造血干细胞基因治疗的问题与对策
作者：陆华中 薛京伦
单位：200433 上海，复旦大学遗传研究所[(现在上海市血液中心、上海输血研究所)
关键词：
中华血液学杂志000620 造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是最早、也是公认为最理想的基因治疗靶细胞之一。基因治疗临床方案近三分之一涉及到HSC[1]。主要基于以下几方面的原因：①造血干细胞是一种“永生性”细胞；②造血干细胞具有很强的增殖、分化与自我更新能力；③造血干细胞及其子代细胞直接与血液相接触，或存在于血液循环之中，极利于转染细胞的表达产物释放入血液；④HSC从采集、分离到体外培养、扩增以及自体或异体移植等已具备一套成熟的技术路线，并已为临床所普遍应用。从而为HSC基因治疗奠定了极好的细胞移植学基础。如果能将HSC基因治疗与HSC移植很好地结合起来，有望为人类疾病的治疗提供一种全新的手段和理想模式。然而，由于目前载体系统的缺陷，HSC基因治疗仍存在许多问题有待克服。这些问题的解决将取决于基因转移系统的进一步改进，新型载体系统的开发以及人们对于HSC细胞生物学本质的进一步阐明。
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1 逆转录病毒介导的HSC基因治疗 逆转录病毒载体(Retrovirus vector,RV)仍是目前用于HSC基因治疗最多的一个系统。早期研究显示，利用RV介导在小鼠HSC可获得20%～30%的基因转移率。然而，在大动物及人类试验中，RV介导HSC的基因转移率仅为1%～2%，甚到低至0.1%～1%[2]。因此，对于RV介导的HSC基因治疗而言，最大的问题便是基因转导效率低下。为何RV介导HSC的基因转移率如此之低?而且，在小鼠与人之间的差异又如此之大呢?当然，原因是复杂的。一方面因为RV只能在细胞处于分裂期，核膜破裂时才能进入核内。而对处在非分裂期，核膜完整的细胞，RV则不能有效地进入其细胞核。然而，在正常情况下，人体95%的HSC均处于非分裂状态的G0/G1期。因此，RV不能有效地进入人HSC的细胞核。而在小动物，比如小鼠，其HSC的周期状态以及其HSC表面的受体密度与人类及大动物存在的差异可能较利于RV的进入。在人类HSC体外培养体系中应用刺激因子虽可促进干细胞进入细胞周期状态，但体外扩增难以完全模拟体内环境，经过一段时间的培养，HSC便丧失了干细胞的特征，即成为祖细胞或更晚期的细胞了。那么，能否让HSC进入细胞周期，而又不分化为晚期呢?可以说，这是目前HSC研究所面临的最大的细胞生物学难题之一。目前的对策仅仅是在以下方面作一些探索，①调整培养体系。使用哪些细胞因子来进行体外处理、以怎样的比例进行组合等，目前尚未得出一致的结论。②缩短细胞体外处理时间。采用短期培养方案，以使得HSC不足以有充分的机会进行增殖、分化。③应用骨髓基质支持培养体系模拟体内环境。比如，采用HSC与间质细胞共培养，以使得HSC进入细胞周期后不是进行增殖，而是在体外进行自我更新。这也许是最理想的结果，既增加了细胞的数量，又保持了干细胞的本质特点。事实上，目前还不可能做到这一点。④探讨新的促分化抑制剂，以阻止HSC向晚期细胞的分化。比如，应用抗TGF-β抗体，以抑制TGF-β对HSC的促分化作用。另外的方法是采用骨髓替代途径的干细胞来源。比如开发脐带血干细胞和经动员的外周血干细胞[3]。据观察发现，RV介导脐血干细胞的基因转移率比骨髓干细胞高。正是因为脐血干细胞更多地处于细胞周期之中。
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另一方面，RV介导HSC基因转移是受体介导的。然而，在正常情况下人体HSC表面的RV受体分布较少[4]，不利于RV的进入。目前，人们正试图通过刺激RV受体的表达来增加HSC的基因转移率。当然，影响RV介导HSC基因转移率的因素很多。比如，RV在37?℃时的胞外半衰期很短。而病毒颗粒在培养体系中的活动能力不强。由于干细胞数量少，在转导体系中，RV与HSC相互碰撞的机率不高，也影响了基因转移率。为此，曾有研究者试图利用离心的办法来增加RV与HSC之间的接触。但离心会导致干细胞的损伤。亦有人采用转动的方式进行RV介导HSC的基因转移试验，或者在病毒液中加入纤维连接素(fibronection),使病毒颗粒更易于接触到干细胞表面。从而，提高其基因转移率。近年来，也有通过假病毒途径，比如利用长臂猿白血病病毒(GALV)的包装蛋白来包装RV，制备假病毒载体[5]，从而提高RV介导的基因转移率。
此外，由于RV曾有导致黑猩猩恶性T细胞淋巴瘤的报道，因此，不可能直接用于人体体内试验。这也是RV介导HSC基因治疗的又一大问题，即安全性问题。目前，RV介导基因治疗一般采用ex vivo途径，以便及时发现并去除可能出现的突变细胞，以确保基因治疗的安全性。然而，所有这些策略都未从根本上解决问题。因此，不少研究人员已把目光转向开发其它的基因转移系统。希望能找到一个更适合于HSC基因转移的理想体系。
