P物质对白血病细胞系HL-60及L615细胞生长的抑制作用
作者：杨琳 康芙蓉 法祥光 卢士红
单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所
关键词：
中华血液学杂志000615 近年已发现多种神经肽参与正常和异常细胞的增殖调节，神经多肽P物质(SP)即是其中一种，它主要分布在人的神经系统，已发现SP对小细胞肺癌、类癌瘤有促生长作用[1]。但SP对肿瘤生长的影响研究尚属起始阶段，其对肿瘤细胞生长是否有直接影响，作用方式和特点又是如何则所知甚少。为此，我们以人粒细胞白血病HL-60细胞和小鼠T淋巴细胞白血病L615细胞为模型，探讨了SP对其生长的影响及其调节机制。
材料和方法
1 细胞系、实验动物及有关试剂 HL-60细胞、L615细胞由本所实验病理研究室提供，BALB/c裸鼠购自中国医学科学院肿瘤医院，615近交系小鼠购自中国医学科学院动物中心，SP购自杭州商学院，百日咳毒素(PT)、PKC检测试剂盒均为美国Gibco/BRL公司产品，γ-32P-ATP为北京辉瑞生物制品公司产品。
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2 分组 接种细胞处于对数生长期，浓度为1×105/ml，分别设对照组(不加SP)和试验组(加SP)，在体积分数为5%的CO2孵箱中共温育48h后离心，1000r/min，10min，收集细胞，进行以下试验。
3 活细胞计数和MTT试验 试验组设10-7，10-6和10-5mol/L SP组，分别进行活细胞计数和MTT试验。
4 电镜观察和流式细胞仪检测 细胞总数不少于107，按常规进行电镜观察，用流式细胞仪计数10000个细胞，检测细胞凋亡情况。
5 G蛋白相关试验及PKC活性测定 150ng/ml PT先与细胞在37℃共温育1h，用MTT法检测细胞与SP共温育时PT对细胞生长的抑制作用，进而判别SP对G蛋白的影响。PKC活性测定按试剂盒说明书进行。
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6 致瘤性试验 ①裸鼠试验：收集HL-60和L615细胞，分别制成0.6ml细胞悬液，各接种3只裸鼠(5周龄左右，接种前经400cGy射线预处理)，接种细胞数为1.8×107/只，皮下注射。②615小鼠试验：收集HL-60和L615细胞，分别制成1ml细胞悬液，各接种5只615小鼠(20g左右)，接种细胞数为1.2×107/只，皮下注射。
7 统计学处理 实验数据采用t检验处理。
结果
1 SP对HL-60、L615细胞生长的影响
1.1 活细胞计数：分别观察不同浓度SP对两株细胞生长的影响，设对照组为100%，活细胞数以相对百分率表示，结果10-7mol/L和10-5mol/L SP处理的HL-60细胞生长抑制率分别为85.4%和81.9%与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)；10-7mol/L和10-5mol/L SP处理48h的L615细胞生长抑制率分别为87.2%和77.0%，与对照组比较，P均<0.05。表明10-7～10-5mol/L剂量范围的SP作用48h后对两株细胞均有抑制作用，且高浓度SP比低浓度SP的抑制作用更明显。
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1.2 MTT试验：测定两株细胞经不同浓度SP作用不同时间后的吸光度(A)设对照组细胞活力为100%，结果见图1，2。
结果表明，各种浓度的SP在不同时间内对两株细胞的生长均有抑制作用，且与计数法结果相符。虽然48h的抑制作用稍低于36或72h的作用，但由于36h细胞未进入对数生长期而72h又使实验周期过长，故设定SP浓度为10-5mol/L、作用48h为其它研究的实验条件。
2 SP对HL-60和L615细胞形态的影响 电镜观察显示，对照组和实验HL-60细胞形态上无明显区别，细胞核也无明显变化，表明SP对HL-60细胞的抑制生长作用不是通过凋亡方式；L615细胞经SP作用后大多数细胞的染色质完全消失或边集，且随SP浓度增加，核的这种变化加重，但胞浆中的细胞器完好，且无凋亡小体出现，提示可能是凋亡早期。
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图1 不同浓度SP对HL-60作用不同时间的MTT结果
图2 不同浓度SP对L615细胞作用不同时间的MTT结果
3 流式细胞仪检测结果 用流式细胞术检则经SP作用后的两株细胞核DNA的亚二倍体含量。结果显示经SP分别作用9，12，24和48h后，HL-60细胞的凋亡百分率差异无显著性。而9h(低限)和48h(高限)L615细胞凋亡百分率均明显增加，9h后实验组凋亡率为(31.06±17.72)%，比对照组的(19.45±9.71)%上升了57.60%(n=7,P<0.05);48h后实验组细胞凋亡率为(15.43±5.47)%，比对照组的(10.05±5.12)%上升了62.49%(n=7,P<0.05)。提示SP抑制HL-60细胞生长不是通过增加细胞凋亡实现的，而对L615的抑制是通过凋亡实现的，与电镜结果非常一致，表明SP抑制两株细胞生长的作用方式不同。
