人脐血和骨髓CD34+细胞基因转移效率的比较研究
作者：王存邦 达万明 魏亚明 欧英贤 欧剑锋 白海 张茜
单位：730050 兰州军区总医院、兰州军区血液病研究所
关键词：
中华血液学杂志000614 人脐血和骨髓CD34+细胞在相同实验条件下,基因转移效率是否相同尚未见报道。我们研究比较了干细胞因子(SCF),白细胞介素(IL)-3,IL-6等联合应用对人脐血和骨髓CD34+细胞基因转移效率的差别，为基因治疗的临床应用提供实验依据。
材料和方法
1 细胞系 G418抗性包装细胞株PA317-GCGPXSN及检测病毒滴度用细胞株NIH3T3，均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠。
, 百拇医药
2 病毒上清的制备及病毒滴度测定 按文献[1]进行。
3 基因转移 脐血9份,来自兰州市妇幼保健院健康产妇;骨髓9份,来自健康供者。将脐血和骨髓用Ficoll液(相对密度1.077)密度梯度离心并制备成2×106/ml的细胞悬液，分组情况见表1，分别加重组人(rh)IL-3,rhIL-6(终浓度均为200U/ml,Kirin公司)及rhSCF(终浓度为100ng/ml，由军事医学科学院沈培奋教授惠赠),G-CSF(终浓度为100μg/ml，Kirin公司)，GM-CSF(终浓度为100μg/ml，先灵葆雅公司)。在37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养48h后离心弃上清。按1.9×105cfu/ml实验体系加入病毒上清及终浓度为8μg/ml polybrene(Sigma公司)，加细胞因子如上述浓度。阴性对照未转染。继续培养48h，收集细胞用流式细胞仪检测基因转移效率。同时再用同样方法作第二次转染，培养48h后，收集细胞检测基因转移效率。
, 百拇医药
表1 实验分组 组别
细胞因子
病毒
上清
SCF
IL-3
IL-6
G-CSF
GM-CSF
阴性对照
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, http://www.100md.com
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阳性对照
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实验组1
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实验组2
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4 基因转移效率测定 将各组的脐血及骨髓细胞制备成2×106/ml的细胞悬液,用PE(枣红蛋白)标记的抗人CD34+单抗标记，应用流式细胞仪(FACS calibar BD公司)分别获取细胞10000个，测定CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白(GFP)+细胞的百分率。
, 百拇医药
5 统计学处理 用χ2检验进行。结果
1 病毒上清滴度为1.9×105cfu/ml。
2 基因转移48h的转移效率 骨髓CD34+细胞阳性对照组基因转移效率为2.97%,实验组分别为4.75%,7.80%。脐血CD34+细胞阳性对照组转移效率为12.70%,实验组分别为15.50%,17.00%，两者相比差异有显著性意义(P<0.05)。
3 基因转移96h的转移效率 骨髓CD34+细胞阳性对照组基因转移效率为23.30%,实验组分别为50.50%,35.90%。脐血CD34+细胞阳性对照组转移效率为43.50%,实验组分别为76.10%,63.30%。两者相比差异非常显著(P<0.01)。显示在相同实验条件下脐血CD34+细胞较骨髓CD34+细胞有较高的基因转移效率。
, http://www.100md.com
讨论
实验证明:SCF、IL-3、IL-6联合应用能有效提高质粒GCGPXSN介导的造血干细胞基因转移效率。质粒GCGPXSN中含有GFP表达基因,基因转移效率的测定可用流式细胞仪来完成,此测定结果与经典方法所得结果一致[2,3]。用PE标记的抗人CD34单抗标记完成基因转移的靶细胞后,可用流式细胞仪测定转移效率。实验结果表明,无论脐血还是骨髓CD34+细胞,重复转染,延长培养时间可使基因转移效率同步增长,其原因可能是随细胞因子作用时间延长,静止期CD34+细胞更趋于活跃,进入增殖期,由此提高了转移效率[4],另外,外源基因转入CD34+细胞后的表达需一定的时间,延长培养时间可使GFP的表达量增加。