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2 腺相关病毒介导的HSC基因治疗 如上所述，RV在介导HSC基因转移方面存在许多难以克服的缺陷。为此，一些研究人员把注意力转向腺相关病毒载体(Adeno-associated virus vector,AAV)，以探讨该基因转移系统介导HSC基因治疗的可能性。AAV是一种人类细小病毒，它最初是在腺病毒流行期间作为一个共感染因子被人们发现的。AAV本身没有任何显著的致病作用。到目前为止，尚未发现任何由AAV所致的人类疾病。因此，AAV被认为是一种用于人类基因治疗很有前途的安全载体。与RV相比，AAV的最大优势在于其可感染分裂或非分裂细胞，如HSC、肝细胞以及终未细胞，如肌细胞、上皮细胞等，同时，它还具有多方面的特点，比如，①无致病性；②低免疫原性；③可整合或定点整合；④宿主范围广等[6]。
目前，以AAV作载体所进行的基因治疗研究可谓是方兴未艾。美国费城儿童医院与Avigen公司合作，已申请AAV介导血友病B基因治疗临床试验。然而，作为一个基因转移系统，与RV相比AAV载体系统还显“年轻”。同样，还有许多问题有待克服。这些问题表现在：①制备困难，尤其是大量制备。经典的rAAV制备方法不仅仅需要辅助质粒提供反式蛋白，而且还需要辅助病毒，如Ad或HSV的存在，以辅助其复制，费时、费力，而且病毒粒子的产量很低，难以满足临床及大动物实验所需。目前，许多实验正试图通过杂合病毒系统，比如AAV/HSV杂合病毒的应用来解决这一问题。②定点整合特征的丧失。野生型AAV可特异地定点整合于人的19号染色体。然而，重组AAV往往丧失这一特征。这将导致因随机整合所带来的基因治疗危险性的增加。近来，人们正致力于恢复AAV定点整合的能力，以确保其安全性[7]。③靶向性问题。AAV载体的宿主范围很广，这是优点。反过来讲，这又导致了该载体靶向性方面的缺陷。目前应用得最多的AAV转导细胞是肌细胞。但有研究者观察到AAV在肌肉细胞中可能不发生整合，而是在细胞核内以一种AAV与染色质紧密结合的方式存在，其次是以肝细胞作为靶细胞所进行的探讨。然而，由于制备困难，体内应用常难以获得足够数量的转染细胞数。因此，在大动物应用后目的基因在体内的总体表达水平仍很低，难以满足临床治疗的需要。由于HSC独具魅力的增殖、分化潜能以及其成熟的体外培养与移植技术，自然会被不少研究者所看好。因此，早已有人利用AAV进行HSC基因转移的探索。遗憾的是，AAV介导HSC基因转移的效率并不十分理想，而且在不同个体之间差异很大[8]。现已证实AAV不能感染巨核细胞系。近来有研究试图通过对AAV Cap包装蛋白进行改造，即将Kit受体配基序列嵌合于Cap蛋白之中，以增加AAV与HSC的特异性结合能力[9]，但其结果同样并不令人满意。有关AAV分子病毒学的研究显示，AAV对细胞的进入也是受体介导的，而且，涉及到两步受体介导过程。即基础受体(primary receptor)，如柯萨奇腺病毒受体、HSPG受体和共受体(coreceptor)，如αV整合素、HVEM以及FGFR1受体等。有研究证实，如果细胞表面仅表达基础受体，如HSPG，而无共受体表达，则不能导致AAV的有效感染[10]。可见，AAV介导进入细胞的机制十分复杂。同时，AAV载体的包装蛋白亦很难进行改造。也许，真正的出路是另辟蹊径寻找其它新的途径，比如假病毒途径。目前，我所正在进行AAV/SV40假病毒介导HSC基因转移的研究工作。其中部分原因即在于利用SV40对HSC的高效感染性。
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3 SV40介导的HSC基因治疗 SV40是乳多空病毒属的一种，为大约5.2kb大小的双链DNA病毒。SV40对人体无害。50年代，在美国曾发生一起脊髓灰质炎疫苗被SV40病毒污染而误用于人体的事件。当时，约几百万不同年龄的人群接受这种被污染疫苗的接种。所幸的是，未发生一起因SV40病毒感染所致的疾病。临床上也未发现任何与SV40有关的病例报道。因此，也被作为一种基因治疗的载体而被人们所应用。早在80年代就有利用SV40介导骨髓细胞基因转移的研究报道，但早期SV40载体的制备过程中野生病毒污染严重，野生病毒的污染率高达90%，无法用于人体[11]，制约了SV40载体的应用。近年来Oppenheim等[12]在SV40载体制备方面做了大量的工作。他们发现SV40包装蛋白具有许多独特的包装特点，不仅可包装含有小至150?bp SV40序列的基因片段，而且还可在试管内于控制条件下，由昆虫细胞系统提供包装蛋白来包装由Ecoli制备的质粒DNA，从而制备出SV40假病毒粒子。这一体外包装技术的出现为人类充分利用病毒的特点，包装出具有非病毒意义的安全的基因治疗载体提供了可能。这一工作才刚刚开始，还有许多问题有待解决，首先必须纯化由昆虫系统提供的包装蛋白提取物，以便更准确地进行包装及调控；其次就是进一步增加包装效率，以达到大量制备的目的。
