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编号:10237385
支链氨基酸对动物实验性肝损伤作用的研究
http://www.100md.com 《广东医学》 2000年第6期
     作者:文洁 许华 俞励平 湛泽成 孙素兰

    单位:文洁(中山医科大学药物开发中心 广州 510080);许华(暨南大学医药生物技术研究开发中心 广州 510632);俞励平(中山医科大学药物开发中心 广州 510080);湛泽成(广州侨光制药厂 广州 510140);孙素兰(中山医科大学药物开发中心 广州 510080)

    关键词:支链氨基酸 D-氨基半乳糖胺盐酸盐肝损伤 四氯化碳肝损伤

    广东药学000602 摘要 目的:研究支链氨基酸(Branched Chain Amino Acid,BCAA)对动物实验性肝损伤的保护作用。方法:采用化学毒物D-氨基半乳糖胺盐酸盐(D-Galn)急性肝损伤模型,四氯化碳(CCl4)急性肝损伤模型,观察支链氨基酸对肝损伤动物生化指标和病理组织学改变的影响。结果:1.支链氨基酸高、低剂量组均对小鼠D-Galn肝损伤ALT及AST增高有明显的降低作用(P<0.01、P<0.05),支链氨基酸+乙肝宁联合用药组比单纯用乙肝宁组降酶作用更强(P<0.01)。病理组织学检查结果:支链氨基酸对D-Galn引起的肝细胞变性、坏死等病变有明显改善作用,与模型组相比,高剂量组改善56.4%,低剂量组改善52%,乙肝宁+氨基酸混合用药组改善更明显为71.6%。2.支链氨基酸高剂量组对大鼠CCl4肝损伤ALT、AST活性增加及胆红素含量增高有明显的降低作用(P<0.01)。病理组织学检查结果:支链氨基酸对CCl4肝损伤引起的肝细胞变性、坏死等病变有明显改善作用,与模型组相比,高剂量组改善27%,乙肝宁+氨基酸混合用药组改善28.2%。结论:支链氨基酸对小鼠D-Galn肝损伤及大鼠CCl4肝损伤具有保护作用。
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    支链氨基酸(BCAA)由异亮氨酸、亮氨酸及缬氨酸组成。临床上用于改善氨基酸失衡,促进蛋白质合成和减少蛋白质分解,用于肝性脑病的防治[1~3]。并有文献报道,BCAA对大鼠心肌缺血损伤具有一定的防护作用[4];BCAA与复方丹参注射液合用治疗病毒性乙型肝炎、肝硬化腹水、治疗尿毒症能提高疗效[5、6]。本研究采用小鼠D-Galn肝损伤模型和大鼠CCl4肝损伤模型探讨体内补充支链氨基酸以及和其它护肝药合用时是否能减轻动物肝损伤的程度。

    1 材料

    1.1 药品

    支链氨基酸:广州侨光制药厂研制及提供,批号981201;实验时用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液配制成适宜浓度溶液备用。乙肝宁片:青海三普药业公司,批号980318-1;实验时用蒸馏水配制使用。
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    1.2 试剂

    D-氨基半乳糖胺盐酸盐(D-galactosamine):美国Sigma公司产品,纯度大于99%,批号87H0147;实验时用注射用水配制成水溶液备用。四氯化碳:分析纯,批号971101-22,江苏洪声化工厂产品。谷丙转氨酶试剂盒:批号981004;谷草转氨酶试剂盒:批号980801,上海生物制品研究所产品。

    1.3 动物

    昆明种小鼠,体重18~20g,合格证号26-98A002。SD大鼠,体重150~180g,合格证号26-99A019,均购于中山医科大学实验动物中心。

    1.4 仪器

    721型分光光度计,上海第三分析仪器厂生产。

    2 方法
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    2.1 方法[7、8]

    取健康小鼠72只,随机分成6组,每组12只。给药组分别以支链氨基酸1260mg/kg、420mg/kg、乙肝宁3000mg/kg、混合用药(乙肝宁3000mg/kg+支链氨基酸1260mg/kg),灌胃给药,灌胃容积0.2ml/10g,每日1次,连续7d,模型组和正常组给以等容积的0.5%CMC-Na溶液。模型组和各给药组于实验第7天分别ip D-Galn 800mg/kg,第8天各组断头取血,分别测定ALT活性(赖氏法)、AST活性(赖氏法)。将实验结果进行统计学处理,组间显著性差异采用t检验。并取肝组织作病理组织学检查。

