HL-60细胞早期凋亡中端粒酶hTERT基因表达的变化
作者：阎庆国 黄高升曰 张晓晖 王哲
单位：710032 西安，第四军医大学病理学教研室
关键词：
中华血液学杂志000611 端粒酶活性在正常体细胞(生殖细胞和造血细胞除外)受到严格的抑制，而在98%的永生化细胞系和约90%的包括造血组织肿瘤在内的恶性肿瘤细胞中重新活化,其催化亚基的编码基因为hTERT。近年来有关端粒酶的研究虽然已经较为深入，但关于药物诱导细胞凋亡过程中端粒酶催化亚基hTERT基因表达的研究尚未见报道。我们采用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对足叶乙甙(Vp16)诱导HL-60细胞出现早期凋亡前后的端粒酶催化亚基hTERT的mRNA表达变化进行了探讨。
材料和方法
1 细胞株 HL-60细胞株源自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。
, 百拇医药
2 主要试剂 Vp16购自德国Merck公司,蛋白酶K及异硫氰酸胍购自美国Sigma公司,M-MLV反转录酶及RPMI 1640购自美国Life Technologies公司,Taq DNA聚合酶购自上海Sangon公司。Annexin-V-Fluos染色试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。β-actin上游引物:5′-ACACTGTGGCCATCTACGAGGGG-3′,下游引物:5′-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′;hTERT上游引物:5′-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3′,下游引物5′-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3′[1]。以上引物委托Sangon公司合成。
3 Vp16诱导HL-60细胞凋亡 参照文献[3]的方法并在用药剂量上加以调整。HL-60细胞在37℃,体积分数为5%的RPMI 1640(10% FCS-1640)培养基中常规培养,分成a、b、c 3组,分别加Vp16至终浓度为1,2,3μg/ml,培养3h后分别收集细胞离心,用RPMI 1640洗2次,加体积分数为10%的FCS-1640后继续培养至6,12,24h，各组分别取1×106细胞用于梯状DNA检测和Annexin-V-Fluos染色。
, 百拇医药
4 梯状DNA电泳检测 将经Vp16诱导凋亡的各组细胞经PBS洗涤后置TNE细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl,pH 8.0; 0.1mol/L NaCl; 0.1mol/L EDTA, pH8.0; 5g/L SDS)37℃作用1h,0.1mg/ml蛋白酶K,50℃ 3h,上清经酚-氯仿抽提后沉淀于异丙醇中,回收的DNA经20g/L琼脂糖凝胶电泳检测。
5 Annexin-V-Fluos染色 按试剂盒说明,取20μl Annexin-V-Fluos,20μl 碘化丙锭(PI)和1μl Hepes缓冲液配成染色溶液,在EP管中HL-60细胞与现配的染色溶液37℃孵育10min,置荧光显微镜下观察。
6 RT-PCR 用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。cDNA合成:逆转录反应体系20μl,包括细胞总RNA 1μg,5×逆转录反应缓冲液4μl,2.5mmol/L dNTP 4μl,oligo(dt)18 2μl,M-MLV反转录酶200U,37℃反应1h,99℃5min终止反应；PCR反应体系50μl,包括等量逆转录反应产物4μl, β-actin及hTERT的寡核苷酸引物5pmol,2.5mmol/L dNTP 4μl,10×PCR反应缓冲液5μl,Taq DNA聚合酶1.5U,PCR循环参数为94℃ 45s,57℃ 45s,74℃ 60s,30个循环。20g/L琼脂糖凝胶电泳检测。
, http://www.100md.com
结 果
1 Vp16诱导HL-60细胞凋亡 为确定Vp16诱导HL-60细胞出现早期凋亡的合适浓度和时间点,我们在陈协群等[3]实验基础上,选择1，2和4μg/ml三个药物浓度和6，12，24h三个时间点,取样检测梯状DNA。如图1所示,a1～c3各组均显示Vp16可诱导HL-60细胞凋亡,出现典型的180bp倍数关系的梯状DNA，表明Vp16在这三个药物浓度和作用时间点上均可诱导HL-60细胞出现凋亡,且药物浓度越大,作用时间越长,其凋亡细胞出现DNA断点越多,梯状DNA越明显；c3和b3两组的梯状DNA不甚明显，提示在此时相出现的细胞凋亡较其它组是更早阶段的。