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SV40载体对HSC具有极高的感染率，有报道可高达95%[13]，这是目前其它载体所不能比拟的。而且转导过程简单、快速。体内回输后在外周血循环中可检测到大约20%～30%的转染细胞阳性率。如果解决制备、野生病毒污染及整合等问题，SV40用于HSC基因治疗将是极有前途的。
4 慢病毒载体介导的HSC基因治疗 尽管目前各种常用的基因转移系统都有自己的特点，但同时又都存在一些难以克服的致命缺陷。比如RV不能有效地转染非分裂细胞；AAV制备困难；AV不发生整合，且存在严重的免疫反应以及SV40制备过程中野生病毒污染严重等问题，都在一定程度上制约了目前基因转移系统在基因治疗领域的应用。为此，人们把目光大胆地投向慢病毒，并开发出以HIV-1为代表的慢病毒载体系统。
HIV之所以受青睐，自然有它的理由。HIV可感染非分裂细胞，可介导目的基因的整合及长期稳定表达，靶向性强，无免疫反应性。尤其对于爱滋病的基因治疗，更有其独特的优势：①由于HIV载体所具有的T细胞靶向性，可介导治疗基因进入感染细胞，从而直接抑制或干扰野生型HIV的复制；②HIV载体在靶细胞内可在野生型HIV的作用下被拯救，使载体得到扩增，从而更有效的发挥治疗作用；③还可利用HIV的某些调控元件构建反式激活体，从而增强HIV载体针对感染细胞特异性的靶向性作用。在利用HIV介导HSC基因转移以治疗其它疾病方面，近年来人们也进行了不少探索。比如，将多药耐药基因(mdr1)介导骨髓细胞，以保护骨髓免受大剂量放、化疗的损伤以及将珠蛋白基因、Ⅷ因子、Ⅸ因子基因导入HSC以治疗地中海贫血、血友病A、B等[14]。
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可以想像，HIV介导HSC基因治疗最大的问题是安全性问题。早期研究中，仅仅只是通过将包装成分分别构建在两个不同的质粒上，即一个质粒表达gag和pol蛋白，另一个质粒表达env蛋白，以减少野生型病毒产生的可能性[15]。后来，有研究利用水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白及双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白替代HIV本身的包膜蛋白env，以进一步减少或消除野生病毒的产生。同时，也有利于扩大HIV载体的宿主范围。
最近Trono领导的实验室又通过在HIV载体的3′LTR去除400个核苷酸序列，制备出具有自身灭活作用的新型HIV载体[16]。进一步增加了HIV载体的安全性。与此同时，他们还通过对HIV载体LTR部分及包装系统进行改造，开发出第三代HIV载体[17]。尽管目前这些载体仍不可能用于人体研究。但随着HIV载体的不断改造，人们对HIV载体的安全性顾虑终将会慢慢地消除。如果安全性问题得到解决，毫无疑问，HIV堪称是介导HSC基因治疗是最理想的载体之一。
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5 其它探索 除上述几种主要的病毒载体均已被广泛用于HSC基因治疗研究之外，其它一些载体，比如AV载体、B19红系特异性载体、EBV/RV杂合病毒、RV/GALV假病毒、EBV复制子以及脂质体介导的非病毒载体基因转移也有用于HSC基因治疗的研究报道。
AV是目前基因治疗领域应用得最广泛的载体之一。但由于AV不能整合以及强烈的免疫反应，难以获得稳定表达。因此，很少用于HSC基因治疗研究。Watanabe等[18]曾对AV介导HSC基因转移的条件进行过探讨。结果显示，AV可介导外源基因进入HSC，并获得表达。B19是与AAV同属于细小病毒属的一种。但B19可特异地感染红系祖细胞[19]。这些特异性取决于B19本身所携带的启动子P6。EBV/RV杂合病毒应用在于利用EBV复制子及EBNA-1基因的作用，以提高RV的基因转导率。同样，RV/GALV假病毒的应用也是出于改进RV基因转导率的考虑。
总之，几乎所有可用于人类体细胞基因治疗的载体均可用于HSC基因治疗研究。同时，目前这些载体系统所存在的问题也是HSC基因治疗不得不面对的问题。最直接的解决办法就是进一步完善这些载体，或者进行新的开发。在人们最终找到一种适合于HSC基因治疗的理想载体之前，这种探索不会停止。但我们有理由相信，随着载体技术的日新月异，分子病毒学、细胞生物学以及免疫学等多学科的迅速发展，在人类开辟一条理想的HSC基因治疗新途径，并为临床所利用，已是指日可待。
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参考文献
1，Dilber MS. Gene transfer into hematopoietic cells: progress, problems and prospects. Turk J Pediatr, 1998, 40:307-336.