基因转移效率高低的影响因素主要是处于增殖期的靶细胞数量的多少及病毒滴度的高低。病毒滴度一定的情况下,增殖期靶细胞数量的增加也会使基因转移效率增加[5]。有实验证明,脐血在细胞因子的刺激下,其CD34+细胞可数十倍增加,骨髓CD34+细胞的扩增倍数少于脐血CD34+细胞扩增倍数[6]。脐血CD34+与骨髓CD34+细胞相比,可能会更易进入增殖期。考虑此为脐血CD34+细胞的基因转移效率高于骨髓的原因之一。
, http://www.100md.com
本实验研究中,实验组2与实验组1相比基因转移效率略有下降而较阳性对照组转移效率高,这说明G-CSF、GM-CSF对CD34+细胞有一定的扩增作用,但同时具有促进分化作用,使实验组2中处于增殖期的CD34+细胞比实验组1少,转移效率随之降低。
参考文献
1，Miller AD,law MF,Verma IM.Generation of helper free an photropic retroviruses that transduce a dominant-acting,methothotrexate-resistant and dihydrofolate reductage gene. Mol Cell Biol,1985，5:431-437.
2，王存邦，达万明，冀孟菊,等. 细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的影响. 中国实验血液学杂志, 1998，9:182-186.
, http://www.100md.com
3，王存邦,达万明,钱其军,等.流式细胞仪测定小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的实验研究. 中国激光医学杂志,1999，8:108-110.
4，Bernad A,Varas F,Gallego JM,et al.Ex vivo expansion and selection of retrovirally transduced bone marrow;an efficient methodology for gene transfer to murine lympho-hematopoietic stem cell. Br J Haematol,1994,87:6-17.
5，Clapp DW.Somatic gene therapy into hematopoietic cells. Clin Prinatol,1993，20:155-161.
6，裴雪涛,王立生,徐黎，等.造血生长因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用.中华血液学杂志,1996，17:305-307.
(收稿日期：1999-06-15), 百拇医药
单位：730050 兰州军区总医院、兰州军区血液病研究所
关键词：
中华血液学杂志000614 人脐血和骨髓CD34+细胞在相同实验条件下,基因转移效率是否相同尚未见报道。我们研究比较了干细胞因子(SCF),白细胞介素(IL)-3,IL-6等联合应用对人脐血和骨髓CD34+细胞基因转移效率的差别，为基因治疗的临床应用提供实验依据。
材料和方法
1 细胞系 G418抗性包装细胞株PA317-GCGPXSN及检测病毒滴度用细胞株NIH3T3，均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠。
, 百拇医药
2 病毒上清的制备及病毒滴度测定 按文献[1]进行。
3 基因转移 脐血9份,来自兰州市妇幼保健院健康产妇;骨髓9份,来自健康供者。将脐血和骨髓用Ficoll液(相对密度1.077)密度梯度离心并制备成2×106/ml的细胞悬液，分组情况见表1，分别加重组人(rh)IL-3,rhIL-6(终浓度均为200U/ml,Kirin公司)及rhSCF(终浓度为100ng/ml，由军事医学科学院沈培奋教授惠赠),G-CSF(终浓度为100μg/ml，Kirin公司)，GM-CSF(终浓度为100μg/ml，先灵葆雅公司)。在37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养48h后离心弃上清。按1.9×105cfu/ml实验体系加入病毒上清及终浓度为8μg/ml polybrene(Sigma公司)，加细胞因子如上述浓度。阴性对照未转染。继续培养48h，收集细胞用流式细胞仪检测基因转移效率。同时再用同样方法作第二次转染，培养48h后，收集细胞检测基因转移效率。
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表1 实验分组 组别
细胞因子
病毒
上清
SCF
IL-3
IL-6
G-CSF
GM-CSF