    2.2 方法[7、9]

    取健康大鼠60只,雌雄各半,随机分成6组,每组10只。给药组分别以支链氨基酸900mg/kg、300mg/kg、乙肝宁2100mg/kg、混合用药(乙肝宁2100mg/kg+支链氨基酸300mg/kg)灌胃给药,灌胃容积1ml/100g,每日1次,连续7d,模型组和正常组给以等容积的0.5%CMC-Na溶液。模型组和各给药组于实验第1、第5天分别s.c纯CCl4 5ml/kg,于实验第8天摘眼球取血,分别测定ALT活性(赖氏法)、AST活性(赖氏法)及胆红素含量(苯甲酸钠-咖啡因比色法)。将实验结果进行统计学处理,组间显著性差异采用t检验。
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    2.3 取肝脏作病理组织学检查

    病理评价标准:

    ①积分计算 正常=0分

    ②改善率%=(模型组积分-给药组积分)/模型组积分×100%

    表1 肝脏病理组织学评价标准 肝细胞变性(0~0.4分)

    肝细胞坏死(0~1分)

    炎症(0~0.3分)

    嗜酸性

    浊肿

    疏松

    空泡
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    水样变性

    固缩

    巨核

    破碎

    嗜酸小体

    坏死

    间质

    汇管区

    灶性

    +

    ++

    +++

    +

    ++
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    +

    ++

    +

    ++

    0.1

    0.2

    0.1

    0.1

    0.2

    0.3

    0.3

    0.4

    0.5

, 百拇医药     0.2

    0.5

    0.6

    0.7

    0.8

    1

    0.1

    0.2

    0.3

    3 结果

    3.1 BCAA对小鼠D-Galn肝损伤ALT、AST活性的影响

    与正常对照组比较,模型组注射D-Galn 24h后,ALT活性平均从67.3±10.9U升至193.6±18.0U(P<0.01)。与模型组相比,支链氨基酸高、低剂量组SLT值分别为124.5±22.1U(P<0.01)、150.0±58.8U(P<0.05);乙肝宁组、混合用药组ALT分别为159.4±29.5U(P<0.01)、103.4±27.7U(P<0.05),均可显著降低ALT活性,且混合用药组降酶作用比单纯用乙肝宁组作用更强(P<0.01)。
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    与正常对照组比较,模型组注射D-Galn 24h后AST活性从166.4±33.0U升至266.5±21.5(P<0.01)。与模型组相比,支链氨基酸高剂量组AST值为219.8±45.6U(P<0.05),乙肝宁组241.8±22.0U(P<0.05)、混合用药组197.2±33.6U(P<0.01),均可显著降低AST活性,且混合用药组降酶作用比单纯用乙肝宁组作用更强(P<0.01)。

    结果见表2。

    表2 对小鼠D-Galn肝损伤ALT及AST活性的影响(0.gif (881 bytes)±s,n=12) 组别

    剂量(mg/kg)

    ALT/U
, 百拇医药
    AST/U

    正常组

    -

    67.3±10.9

    166.4±33.0

    模型组

    -

    193.6±18.0***

    266.5±21.5***

    大剂量组(BCAA)

    1260

    124.5±22.1△△△
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    219.8±45.6△△

    小剂量组(BCAA)

    630

    150.0±58.8△△△

    242.3±44.0

    混合药组

    1260±3000

    103.4±27.7△△△###

    197.2±33.6△△△###

    乙肝宁组
, 百拇医药
    3000

    159.4±29.5△△

    241.8±22.0△△

    *和正常组相比 *P>0.05,**P<0.05,***P<0.01 和模型组相比 P>0.05,△△P<0.05,△△△P<0.01#和乙肝宁组比 #P>0.05,##P<0.05,###P<0.01

    3.2 BCAA对小鼠D-Galn肝损伤病理组织学变化

    3.2.1 对照组 镜下可见小鼠肝组织均正常,肝小叶边界清晰,肝细胞索状放射排列,中央静脉无扩张,肝细胞大小正常,无变性和坏死,部分动物肝小叶内间质细胞较活跃。
, 百拇医药
    3.2.2 模型组 镜下可见肝小叶边界不清,肝索消失,部分动物可见肝细胞嗜酸性变及核深染,个别动物可见肝细胞浊肿或脂变,全部动物肝组织内以嗜酸小体为主并伴有肝细胞核膜消失,核仁碎裂,偶见巨核细胞,此外可见间质细胞灶性增生。