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4 SP与异三聚体G蛋白的相关性 PT特异性阻遏G蛋白功能，判别SP的抑制作用是否由G蛋白介导。150ng/ml的PT可以显著地抑制HL-60、L615细胞生长，抑制率分别是(16.48±4.58)%(n=6,P<0.05)和(13.96±4.81)%(n=5，P<0.05)。当PT和SP共同作用于细胞时，PT对HL-60、L615的抑制作用均被拮抗，抑制率分别下降为(2.92±0.20)%(n=6,P>0.05)和(7.42±5.01)%(n=5，P<0.05)。显示SP可拮抗PT对G蛋白的抑制作用，也表明SP对G蛋白有激活作用。
PKC活性检测结果表明，与对照组相比SP可使HL-60和L615细胞的PKC活性增强，分别为(18.94±4.19)%(n=5,P<0.01)和(16.40±9.73%)%(n=4,P<0.05)。
5 致瘤性试验
5.1 裸鼠试验：HL-60细胞为人粒细胞白血病细胞系，因裸鼠缺乏T细胞，故接种HL-60细胞后无排斥反应，会在接种局部生成瘤块。经SP处理后的HL-60细胞致瘤性降低：实验组比对照组肿瘤潜伏期延长4d，且瘤块增长较慢，接种第10天对照组与实验组瘤块平均分别为111.35mm3、0mm3；第13天两组分别为335.78mm3、143.24mm3。
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5.2 L615近交系小鼠试验：经SP处理后的L615细胞致瘤性降低，对照组动物在接种后8d内死亡3只，而实验组动物在21d内全部存活下来，生存时间明显延长。
讨论
实验结果表明，SP在10-7～10-5mol/L浓度范围内对两株肿瘤细胞的生长均有抑制作用，且抑制率稳定的低值(约10%)水平，电镜观察和流式细胞术检测表明SP对HL-60细胞的生长抑制作用并非是通过诱导凋亡途径。而SP对L615细胞的抑制作用则可能是凋亡所致。结果表明SP对两株细胞的抑制作用是一种非杀伤性的调节作用。
我们以G蛋白特异性抑制剂PT作参照物，观察SP对G蛋白的影响。发现SP对PT的抑G蛋白作用有明显拮抗性，表明SP可能是激活了G蛋白活性而呈现对PT的拮抗，这点从SP可增高PKC活性而进一步得到证实。因此，SP对两株细胞生长的抑制作用可能是其与相应受体结合后进一步激活G蛋白而始动的，而G蛋白的激活是进一步激活PLC-PKC、MAPK等重要信息途径的超始环节。PKC是调节细胞生长、发育、凋亡及多种细胞行为的重要分子，它对细胞生长的调节具有双向性[2，3]，其正负调控倾向由多种因素和细胞所处的特定环境所决定。实验中与SP共育的两株细胞的PKC活性均明显升高，表明SP对两株细胞生长的抑制作用与PKC活性增高有关。
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在体内实验中，根据致瘤性试验的结果可知经SP作用后的两株瘤细胞对动物的致瘤能力均明显降低，也表明SP对两株瘤细胞生长有抑制作用。SP可延长615小鼠的生存时间，在HL-60细胞致瘤性试验中则出现裸鼠肿瘤潜伏期延长数天后，肿瘤突然加速生长。这进一步验证了SP对两株细胞的抑制生长作用机制是不同的，对HL-60细胞的抑制作用可能是一种未达到凋亡的可逆过程，只要SP存在就表现为抑制生长，一旦SP解除或作用消失，瘤细胞则象脱离了“禁锢”似的生长起来。
志谢：本工作得到褚建新、应红光及赵钧铭等同志的诸多帮助，特此致谢
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470273)
参考文献
1，Sethi T, Longdon S, Smyth J. Growth of small cell lung cancer cells: stimulation by multiple neuropeptides and inhibition by broad spectrum antagonists in vitro and in vivo. Cancer Res, 1992, Supll 52:2737-2742.
, 百拇医药
2，Ojedas F, Guarda MI, Maldonato C. Protein kinase C involvement in thymocyte apoptosis induced by hydrocortisone. Cell Immunol, 1990, 125:535-539.
3，David-Jarvis W, Turner AJ, Povirk LF. Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death in HL-60 human premyelocytic leukemia cells by pharmacological inhibitor of protein kinase C. Cancer Res, 1994, 54:1707-1714.