图1 Vp16诱导HL-60细胞凋亡的梯度DNA检测
2 Annexin-V-Fluos染色显示早期凋亡 从梯状DNA的强度可推测在c3阶段出现的凋亡是更早阶段的,对此时相的细胞我们进一步用显示早期凋亡的Annexin-V-Fluos染色做了凋亡阶段的鉴定。荧光染色显示Annexin-V-Fluos主要结合于外层胞膜,表明在此阶段的凋亡细胞主要处于凋亡早期。
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3 RT-PCR显示Vp16诱导凋亡早期hTERT mRNA表达的变化 根据梯状DNA状况结合Annexin-V-Fluos染色可知在1μg/ml Vp16药物剂量下作用6h诱导的HL-60细胞凋亡主要处于早期阶段。选择收集此时相的HL-60细胞和未经Vp16诱导的HL-60细胞分别提取细胞总RNA,取等量的RNA经RT-PCR分别检测hTERT和β-actin的mRNA表达。图2表明相同的HL-60细胞在Vp16诱导出现早期凋亡前后,内对照β-actin的mRNA表达无明显变化,而hTERT的mRNA在诱导凋亡早期即出现表达减弱。
讨论
HL-60细胞存在多种凋亡相关基因的异常调控;同时具有异常的端粒酶活性,因此我们运用Vp16诱导HL-60细胞凋亡作为研究凋亡前后端粒酶基因表达变化的模型。我们将结合梯状DNA和Annexin-V-Fluos染色确定Vp16诱导的HL-60早期凋亡细胞,与未经药物诱导的HL-60细胞比较,检测了与端粒酶活性关系最为密切的催化亚基hTERT的mRNA表达变化，结果HL-60细胞凋亡后反应hTERT表达的电泳条带变弱，而内对照β-actin电泳条带无明显变化,提示在Vp16诱导HL-60细胞凋亡早期hTERT在mRNA水平的表达减弱。Kyo等[4]的研究表明，端粒酶催化亚基hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性呈正相关。由此我们推测Vp16诱导HL-60细胞凋亡早期即可能伴随端粒酶活性的下降。至于凋亡启动后端粒酶表达发生改变的机制，一方面可能是由于凋亡相关基因的直接调控；另一方面Fletcher等[5]注意到端粒酶活性的维持依赖于胞核结构的完整性。在凋亡过程中由于内源性核酸内切酶的活化致使细胞DNA断裂，细胞完整性受到破坏，这可能影响到端粒酶的表达和活性。
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图2 Vp16诱导前后HL-60细胞hTERT及β-actin的RT-PCR检测
在Vp16诱导HL-60细胞凋亡的早期即出现端粒酶催化亚基hTERT基因mRNA表达的减弱,提示Vp16诱导HL-60细胞凋亡的调控可能与端粒酶基因表达调控之间存在较密切的联系。进一步研究Vp16等化疗药物诱导细胞凋亡与端粒酶改变的关系,不仅有助于深入了解二者间的内在联系,而且有助于进一步认识Vp16等化疗药物的作用机制,为联合促进凋亡并抑制端粒酶活性这一治疗恶性肿瘤的新途径提供理论依据。
参考文献
1，Nakamura TM,Morin GB,Chapman KB，et al.Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.Science,1997，277:955-959.
, http://www.100md.com
2，Meyerson M,Counter CM,Eaton EN，et al.hEST2,the putative human telomerase catalytic subunit gene,is up-regulated in tumor cells and during immortalization.Cell,1997，90:785-795.
3，陈协群,黄高升,王文亮，等.抗癌剂诱导白血病细胞凋亡的生化机理研究.第四军医大学学报,1996，17:415-417.
4，Kyo S,Takakura M,Kanaya T，et al.Expression of human telomerase subunits in gynecological tumors.Proc Am Associ Can Res,1998，39:569.
5，Fletcher T,Trevino A， Woynarowski JM.Enzymatic activity of telomerase associated with intact nuclei.Proc Am Associ Can Res,1998，39:567.