    3.2.3 支链氨基酸组、乙肝宁组、支链氨基酸+乙肝宁组 动物均可见肝细胞变性、坏死细胞比模型组明显改善,无空泡变性和水样变性,特别是嗜酸小体及坏死灶明显减少。其中支链氨基酸高剂量组改善56.4%、低剂量组改善53.7%、乙肝宁组改善40.4%、混合用药组改善71.6%。结果见表3。

    表3 对D-Galn致小鼠肝损伤病理检查评分结果(n=12) 组别

    肝细胞变性

    坏死

    炎症
, 百拇医药
    总分

    平均分

    改善率(%)

    对照组

    0.6

    0

    0.4

    1

    0.10

    模型组

    0.9

    17.6

    3.3
, 百拇医药
    21.8

    2.18

    高剂量组

    0.4

    6.5

    2.6

    9.5

    0.95

    56.4

    低剂量组

    1.1

    8.0

    1.0
, 百拇医药
    10.1

    1.01

    53.7

    乙肝宁组

    0.9

    8.4

    3.7

    13.0

    1.30

    40.4

    混合药组

    1.3

    2.9
, 百拇医药
    2.0

    6.2

    0.62

    71.6

    3.3 BCAA对大鼠CCl4肝损伤ALT、AST活性的影响

    与正常对照组比较,模型组ALT活性平均从64.8±14.3U升至243.1±26.4U(P<0.01)。和模型组相比,支链氨基酸高、低剂量ALT分别为179.9±47.6U和222.5±39.2U,高剂量组ALT明显降低(P<0.01),低剂量组无明显差异(P>0.05);乙肝宁组及混合用药组ALT活性平均为202.0±35.5U、198.6±39.8U,有显著性差异(P<0.05)。乙肝宁组与混合用药组间比较则无显著性差异(P>0.05)。

    与正常对照组比较,模型组AST活性从163.7±10.4U升至334.7±51.7U(P<0.01)。和模型组相比,支链氨基酸高、低剂量组ALT分别为267.6±38.5U和295.1±28.0U,高剂量组AST明显降低(P<0.01),低剂量组无明显差异(P>0.05)。乙肝宁组及混合用药组AST活性平均为273.7±21.4U(P<0.01)、272.6±32.4U(P<0.05),有显著性差异。乙肝宁组与混合用药组间比较无显著性差异(P>0.05)。
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    3.4 BCAA对大小鼠CCl4肝损伤胆红素含量的影响

    与正常对照组比较,模型组胆红素含量显著增高6.57±1.37μmol/L(P<0.01)。和模型组相比,支链氨基酸高剂量组的胆红素含量为3.88±1.09μmol/L(P<0.01)有显著性差异;低剂量组胆红素含量6.16±1.53μmol/L(P>0.05)无显著性差异;高、低剂量组间在统计学上有显著性差异(P<0.05)。乙肝宁组与混合用药组间比较(P>0.05)无显著性差异。结果见表4。表4 对大鼠CCl4肝损伤ALT、AST活性及胆红素的影响(0.gif (881 bytes)±s,n=10) 组别

    剂量(mg/kg)

    ALT/U
, 百拇医药
    AST/U

    胆红素(μmol/L)

    正常组

    -

    64.8±14.3

    163.7±10.4

    2.85±1.41

    模型组

    -

    243.1±26.4***

    334.7±51.7***

    6.57±1.37***
, 百拇医药
    大剂量组

    900

    179.9±47.6△△△

    267.6±38.5△△△

    3.88±1.09△△△

    小剂量组

    300

    222.5±39.2

    295.1±28.0

    6.16±1.53
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    乙肝宁组

    2100

    202.0±35.5△△

    273.7±21.4△△△

    4.95±1.60△△

    混合组

    300±2100

    198.6±39.8△△#

    272.6±32.4△△#

    4.63±1.39△△#
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    *和正常组相比 *P>0.05,**P<0.05,***P<0.01 和模型组相比 P>0.05,△△P<0.05,△△△P<0.01#和乙肝宁组比 #P>0.05,##P<0.05,###P<0.01