(收稿日期：1999-05-18), 百拇医药
单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所
关键词：
中华血液学杂志000615 近年已发现多种神经肽参与正常和异常细胞的增殖调节，神经多肽P物质(SP)即是其中一种，它主要分布在人的神经系统，已发现SP对小细胞肺癌、类癌瘤有促生长作用[1]。但SP对肿瘤生长的影响研究尚属起始阶段，其对肿瘤细胞生长是否有直接影响，作用方式和特点又是如何则所知甚少。为此，我们以人粒细胞白血病HL-60细胞和小鼠T淋巴细胞白血病L615细胞为模型，探讨了SP对其生长的影响及其调节机制。
材料和方法
1 细胞系、实验动物及有关试剂 HL-60细胞、L615细胞由本所实验病理研究室提供，BALB/c裸鼠购自中国医学科学院肿瘤医院，615近交系小鼠购自中国医学科学院动物中心，SP购自杭州商学院，百日咳毒素(PT)、PKC检测试剂盒均为美国Gibco/BRL公司产品，γ-32P-ATP为北京辉瑞生物制品公司产品。
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2 分组 接种细胞处于对数生长期，浓度为1×105/ml，分别设对照组(不加SP)和试验组(加SP)，在体积分数为5%的CO2孵箱中共温育48h后离心，1000r/min，10min，收集细胞，进行以下试验。
3 活细胞计数和MTT试验 试验组设10-7，10-6和10-5mol/L SP组，分别进行活细胞计数和MTT试验。
4 电镜观察和流式细胞仪检测 细胞总数不少于107，按常规进行电镜观察，用流式细胞仪计数10000个细胞，检测细胞凋亡情况。
5 G蛋白相关试验及PKC活性测定 150ng/ml PT先与细胞在37℃共温育1h，用MTT法检测细胞与SP共温育时PT对细胞生长的抑制作用，进而判别SP对G蛋白的影响。PKC活性测定按试剂盒说明书进行。
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6 致瘤性试验 ①裸鼠试验：收集HL-60和L615细胞，分别制成0.6ml细胞悬液，各接种3只裸鼠(5周龄左右，接种前经400cGy射线预处理)，接种细胞数为1.8×107/只，皮下注射。②615小鼠试验：收集HL-60和L615细胞，分别制成1ml细胞悬液，各接种5只615小鼠(20g左右)，接种细胞数为1.2×107/只，皮下注射。
7 统计学处理 实验数据采用t检验处理。
结果
1 SP对HL-60、L615细胞生长的影响
1.1 活细胞计数：分别观察不同浓度SP对两株细胞生长的影响，设对照组为100%，活细胞数以相对百分率表示，结果10-7mol/L和10-5mol/L SP处理的HL-60细胞生长抑制率分别为85.4%和81.9%与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)；10-7mol/L和10-5mol/L SP处理48h的L615细胞生长抑制率分别为87.2%和77.0%，与对照组比较，P均<0.05。表明10-7～10-5mol/L剂量范围的SP作用48h后对两株细胞均有抑制作用，且高浓度SP比低浓度SP的抑制作用更明显。
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1.2 MTT试验：测定两株细胞经不同浓度SP作用不同时间后的吸光度(A)设对照组细胞活力为100%，结果见图1，2。
结果表明，各种浓度的SP在不同时间内对两株细胞的生长均有抑制作用，且与计数法结果相符。虽然48h的抑制作用稍低于36或72h的作用，但由于36h细胞未进入对数生长期而72h又使实验周期过长，故设定SP浓度为10-5mol/L、作用48h为其它研究的实验条件。
2 SP对HL-60和L615细胞形态的影响 电镜观察显示，对照组和实验HL-60细胞形态上无明显区别，细胞核也无明显变化，表明SP对HL-60细胞的抑制生长作用不是通过凋亡方式；L615细胞经SP作用后大多数细胞的染色质完全消失或边集，且随SP浓度增加，核的这种变化加重，但胞浆中的细胞器完好，且无凋亡小体出现，提示可能是凋亡早期。
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图1 不同浓度SP对HL-60作用不同时间的MTT结果
图2 不同浓度SP对L615细胞作用不同时间的MTT结果
3 流式细胞仪检测结果 用流式细胞术检则经SP作用后的两株细胞核DNA的亚二倍体含量。结果显示经SP分别作用9，12，24和48h后，HL-60细胞的凋亡百分率差异无显著性。而9h(低限)和48h(高限)L615细胞凋亡百分率均明显增加，9h后实验组凋亡率为(31.06±17.72)%，比对照组的(19.45±9.71)%上升了57.60%(n=7,P<0.05);48h后实验组细胞凋亡率为(15.43±5.47)%，比对照组的(10.05±5.12)%上升了62.49%(n=7,P<0.05)。提示SP抑制HL-60细胞生长不是通过增加细胞凋亡实现的，而对L615的抑制是通过凋亡实现的，与电镜结果非常一致，表明SP抑制两株细胞生长的作用方式不同。
