内膜面积。大剂量洛沙坦可明显减少新生内膜增生，扩大管腔面积，其机制可能与其抗过氧化损伤、抑制损伤诱导的VSMC由收缩型转为分泌型[5]，从而减少胞外基质形成有关。
, http://www.100md.com
尽管目前尚无将其应用于临床防治再狭窄，但令人鼓舞的是最近发现洛沙坦能明显抑制AngⅡ诱导的人冠状动脉VSMC的蛋白合成和胞内Ca2+的增加[6]。洛沙坦抑制新生内膜增生的作用机制尚需进一步探讨。
参考文献
1，Powell JS,Clozel JP,Muller RK,Kuhn,H.Hefti F,Hosang M，Baumgather HR.Inhibitors of angiotensin-converting enzyme prevent myointimal proliferation after vascular injury.Science,1989,245:186～188
2，Rakugi H,Kim DK,Krieger JE,Wang DS,Dauz VJ，Pratt RE.Induction of angiotensinconvrting enzyme in the neointima after vascular injury.Possible role in restenosis.J Clin Invest,1994,93:339～346
, 百拇医药
3，Janiak P,Libert O,Vilaine JP.Role of the renin-angiotensin system in neointima formation after injury in rabbits.Hypertension.1994,24:671～678
4，Shiota.N,Okuishi H,Fukamizu A,Sakonjo H.Activation of two agiotensin generating systems in the balloon injured artery.FEBS Lett.1993,323:239
5，祁哲，高润霖，黄文英，等.去纤酶/764-3和肝素对血管成型术后平滑肌细胞增殖影响的实验研究.中国循环杂志.1996,74：232～235
6，Hafizi S,Chester AH,Allen SP,Morgan K,Yacoub MH.Growth response of human coronary smooth muscle cells to angiotensin Ⅱand influence of angiotensin AT1 receptor blockade.Coron Artery Dis.1998,9:167～175
收稿日期：2000-03-22
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