2，Kohn DB. Gene therapy for haematopoietic and lymphoid disorders. Clin Exp Immunol, 1997, 107 Suppl 1:54-57.
3，Bertolini F, Battaglia M, Lanza A, et al. Hematopoietic stem cells from different sources: biological and tecknical aspects. Bone Marrow Transplant, 1998, 21 Suppl 2:55-57.
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4，Nienhuis AW, Bertran J, Hargrove P, et al. Gene transfer into hematopoietic cells. Stem Cells, 1997, 15 suppl 1:123-134.
5，Kiem HP, Heyward S, Winkler A, et al. Gene transfer into marrow repopulating cells:comparision between amphotroic and gibbon ape leukemia virus pseudotyped retroviral vectors in a competitive repopulation assay in baboons. Blood, 1997, 90:4638-4645.
6，Hallek M, Girod A, Braun-Falco M, et al. Recombinant adeno-assiateal virus. Cur Res Mol Therap, 1998, 1:417-430.
, http://www.100md.com
7，Pieroni L, Fipaldini C, Monciotti A, et al. Targeted integration of adeno-associated virus-derived plasmids in transfected human cells. Virology, 1998, 249:249-259.
8，Ponnazhagan S, Mukherjee P, Wang XS, et al. Adeno-associated virus type 2-mediated transduction in primary human bone marrow-derived CD34+ hematopoietic progenitor cells: donor variation and correlation of transgene expression with cellular differentiation. J Virol, 1997, 71:8262-8267.
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9，Yang Q, Mammounas M, Yu G, et al. Development of novel cell surface CD34+ targeted recombinant adenoassociated virus vector for gene therapy. Hum Gene Ther, 1998, 9:1929-1937.
10，Summerford C, Bartlett JS, Samulski RJ, et al. Alpha V beta 5 integrin: a co-receptor for adenoassociated virus type 2 infection. Nat Med, 1999,5:78-82.
11，Paillard F. Simian virus 40 as a vector for gene transfer to hematopoietic cell. Hum Gene Ther, 1998,9:607-609.
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12，Sandalon Z, Dalyot-Herman N, Oppenheim AB, et al. In vitro assembly of SV40 virions and pseudovirions: vector development for gene therapy. Hum Gene Ther, 1997, 8:843-849.
13，Rund D, Dagan M, Dalyot-Herman N, et al. Efficient transduction of human hemapoietic cell with the human multidrug resistance gene 1 via SV40 pseudovirions. Hum Gene Ther, 1998, 9:649-657.
14，Brenner MK, Cunningham JM, Sorrention BP, et al. Gene transfer into human hemapoietic progenitor cells. Br Med Bull, 1995, 51:167-191.
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15，Naldini L, Blomer U, Gllay P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science, 1996, 272:263-267.
16，Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol, 1998, 72:9873-9880.
17，Dull T, Zefferey R, Kelly M, et al. A third-generation lentivirus vector with a condition packaging system. J Virol, 1998, 72:8463-8471.
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18，Watanabe T, Kelsey L, Ageitos A, et al. Enhancement of adenovirus-mediated gene transfer to human bone marrow cells. Leuk Lymphoma, 1998, 29:439-451.
19，Gareus R, Gigler A, Hemauer A, et al. Characterization of cis-acting and NS1 protein-responsive elements in the p6 promoter of parvovirus B19. J Virol, 1998, 72:609-616.
