含血小板生成素基因的重组腺病毒Ad/Tpo的构建及表达
作者：魏旭东 伏爽 武莎莎 王申五 王德炳
单位：100044 北京医科大学人民医院血液病研究所
关键词：
中华血液学杂志000617 基因治疗常用的病毒载体是腺病毒和逆转录病毒，腺病毒以其特有的优点，在临床和实验室基因治疗研究中得以广泛的应用。我们通过血小板生成素(Tpo)重组腺病毒穿梭质粒的构建，并大量提取腺病毒基因组DNA pBHG11，将其二者共转染293细胞，从而包装含Tpo cDNA并能表达Tpo的重组腺病毒。
材料和方法
1 材料 腺病毒载体pCMVsp1A质粒为6.4kb ,含氨苄青霉素抗性基因，腺病毒基因组质粒pBHG11，34kb(Microbix公司产品);pcDNA3真核表达质粒5.4bp,含氨苄青霉素抗性基因(Invitrogen公司产品)；含目的基因Tpo的VR1012/Tpo为5.9kb,含卡那霉素抗性基因(由北京医科大学人民医院血液病研究所韩安平博士构建并赠送)； 限制性内切酶，T4DNA连接酶分别购于华美公司和Promega公司；大肠杆菌DH5α菌株为本室所存。293细胞为北京医科大学生化与分子生物学系张小伟博士赠送；转染试剂脂质体DOTAP购于德国宝灵曼公司，Tpo检测试剂盒购于美国R&D公司。
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2 穿梭质粒pCMVspA1/Tpo的构建 将Tpo目的片段从VR/Tpo上切下，转入pcDNA3质粒中，构建出pcDNA3/Tpo再将Tpo cDNA的整个表达盒切下，转入pCMVsp1A质粒中,从而构建成所需的pCMVspA1/Tpo质粒，见图1。
图1 载体构建策略示意图
用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ，从质粒VR/Tpo中切下目的基因Tpo cDNA，经8g/L琼脂糖凝胶电泳，用冻融法回收Tpo cDNA片段，将pcDNA3质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切线性化，同上法回收线性化载体。用此载体和Tpo cDNA片段混合，用T4DNA连接酶连接反应，构建亚克隆pcDNA3/Tpo。应用BglⅡ和StuⅠ从中间载体克隆中切下含完整CMV和Tpo cDNA以及加尾信号的表达盒，8g/L琼脂糖凝胶电泳，电压40V,10h，回收含此表达盒的片段，将此片段与用BglⅢ和EcoRⅤ酶切后回收的pCMVsp1A线性化空载体，进行连接反应，构建成pCMVspA1/Tpo。具体方法见文献[1]。用醋酸胺法提取质粒[2]，分别用BamHⅠ和HindIⅢ酶切鉴定。
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3 Ad/Tpo的包装 取pCMVspA1/Tpo 1μg, pBHG11 1μg, 加入DOTAP 9μl,混匀，加入2ml DMEM完全培养基，将此混合物加到前一天传代达50%融合的293细胞中。置CO2培养箱，转染10h，吸弃原培养物，换DMEM完全培养基，持续培养，直至出现细胞病性(CPE)改变，收获病毒。
4 聚合酶链反应(PCR)鉴定Ad/Tpo 应用Trizol法提取病毒DNA后行PCR。引物设计与合成借助NBI之Oligo引物分析软件包，version 5.0 for window 设计，委托Cybersyn公司合成，其互补DNA序列在Tpo cDNA中结合位置在161～657bp之间。Tpo上游引物：5′-AACCCCTTTGCCCTACACCTGTC-3′，下游引物5′-CAGAAACCCAGAGCCCAGTA-3′。25μl体系包括Taq酶0.3μl，引物2pmol, 质粒50ng，dNTP 2μl ，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环。
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5 病毒上清Tpo定量检测 用双抗体夹心法，应用R&D公司试剂盒，按试剂盒说明书操作，测定波长450nm叭光度(A)值。
结果
1 pBHG11和pCMVspA1/Tpo的酶切鉴定 pBHG11经HindⅢ酶切后，形成9条片段，分别为8.0, 5.3，4.6，3.8，3.4,3.0,2.0,1.5kb，见图2。重组子pCMVspA1/Tpo经BamHⅠ酶切鉴定，可见7.3，1.0，0.6，0.4kb片段，与预期结果相符。
图2 BHG11限制性内切酶分析
2 CPE改变的形成 转染293细胞7d后，细胞出现腺病毒感染早期病变特征，数个细胞变圆，但不脱落。14d后，出现细胞变圆、脱落，形成感染噬斑样改变，随后细胞成片脱落，即CPE改变。