    3.5 BCAA对大鼠CCl4肝损伤病理组织学变化

    3.5.1 对照组 镜下可见大鼠肝组织的肝小叶结构清晰,肝细胞围绕中央静脉呈放射性排列,肝细胞大小正常,无变性和坏死。间质细胞增生活跃,偶见个别细胞嗜酸性变。

    3.5.2 模型组 全组动物均显示典型中毒性肝损害病理改变。肝小叶边界不清,肝索消失,肝小叶中央区的肝细胞均可见大、中、小空泡,大部分动物的肝小叶中央静脉壁和血管损伤,其周围肝细胞坏死,并可见细胞核膜消失,核仁碎裂,嗜酸小体,坏死灶周围有水样变性,灶内有红细胞、少量中性球和淋巴球。
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    3.5.3 给药组 乙肝宁组、低剂量组各9只动物肝组织以中央静脉周围出现肝细胞坏死和水样变性,细胞变性核坏死程度较模型组稍轻。高剂量组动物中有5只动物肝组织的肝细胞轻度坏死,中、小型肝细胞脂变伴有水样变性,3只动物肝细胞可见嗜酸小体及核膜消失核碎裂细胞。混合用药组:6只动物可见肝细胞组织涵管区周围肝细胞坏死及水样变性,损伤程度和高剂量组相接近。

    从各组动物肝细胞病理改变可见,支链氨基酸组肝细胞变性和坏死比模型组改善27.0%,混合用药组比模型组改善28.2%。显示支链氨基酸对CCl4肝损伤的保护作用只见于高剂量组和混合用药组。结果见表5。表5 对CCl4致大鼠肝损伤病理检查评分结果(n=10) 组别

    肝细胞变性

    坏死

    炎症
, 百拇医药
    总分

    平均分

    改善率(%)

    对照组

    0.4

    0

    1.6

    2

    0.20

    模型组

    8.7

    12.9

    3.2
, 百拇医药
    24.8

    2.48

    高剂量组

    6.6

    8.1

    3.4

    18.1

    1.81

    27.0

    低剂量组

    6.7

    16.6

    3.3
, 百拇医药
    26.6

    2.66

    乙肝宁组

    7.5

    11.6

    1.7

    20.8

    2.08

    16.1

    混合药组

    6.2

    9.3

    2.3
, 百拇医药
    17.8

    1.78

    28.2

    4 讨论 肝脏是氨基酸代谢的主要器官。正常情况下,由于肝内有关氨基酸代谢的酶含量丰富,氨基酸代谢十分活跃。当发生肝损伤或病变时,由于肝功能出现障碍,肝细胞内氨基酸代谢降低,导致血中氨基酸浓度增高,甚至会从尿中丢失,从而造成体内氨基酸缺乏。补充氨基酸是否有助于肝损害的恢复呢?有实验表明,动物缺乏蛋白质数周后,可形成大块肝坏死[10],而补充氨基酸可明显减轻由D-Galn及CCl4引起的实验性肝损伤,使血浆转氨酶和胆红素浓度降低,促进肝损伤的恢复[11]。有人还认为,肝功能明显损害时,由于胰岛素无法减少,引起高胰岛素血症,使BCAA被肌肉清除过多,血中此类BCAA明显降低,与色氨酸竞争入脑的作用减弱,于是色氨酸入脑加多,引起5-羟色胺增加,使肝昏迷加重[10]。实验证明,补充BCAA可防止肝毒剂引起的肝毒性,并降低血、脑氨浓度[12];临床上BCAA与胰高血糖素-胰岛素合用治疗重症病毒性肝炎可明显提高其存活率[13];治疗重症肝炎,可通过调整氨代谢异常来治疗和预防肝昏迷,且可恢复衰竭肝脏的代谢功能[14]。表明氨基酸补充疗法对肝损伤的治疗作用。
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    本研究结果则表明,支链氨基酸能明显降低D-Galn及CCl4引起的血清转氨酶、胆红素增高,对D-Galn及CCl4肝损伤所致的肝细胞变性、坏死等病变有较好的改善作用;而且支链氨基酸与乙肝宁合用比单纯用乙肝宁的降酶作用更强。

    本研究在CCl4模型预试中发现,在第二次注射CCl4后次日(即第6天)测定ALT、AST和胆红素,用药组和模型组无明显差异,但第8天则可见用药组明显降低。因此我们选用了第8天进行检测。

    从病理组织学结果看,无论是D-Galn还是CCl4肝损伤,与模型组相比,各给药组对肝细胞变性、坏死等病变都有不同程度的改善,尤其是D-Galn肝损伤,给药组改善率较高,说明补充支链氨基酸,不仅有效的改善了肝功能,而且对动物实验性肝损伤具有保护作用,有重要的临床治疗意义。

, 百拇医药     参考文献

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    收稿日期:2000-03-09

    修回日期:2000-06-07, 百拇医药