(收稿日期：1999-05-20), http://www.100md.com
单位：200433 上海，复旦大学遗传研究所[(现在上海市血液中心、上海输血研究所)
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中华血液学杂志000620 造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是最早、也是公认为最理想的基因治疗靶细胞之一。基因治疗临床方案近三分之一涉及到HSC[1]。主要基于以下几方面的原因：①造血干细胞是一种“永生性”细胞；②造血干细胞具有很强的增殖、分化与自我更新能力；③造血干细胞及其子代细胞直接与血液相接触，或存在于血液循环之中，极利于转染细胞的表达产物释放入血液；④HSC从采集、分离到体外培养、扩增以及自体或异体移植等已具备一套成熟的技术路线，并已为临床所普遍应用。从而为HSC基因治疗奠定了极好的细胞移植学基础。如果能将HSC基因治疗与HSC移植很好地结合起来，有望为人类疾病的治疗提供一种全新的手段和理想模式。然而，由于目前载体系统的缺陷，HSC基因治疗仍存在许多问题有待克服。这些问题的解决将取决于基因转移系统的进一步改进，新型载体系统的开发以及人们对于HSC细胞生物学本质的进一步阐明。
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1 逆转录病毒介导的HSC基因治疗 逆转录病毒载体(Retrovirus vector,RV)仍是目前用于HSC基因治疗最多的一个系统。早期研究显示，利用RV介导在小鼠HSC可获得20%～30%的基因转移率。然而，在大动物及人类试验中，RV介导HSC的基因转移率仅为1%～2%，甚到低至0.1%～1%[2]。因此，对于RV介导的HSC基因治疗而言，最大的问题便是基因转导效率低下。为何RV介导HSC的基因转移率如此之低?而且，在小鼠与人之间的差异又如此之大呢?当然，原因是复杂的。一方面因为RV只能在细胞处于分裂期，核膜破裂时才能进入核内。而对处在非分裂期，核膜完整的细胞，RV则不能有效地进入其细胞核。然而，在正常情况下，人体95%的HSC均处于非分裂状态的G0/G1期。因此，RV不能有效地进入人HSC的细胞核。而在小动物，比如小鼠，其HSC的周期状态以及其HSC表面的受体密度与人类及大动物存在的差异可能较利于RV的进入。在人类HSC体外培养体系中应用刺激因子虽可促进干细胞进入细胞周期状态，但体外扩增难以完全模拟体内环境，经过一段时间的培养，HSC便丧失了干细胞的特征，即成为祖细胞或更晚期的细胞了。那么，能否让HSC进入细胞周期，而又不分化为晚期呢?可以说，这是目前HSC研究所面临的最大的细胞生物学难题之一。目前的对策仅仅是在以下方面作一些探索，①调整培养体系。使用哪些细胞因子来进行体外处理、以怎样的比例进行组合等，目前尚未得出一致的结论。②缩短细胞体外处理时间。采用短期培养方案，以使得HSC不足以有充分的机会进行增殖、分化。③应用骨髓基质支持培养体系模拟体内环境。比如，采用HSC与间质细胞共培养，以使得HSC进入细胞周期后不是进行增殖，而是在体外进行自我更新。这也许是最理想的结果，既增加了细胞的数量，又保持了干细胞的本质特点。事实上，目前还不可能做到这一点。④探讨新的促分化抑制剂，以阻止HSC向晚期细胞的分化。比如，应用抗TGF-β抗体，以抑制TGF-β对HSC的促分化作用。另外的方法是采用骨髓替代途径的干细胞来源。比如开发脐带血干细胞和经动员的外周血干细胞[3]。据观察发现，RV介导脐血干细胞的基因转移率比骨髓干细胞高。正是因为脐血干细胞更多地处于细胞周期之中。
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另一方面，RV介导HSC基因转移是受体介导的。然而，在正常情况下人体HSC表面的RV受体分布较少[4]，不利于RV的进入。目前，人们正试图通过刺激RV受体的表达来增加HSC的基因转移率。当然，影响RV介导HSC基因转移率的因素很多。比如，RV在37?℃时的胞外半衰期很短。而病毒颗粒在培养体系中的活动能力不强。由于干细胞数量少，在转导体系中，RV与HSC相互碰撞的机率不高，也影响了基因转移率。为此，曾有研究者试图利用离心的办法来增加RV与HSC之间的接触。但离心会导致干细胞的损伤。亦有人采用转动的方式进行RV介导HSC的基因转移试验，或者在病毒液中加入纤维连接素(fibronection),使病毒颗粒更易于接触到干细胞表面。从而，提高其基因转移率。近年来，也有通过假病毒途径，比如利用长臂猿白血病病毒(GALV)的包装蛋白来包装RV，制备假病毒载体[5]，从而提高RV介导的基因转移率。
此外，由于RV曾有导致黑猩猩恶性T细胞淋巴瘤的报道，因此，不可能直接用于人体体内试验。这也是RV介导HSC基因治疗的又一大问题，即安全性问题。目前，RV介导基因治疗一般采用ex vivo途径，以便及时发现并去除可能出现的突变细胞，以确保基因治疗的安全性。然而，所有这些策略都未从根本上解决问题。因此，不少研究人员已把目光转向开发其它的基因转移系统。希望能找到一个更适合于HSC基因转移的理想体系。