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3 Ad/Tpo PCR鉴定结果 重组腺病毒DNA经PCR扩增可见扩增出约500bp的阳性条带，见图3。
图3 PCR检测病毒DNA
4 定量检测瞬时表达的Tpo 检测结果发现，空载体腺病毒表达Tpo量为0，Ad/Tpo表达量为(3000±218)pg/ml。
讨论
目前，以腺病毒为载体进行基因治疗的报道越来越多。腺病毒有安全性高，感染细胞范围广，给入方便等，应用日趋广泛。不仅实验室研究进展很大，而且在临床上开始应用。例如载有p53基因的重组腺病毒用于治疗恶性肿瘤，取得较好疗效。应用腺病毒载体进行基因治疗的原理为，构建带有目的基因的腺病毒，通过293细胞包装，产生重组腺病毒，将此病毒感染靶细胞或机体，从而表达目的基因的产物，从而达到治疗的目的。
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恶性肿瘤放、化疗可引起血小板减少，但治疗有效的方法只有输血小板，由于血小板来源有限，多次输入会产生抗体。人们寄希望于Tpo的基因治疗。Yan等[3]用逆转录病毒载体转导Tpo基因，虽然使小鼠血小板增加，但引起骨髓纤维化、骨硬化。腺病毒载体则可克服上述缺点。我们拟用腺病毒载体进行Tpo基因治疗，本研究为腺病毒载体进行Tpo基因治疗打下基础。
基金项目：国家“九五”科技攻关项目(96-906-01-19)
参考文献
1，J 萨姆布鲁克，主编.分子克隆实验指南.金东雁， 黎孟枫译.第2版.北京：科学出版社，1998.17.
2，Lee S, Rasheed S.A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA.Bio Technique，1990,6:676-678.
3，Yan XQ, Lacey D,Fletcher F，et al.Chronic expasure to retroviral vector encoded MGDF (mpl-ligand) induces lineage-specific growth and differentiation of megakaryocytes in mice.Blood，1995,86：4025-4033.
(收稿：1999-12-15), 百拇医药
单位：100044 北京医科大学人民医院血液病研究所
关键词：
中华血液学杂志000617 基因治疗常用的病毒载体是腺病毒和逆转录病毒，腺病毒以其特有的优点，在临床和实验室基因治疗研究中得以广泛的应用。我们通过血小板生成素(Tpo)重组腺病毒穿梭质粒的构建，并大量提取腺病毒基因组DNA pBHG11，将其二者共转染293细胞，从而包装含Tpo cDNA并能表达Tpo的重组腺病毒。
材料和方法
1 材料 腺病毒载体pCMVsp1A质粒为6.4kb ,含氨苄青霉素抗性基因，腺病毒基因组质粒pBHG11，34kb(Microbix公司产品);pcDNA3真核表达质粒5.4bp,含氨苄青霉素抗性基因(Invitrogen公司产品)；含目的基因Tpo的VR1012/Tpo为5.9kb,含卡那霉素抗性基因(由北京医科大学人民医院血液病研究所韩安平博士构建并赠送)； 限制性内切酶，T4DNA连接酶分别购于华美公司和Promega公司；大肠杆菌DH5α菌株为本室所存。293细胞为北京医科大学生化与分子生物学系张小伟博士赠送；转染试剂脂质体DOTAP购于德国宝灵曼公司，Tpo检测试剂盒购于美国R&D公司。
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2 穿梭质粒pCMVspA1/Tpo的构建 将Tpo目的片段从VR/Tpo上切下，转入pcDNA3质粒中，构建出pcDNA3/Tpo再将Tpo cDNA的整个表达盒切下，转入pCMVsp1A质粒中,从而构建成所需的pCMVspA1/Tpo质粒，见图1。
图1 载体构建策略示意图
用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ，从质粒VR/Tpo中切下目的基因Tpo cDNA，经8g/L琼脂糖凝胶电泳，用冻融法回收Tpo cDNA片段，将pcDNA3质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切线性化，同上法回收线性化载体。用此载体和Tpo cDNA片段混合，用T4DNA连接酶连接反应，构建亚克隆pcDNA3/Tpo。应用BglⅡ和StuⅠ从中间载体克隆中切下含完整CMV和Tpo cDNA以及加尾信号的表达盒，8g/L琼脂糖凝胶电泳，电压40V,10h，回收含此表达盒的片段，将此片段与用BglⅢ和EcoRⅤ酶切后回收的pCMVsp1A线性化空载体，进行连接反应，构建成pCMVspA1/Tpo。具体方法见文献[1]。用醋酸胺法提取质粒[2]，分别用BamHⅠ和HindIⅢ酶切鉴定。