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4 SP与异三聚体G蛋白的相关性 PT特异性阻遏G蛋白功能，判别SP的抑制作用是否由G蛋白介导。150ng/ml的PT可以显著地抑制HL-60、L615细胞生长，抑制率分别是(16.48±4.58)%(n=6,P<0.05)和(13.96±4.81)%(n=5，P<0.05)。当PT和SP共同作用于细胞时，PT对HL-60、L615的抑制作用均被拮抗，抑制率分别下降为(2.92±0.20)%(n=6,P>0.05)和(7.42±5.01)%(n=5，P<0.05)。显示SP可拮抗PT对G蛋白的抑制作用，也表明SP对G蛋白有激活作用。
PKC活性检测结果表明，与对照组相比SP可使HL-60和L615细胞的PKC活性增强，分别为(18.94±4.19)%(n=5,P<0.01)和(16.40±9.73%)%(n=4,P<0.05)。
5 致瘤性试验
5.1 裸鼠试验：HL-60细胞为人粒细胞白血病细胞系，因裸鼠缺乏T细胞，故接种HL-60细胞后无排斥反应，会在接种局部生成瘤块。经SP处理后的HL-60细胞致瘤性降低：实验组比对照组肿瘤潜伏期延长4d，且瘤块增长较慢，接种第10天对照组与实验组瘤块平均分别为111.35mm3、0mm3；第13天两组分别为335.78mm3、143.24mm3。
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5.2 L615近交系小鼠试验：经SP处理后的L615细胞致瘤性降低，对照组动物在接种后8d内死亡3只，而实验组动物在21d内全部存活下来，生存时间明显延长。
讨论
实验结果表明，SP在10-7～10-5mol/L浓度范围内对两株肿瘤细胞的生长均有抑制作用，且抑制率稳定的低值(约10%)水平，电镜观察和流式细胞术检测表明SP对HL-60细胞的生长抑制作用并非是通过诱导凋亡途径。而SP对L615细胞的抑制作用则可能是凋亡所致。结果表明SP对两株细胞的抑制作用是一种非杀伤性的调节作用。
我们以G蛋白特异性抑制剂PT作参照物，观察SP对G蛋白的影响。发现SP对PT的抑G蛋白作用有明显拮抗性，表明SP可能是激活了G蛋白活性而呈现对PT的拮抗，这点从SP可增高PKC活性而进一步得到证实。因此，SP对两株细胞生长的抑制作用可能是其与相应受体结合后进一步激活G蛋白而始动的，而G蛋白的激活是进一步激活PLC-PKC、MAPK等重要信息途径的超始环节。PKC是调节细胞生长、发育、凋亡及多种细胞行为的重要分子，它对细胞生长的调节具有双向性[2，3]，其正负调控倾向由多种因素和细胞所处的特定环境所决定。实验中与SP共育的两株细胞的PKC活性均明显升高，表明SP对两株细胞生长的抑制作用与PKC活性增高有关。
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在体内实验中，根据致瘤性试验的结果可知经SP作用后的两株瘤细胞对动物的致瘤能力均明显降低，也表明SP对两株瘤细胞生长有抑制作用。SP可延长615小鼠的生存时间，在HL-60细胞致瘤性试验中则出现裸鼠肿瘤潜伏期延长数天后，肿瘤突然加速生长。这进一步验证了SP对两株细胞的抑制生长作用机制是不同的，对HL-60细胞的抑制作用可能是一种未达到凋亡的可逆过程，只要SP存在就表现为抑制生长，一旦SP解除或作用消失，瘤细胞则象脱离了“禁锢”似的生长起来。
志谢：本工作得到褚建新、应红光及赵钧铭等同志的诸多帮助，特此致谢
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470273)
参考文献
1，Sethi T, Longdon S, Smyth J. Growth of small cell lung cancer cells: stimulation by multiple neuropeptides and inhibition by broad spectrum antagonists in vitro and in vivo. Cancer Res, 1992, Supll 52:2737-2742.
, 百拇医药
2，Ojedas F, Guarda MI, Maldonato C. Protein kinase C involvement in thymocyte apoptosis induced by hydrocortisone. Cell Immunol, 1990, 125:535-539.
3，David-Jarvis W, Turner AJ, Povirk LF. Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death in HL-60 human premyelocytic leukemia cells by pharmacological inhibitor of protein kinase C. Cancer Res, 1994, 54:1707-1714.
(收稿日期：1999-05-18), 百拇医药