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2 腺相关病毒介导的HSC基因治疗 如上所述，RV在介导HSC基因转移方面存在许多难以克服的缺陷。为此，一些研究人员把注意力转向腺相关病毒载体(Adeno-associated virus vector,AAV)，以探讨该基因转移系统介导HSC基因治疗的可能性。AAV是一种人类细小病毒，它最初是在腺病毒流行期间作为一个共感染因子被人们发现的。AAV本身没有任何显著的致病作用。到目前为止，尚未发现任何由AAV所致的人类疾病。因此，AAV被认为是一种用于人类基因治疗很有前途的安全载体。与RV相比，AAV的最大优势在于其可感染分裂或非分裂细胞，如HSC、肝细胞以及终未细胞，如肌细胞、上皮细胞等，同时，它还具有多方面的特点，比如，①无致病性；②低免疫原性；③可整合或定点整合；④宿主范围广等[6]。
目前，以AAV作载体所进行的基因治疗研究可谓是方兴未艾。美国费城儿童医院与Avigen公司合作，已申请AAV介导血友病B基因治疗临床试验。然而，作为一个基因转移系统，与RV相比AAV载体系统还显“年轻”。同样，还有许多问题有待克服。这些问题表现在：①制备困难，尤其是大量制备。经典的rAAV制备方法不仅仅需要辅助质粒提供反式蛋白，而且还需要辅助病毒，如Ad或HSV的存在，以辅助其复制，费时、费力，而且病毒粒子的产量很低，难以满足临床及大动物实验所需。目前，许多实验正试图通过杂合病毒系统，比如AAV/HSV杂合病毒的应用来解决这一问题。②定点整合特征的丧失。野生型AAV可特异地定点整合于人的19号染色体。然而，重组AAV往往丧失这一特征。这将导致因随机整合所带来的基因治疗危险性的增加。近来，人们正致力于恢复AAV定点整合的能力，以确保其安全性[7]。③靶向性问题。AAV载体的宿主范围很广，这是优点。反过来讲，这又导致了该载体靶向性方面的缺陷。目前应用得最多的AAV转导细胞是肌细胞。但有研究者观察到AAV在肌肉细胞中可能不发生整合，而是在细胞核内以一种AAV与染色质紧密结合的方式存在，其次是以肝细胞作为靶细胞所进行的探讨。然而，由于制备困难，体内应用常难以获得足够数量的转染细胞数。因此，在大动物应用后目的基因在体内的总体表达水平仍很低，难以满足临床治疗的需要。由于HSC独具魅力的增殖、分化潜能以及其成熟的体外培养与移植技术，自然会被不少研究者所看好。因此，早已有人利用AAV进行HSC基因转移的探索。遗憾的是，AAV介导HSC基因转移的效率并不十分理想，而且在不同个体之间差异很大[8]。现已证实AAV不能感染巨核细胞系。近来有研究试图通过对AAV Cap包装蛋白进行改造，即将Kit受体配基序列嵌合于Cap蛋白之中，以增加AAV与HSC的特异性结合能力[9]，但其结果同样并不令人满意。有关AAV分子病毒学的研究显示，AAV对细胞的进入也是受体介导的，而且，涉及到两步受体介导过程。即基础受体(primary receptor)，如柯萨奇腺病毒受体、HSPG受体和共受体(coreceptor)，如αV整合素、HVEM以及FGFR1受体等。有研究证实，如果细胞表面仅表达基础受体，如HSPG，而无共受体表达，则不能导致AAV的有效感染[10]。可见，AAV介导进入细胞的机制十分复杂。同时，AAV载体的包装蛋白亦很难进行改造。也许，真正的出路是另辟蹊径寻找其它新的途径，比如假病毒途径。目前，我所正在进行AAV/SV40假病毒介导HSC基因转移的研究工作。其中部分原因即在于利用SV40对HSC的高效感染性。
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3 SV40介导的HSC基因治疗 SV40是乳多空病毒属的一种，为大约5.2kb大小的双链DNA病毒。SV40对人体无害。50年代，在美国曾发生一起脊髓灰质炎疫苗被SV40病毒污染而误用于人体的事件。当时，约几百万不同年龄的人群接受这种被污染疫苗的接种。所幸的是，未发生一起因SV40病毒感染所致的疾病。临床上也未发现任何与SV40有关的病例报道。因此，也被作为一种基因治疗的载体而被人们所应用。早在80年代就有利用SV40介导骨髓细胞基因转移的研究报道，但早期SV40载体的制备过程中野生病毒污染严重，野生病毒的污染率高达90%，无法用于人体[11]，制约了SV40载体的应用。近年来Oppenheim等[12]在SV40载体制备方面做了大量的工作。他们发现SV40包装蛋白具有许多独特的包装特点，不仅可包装含有小至150?bp SV40序列的基因片段，而且还可在试管内于控制条件下，由昆虫细胞系统提供包装蛋白来包装由Ecoli制备的质粒DNA，从而制备出SV40假病毒粒子。这一体外包装技术的出现为人类充分利用病毒的特点，包装出具有非病毒意义的安全的基因治疗载体提供了可能。这一工作才刚刚开始，还有许多问题有待解决，首先必须纯化由昆虫系统提供的包装蛋白提取物，以便更准确地进行包装及调控；其次就是进一步增加包装效率，以达到大量制备的目的。