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4 基因转移效率测定 将各组的脐血及骨髓细胞制备成2×106/ml的细胞悬液,用PE(枣红蛋白)标记的抗人CD34+单抗标记，应用流式细胞仪(FACS calibar BD公司)分别获取细胞10000个，测定CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白(GFP)+细胞的百分率。
, 百拇医药
5 统计学处理 用χ2检验进行。结果
1 病毒上清滴度为1.9×105cfu/ml。
2 基因转移48h的转移效率 骨髓CD34+细胞阳性对照组基因转移效率为2.97%,实验组分别为4.75%,7.80%。脐血CD34+细胞阳性对照组转移效率为12.70%,实验组分别为15.50%,17.00%，两者相比差异有显著性意义(P<0.05)。
3 基因转移96h的转移效率 骨髓CD34+细胞阳性对照组基因转移效率为23.30%,实验组分别为50.50%,35.90%。脐血CD34+细胞阳性对照组转移效率为43.50%,实验组分别为76.10%,63.30%。两者相比差异非常显著(P<0.01)。显示在相同实验条件下脐血CD34+细胞较骨髓CD34+细胞有较高的基因转移效率。
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讨论
实验证明:SCF、IL-3、IL-6联合应用能有效提高质粒GCGPXSN介导的造血干细胞基因转移效率。质粒GCGPXSN中含有GFP表达基因,基因转移效率的测定可用流式细胞仪来完成,此测定结果与经典方法所得结果一致[2,3]。用PE标记的抗人CD34单抗标记完成基因转移的靶细胞后,可用流式细胞仪测定转移效率。实验结果表明,无论脐血还是骨髓CD34+细胞,重复转染,延长培养时间可使基因转移效率同步增长,其原因可能是随细胞因子作用时间延长,静止期CD34+细胞更趋于活跃,进入增殖期,由此提高了转移效率[4],另外,外源基因转入CD34+细胞后的表达需一定的时间,延长培养时间可使GFP的表达量增加。
基因转移效率高低的影响因素主要是处于增殖期的靶细胞数量的多少及病毒滴度的高低。病毒滴度一定的情况下,增殖期靶细胞数量的增加也会使基因转移效率增加[5]。有实验证明,脐血在细胞因子的刺激下,其CD34+细胞可数十倍增加,骨髓CD34+细胞的扩增倍数少于脐血CD34+细胞扩增倍数[6]。脐血CD34+与骨髓CD34+细胞相比,可能会更易进入增殖期。考虑此为脐血CD34+细胞的基因转移效率高于骨髓的原因之一。
, http://www.100md.com
本实验研究中,实验组2与实验组1相比基因转移效率略有下降而较阳性对照组转移效率高,这说明G-CSF、GM-CSF对CD34+细胞有一定的扩增作用,但同时具有促进分化作用,使实验组2中处于增殖期的CD34+细胞比实验组1少,转移效率随之降低。
参考文献
1，Miller AD,law MF,Verma IM.Generation of helper free an photropic retroviruses that transduce a dominant-acting,methothotrexate-resistant and dihydrofolate reductage gene. Mol Cell Biol,1985，5:431-437.
2，王存邦，达万明，冀孟菊,等. 细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的影响. 中国实验血液学杂志, 1998，9:182-186.
, http://www.100md.com
3，王存邦,达万明,钱其军,等.流式细胞仪测定小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的实验研究. 中国激光医学杂志,1999，8:108-110.
4，Bernad A,Varas F,Gallego JM,et al.Ex vivo expansion and selection of retrovirally transduced bone marrow;an efficient methodology for gene transfer to murine lympho-hematopoietic stem cell. Br J Haematol,1994,87:6-17.
5，Clapp DW.Somatic gene therapy into hematopoietic cells. Clin Prinatol,1993，20:155-161.
6，裴雪涛,王立生,徐黎，等.造血生长因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用.中华血液学杂志,1996，17:305-307.
(收稿日期：1999-06-15), 百拇医药