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3 Ad/Tpo的包装 取pCMVspA1/Tpo 1μg, pBHG11 1μg, 加入DOTAP 9μl,混匀，加入2ml DMEM完全培养基，将此混合物加到前一天传代达50%融合的293细胞中。置CO2培养箱，转染10h，吸弃原培养物，换DMEM完全培养基，持续培养，直至出现细胞病性(CPE)改变，收获病毒。
4 聚合酶链反应(PCR)鉴定Ad/Tpo 应用Trizol法提取病毒DNA后行PCR。引物设计与合成借助NBI之Oligo引物分析软件包，version 5.0 for window 设计，委托Cybersyn公司合成，其互补DNA序列在Tpo cDNA中结合位置在161～657bp之间。Tpo上游引物：5′-AACCCCTTTGCCCTACACCTGTC-3′，下游引物5′-CAGAAACCCAGAGCCCAGTA-3′。25μl体系包括Taq酶0.3μl，引物2pmol, 质粒50ng，dNTP 2μl ，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环。
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5 病毒上清Tpo定量检测 用双抗体夹心法，应用R&D公司试剂盒，按试剂盒说明书操作，测定波长450nm叭光度(A)值。
结果
1 pBHG11和pCMVspA1/Tpo的酶切鉴定 pBHG11经HindⅢ酶切后，形成9条片段，分别为8.0, 5.3，4.6，3.8，3.4,3.0,2.0,1.5kb，见图2。重组子pCMVspA1/Tpo经BamHⅠ酶切鉴定，可见7.3，1.0，0.6，0.4kb片段，与预期结果相符。
图2 BHG11限制性内切酶分析
2 CPE改变的形成 转染293细胞7d后，细胞出现腺病毒感染早期病变特征，数个细胞变圆，但不脱落。14d后，出现细胞变圆、脱落，形成感染噬斑样改变，随后细胞成片脱落，即CPE改变。
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3 Ad/Tpo PCR鉴定结果 重组腺病毒DNA经PCR扩增可见扩增出约500bp的阳性条带，见图3。
图3 PCR检测病毒DNA
4 定量检测瞬时表达的Tpo 检测结果发现，空载体腺病毒表达Tpo量为0，Ad/Tpo表达量为(3000±218)pg/ml。
讨论
目前，以腺病毒为载体进行基因治疗的报道越来越多。腺病毒有安全性高，感染细胞范围广，给入方便等，应用日趋广泛。不仅实验室研究进展很大，而且在临床上开始应用。例如载有p53基因的重组腺病毒用于治疗恶性肿瘤，取得较好疗效。应用腺病毒载体进行基因治疗的原理为，构建带有目的基因的腺病毒，通过293细胞包装，产生重组腺病毒，将此病毒感染靶细胞或机体，从而表达目的基因的产物，从而达到治疗的目的。
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恶性肿瘤放、化疗可引起血小板减少，但治疗有效的方法只有输血小板，由于血小板来源有限，多次输入会产生抗体。人们寄希望于Tpo的基因治疗。Yan等[3]用逆转录病毒载体转导Tpo基因，虽然使小鼠血小板增加，但引起骨髓纤维化、骨硬化。腺病毒载体则可克服上述缺点。我们拟用腺病毒载体进行Tpo基因治疗，本研究为腺病毒载体进行Tpo基因治疗打下基础。
基金项目：国家“九五”科技攻关项目(96-906-01-19)
参考文献
1，J 萨姆布鲁克，主编.分子克隆实验指南.金东雁， 黎孟枫译.第2版.北京：科学出版社，1998.17.
2，Lee S, Rasheed S.A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA.Bio Technique，1990,6:676-678.
3，Yan XQ, Lacey D,Fletcher F，et al.Chronic expasure to retroviral vector encoded MGDF (mpl-ligand) induces lineage-specific growth and differentiation of megakaryocytes in mice.Blood，1995,86：4025-4033.
(收稿：1999-12-15), 百拇医药