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SV40载体对HSC具有极高的感染率，有报道可高达95%[13]，这是目前其它载体所不能比拟的。而且转导过程简单、快速。体内回输后在外周血循环中可检测到大约20%～30%的转染细胞阳性率。如果解决制备、野生病毒污染及整合等问题，SV40用于HSC基因治疗将是极有前途的。
4 慢病毒载体介导的HSC基因治疗 尽管目前各种常用的基因转移系统都有自己的特点，但同时又都存在一些难以克服的致命缺陷。比如RV不能有效地转染非分裂细胞；AAV制备困难；AV不发生整合，且存在严重的免疫反应以及SV40制备过程中野生病毒污染严重等问题，都在一定程度上制约了目前基因转移系统在基因治疗领域的应用。为此，人们把目光大胆地投向慢病毒，并开发出以HIV-1为代表的慢病毒载体系统。
HIV之所以受青睐，自然有它的理由。HIV可感染非分裂细胞，可介导目的基因的整合及长期稳定表达，靶向性强，无免疫反应性。尤其对于爱滋病的基因治疗，更有其独特的优势：①由于HIV载体所具有的T细胞靶向性，可介导治疗基因进入感染细胞，从而直接抑制或干扰野生型HIV的复制；②HIV载体在靶细胞内可在野生型HIV的作用下被拯救，使载体得到扩增，从而更有效的发挥治疗作用；③还可利用HIV的某些调控元件构建反式激活体，从而增强HIV载体针对感染细胞特异性的靶向性作用。在利用HIV介导HSC基因转移以治疗其它疾病方面，近年来人们也进行了不少探索。比如，将多药耐药基因(mdr1)介导骨髓细胞，以保护骨髓免受大剂量放、化疗的损伤以及将珠蛋白基因、Ⅷ因子、Ⅸ因子基因导入HSC以治疗地中海贫血、血友病A、B等[14]。
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可以想像，HIV介导HSC基因治疗最大的问题是安全性问题。早期研究中，仅仅只是通过将包装成分分别构建在两个不同的质粒上，即一个质粒表达gag和pol蛋白，另一个质粒表达env蛋白，以减少野生型病毒产生的可能性[15]。后来，有研究利用水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白及双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白替代HIV本身的包膜蛋白env，以进一步减少或消除野生病毒的产生。同时，也有利于扩大HIV载体的宿主范围。
最近Trono领导的实验室又通过在HIV载体的3′LTR去除400个核苷酸序列，制备出具有自身灭活作用的新型HIV载体[16]。进一步增加了HIV载体的安全性。与此同时，他们还通过对HIV载体LTR部分及包装系统进行改造，开发出第三代HIV载体[17]。尽管目前这些载体仍不可能用于人体研究。但随着HIV载体的不断改造，人们对HIV载体的安全性顾虑终将会慢慢地消除。如果安全性问题得到解决，毫无疑问，HIV堪称是介导HSC基因治疗是最理想的载体之一。
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5 其它探索 除上述几种主要的病毒载体均已被广泛用于HSC基因治疗研究之外，其它一些载体，比如AV载体、B19红系特异性载体、EBV/RV杂合病毒、RV/GALV假病毒、EBV复制子以及脂质体介导的非病毒载体基因转移也有用于HSC基因治疗的研究报道。
AV是目前基因治疗领域应用得最广泛的载体之一。但由于AV不能整合以及强烈的免疫反应，难以获得稳定表达。因此，很少用于HSC基因治疗研究。Watanabe等[18]曾对AV介导HSC基因转移的条件进行过探讨。结果显示，AV可介导外源基因进入HSC，并获得表达。B19是与AAV同属于细小病毒属的一种。但B19可特异地感染红系祖细胞[19]。这些特异性取决于B19本身所携带的启动子P6。EBV/RV杂合病毒应用在于利用EBV复制子及EBNA-1基因的作用，以提高RV的基因转导率。同样，RV/GALV假病毒的应用也是出于改进RV基因转导率的考虑。
总之，几乎所有可用于人类体细胞基因治疗的载体均可用于HSC基因治疗研究。同时，目前这些载体系统所存在的问题也是HSC基因治疗不得不面对的问题。最直接的解决办法就是进一步完善这些载体，或者进行新的开发。在人们最终找到一种适合于HSC基因治疗的理想载体之前，这种探索不会停止。但我们有理由相信，随着载体技术的日新月异，分子病毒学、细胞生物学以及免疫学等多学科的迅速发展，在人类开辟一条理想的HSC基因治疗新途径，并为临床所利用，已是指日可待。
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参考文献
1，Dilber MS. Gene transfer into hematopoietic cells: progress, problems and prospects. Turk J Pediatr, 1998, 40:307-336.
2，Kohn DB. Gene therapy for haematopoietic and lymphoid disorders. Clin Exp Immunol, 1997, 107 Suppl 1:54-57.
3，Bertolini F, Battaglia M, Lanza A, et al. Hematopoietic stem cells from different sources: biological and tecknical aspects. Bone Marrow Transplant, 1998, 21 Suppl 2:55-57.
, 百拇医药
4，Nienhuis AW, Bertran J, Hargrove P, et al. Gene transfer into hematopoietic cells. Stem Cells, 1997, 15 suppl 1:123-134.
5，Kiem HP, Heyward S, Winkler A, et al. Gene transfer into marrow repopulating cells:comparision between amphotroic and gibbon ape leukemia virus pseudotyped retroviral vectors in a competitive repopulation assay in baboons. Blood, 1997, 90:4638-4645.
6，Hallek M, Girod A, Braun-Falco M, et al. Recombinant adeno-assiateal virus. Cur Res Mol Therap, 1998, 1:417-430.
, http://www.100md.com
7，Pieroni L, Fipaldini C, Monciotti A, et al. Targeted integration of adeno-associated virus-derived plasmids in transfected human cells. Virology, 1998, 249:249-259.
8，Ponnazhagan S, Mukherjee P, Wang XS, et al. Adeno-associated virus type 2-mediated transduction in primary human bone marrow-derived CD34+ hematopoietic progenitor cells: donor variation and correlation of transgene expression with cellular differentiation. J Virol, 1997, 71:8262-8267.
, http://www.100md.com
9，Yang Q, Mammounas M, Yu G, et al. Development of novel cell surface CD34+ targeted recombinant adenoassociated virus vector for gene therapy. Hum Gene Ther, 1998, 9:1929-1937.
10，Summerford C, Bartlett JS, Samulski RJ, et al. Alpha V beta 5 integrin: a co-receptor for adenoassociated virus type 2 infection. Nat Med, 1999,5:78-82.
11，Paillard F. Simian virus 40 as a vector for gene transfer to hematopoietic cell. Hum Gene Ther, 1998,9:607-609.
, 百拇医药
12，Sandalon Z, Dalyot-Herman N, Oppenheim AB, et al. In vitro assembly of SV40 virions and pseudovirions: vector development for gene therapy. Hum Gene Ther, 1997, 8:843-849.
13，Rund D, Dagan M, Dalyot-Herman N, et al. Efficient transduction of human hemapoietic cell with the human multidrug resistance gene 1 via SV40 pseudovirions. Hum Gene Ther, 1998, 9:649-657.
14，Brenner MK, Cunningham JM, Sorrention BP, et al. Gene transfer into human hemapoietic progenitor cells. Br Med Bull, 1995, 51:167-191.
, 百拇医药
15，Naldini L, Blomer U, Gllay P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science, 1996, 272:263-267.
16，Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol, 1998, 72:9873-9880.
17，Dull T, Zefferey R, Kelly M, et al. A third-generation lentivirus vector with a condition packaging system. J Virol, 1998, 72:8463-8471.
, http://www.100md.com
18，Watanabe T, Kelsey L, Ageitos A, et al. Enhancement of adenovirus-mediated gene transfer to human bone marrow cells. Leuk Lymphoma, 1998, 29:439-451.
19，Gareus R, Gigler A, Hemauer A, et al. Characterization of cis-acting and NS1 protein-responsive elements in the p6 promoter of parvovirus B19. J Virol, 1998, 72:609-616.
(收稿日期：1999-05-20), http://www.100md.com