(收稿日期：1999-05-24), http://www.100md.com
单位：710032 西安，第四军医大学病理学教研室
关键词：
中华血液学杂志000611 端粒酶活性在正常体细胞(生殖细胞和造血细胞除外)受到严格的抑制，而在98%的永生化细胞系和约90%的包括造血组织肿瘤在内的恶性肿瘤细胞中重新活化,其催化亚基的编码基因为hTERT。近年来有关端粒酶的研究虽然已经较为深入，但关于药物诱导细胞凋亡过程中端粒酶催化亚基hTERT基因表达的研究尚未见报道。我们采用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对足叶乙甙(Vp16)诱导HL-60细胞出现早期凋亡前后的端粒酶催化亚基hTERT的mRNA表达变化进行了探讨。
材料和方法
1 细胞株 HL-60细胞株源自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。
, 百拇医药
2 主要试剂 Vp16购自德国Merck公司,蛋白酶K及异硫氰酸胍购自美国Sigma公司,M-MLV反转录酶及RPMI 1640购自美国Life Technologies公司,Taq DNA聚合酶购自上海Sangon公司。Annexin-V-Fluos染色试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。β-actin上游引物:5′-ACACTGTGGCCATCTACGAGGGG-3′,下游引物:5′-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′;hTERT上游引物:5′-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3′,下游引物5′-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3′[1]。以上引物委托Sangon公司合成。
3 Vp16诱导HL-60细胞凋亡 参照文献[3]的方法并在用药剂量上加以调整。HL-60细胞在37℃,体积分数为5%的RPMI 1640(10% FCS-1640)培养基中常规培养,分成a、b、c 3组,分别加Vp16至终浓度为1,2,3μg/ml,培养3h后分别收集细胞离心,用RPMI 1640洗2次,加体积分数为10%的FCS-1640后继续培养至6,12,24h，各组分别取1×106细胞用于梯状DNA检测和Annexin-V-Fluos染色。
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4 梯状DNA电泳检测 将经Vp16诱导凋亡的各组细胞经PBS洗涤后置TNE细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl,pH 8.0; 0.1mol/L NaCl; 0.1mol/L EDTA, pH8.0; 5g/L SDS)37℃作用1h,0.1mg/ml蛋白酶K,50℃ 3h,上清经酚-氯仿抽提后沉淀于异丙醇中,回收的DNA经20g/L琼脂糖凝胶电泳检测。
5 Annexin-V-Fluos染色 按试剂盒说明,取20μl Annexin-V-Fluos,20μl 碘化丙锭(PI)和1μl Hepes缓冲液配成染色溶液,在EP管中HL-60细胞与现配的染色溶液37℃孵育10min,置荧光显微镜下观察。
6 RT-PCR 用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。cDNA合成:逆转录反应体系20μl,包括细胞总RNA 1μg,5×逆转录反应缓冲液4μl,2.5mmol/L dNTP 4μl,oligo(dt)18 2μl,M-MLV反转录酶200U,37℃反应1h,99℃5min终止反应；PCR反应体系50μl,包括等量逆转录反应产物4μl, β-actin及hTERT的寡核苷酸引物5pmol,2.5mmol/L dNTP 4μl,10×PCR反应缓冲液5μl,Taq DNA聚合酶1.5U,PCR循环参数为94℃ 45s,57℃ 45s,74℃ 60s,30个循环。20g/L琼脂糖凝胶电泳检测。
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结 果
1 Vp16诱导HL-60细胞凋亡 为确定Vp16诱导HL-60细胞出现早期凋亡的合适浓度和时间点,我们在陈协群等[3]实验基础上,选择1，2和4μg/ml三个药物浓度和6，12，24h三个时间点,取样检测梯状DNA。如图1所示,a1～c3各组均显示Vp16可诱导HL-60细胞凋亡,出现典型的180bp倍数关系的梯状DNA，表明Vp16在这三个药物浓度和作用时间点上均可诱导HL-60细胞出现凋亡,且药物浓度越大,作用时间越长,其凋亡细胞出现DNA断点越多,梯状DNA越明显；c3和b3两组的梯状DNA不甚明显，提示在此时相出现的细胞凋亡较其它组是更早阶段的。
图1 Vp16诱导HL-60细胞凋亡的梯度DNA检测
2 Annexin-V-Fluos染色显示早期凋亡 从梯状DNA的强度可推测在c3阶段出现的凋亡是更早阶段的,对此时相的细胞我们进一步用显示早期凋亡的Annexin-V-Fluos染色做了凋亡阶段的鉴定。荧光染色显示Annexin-V-Fluos主要结合于外层胞膜,表明在此阶段的凋亡细胞主要处于凋亡早期。
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3 RT-PCR显示Vp16诱导凋亡早期hTERT mRNA表达的变化 根据梯状DNA状况结合Annexin-V-Fluos染色可知在1μg/ml Vp16药物剂量下作用6h诱导的HL-60细胞凋亡主要处于早期阶段。选择收集此时相的HL-60细胞和未经Vp16诱导的HL-60细胞分别提取细胞总RNA,取等量的RNA经RT-PCR分别检测hTERT和β-actin的mRNA表达。图2表明相同的HL-60细胞在Vp16诱导出现早期凋亡前后,内对照β-actin的mRNA表达无明显变化,而hTERT的mRNA在诱导凋亡早期即出现表达减弱。
讨论
HL-60细胞存在多种凋亡相关基因的异常调控;同时具有异常的端粒酶活性,因此我们运用Vp16诱导HL-60细胞凋亡作为研究凋亡前后端粒酶基因表达变化的模型。我们将结合梯状DNA和Annexin-V-Fluos染色确定Vp16诱导的HL-60早期凋亡细胞,与未经药物诱导的HL-60细胞比较,检测了与端粒酶活性关系最为密切的催化亚基hTERT的mRNA表达变化，结果HL-60细胞凋亡后反应hTERT表达的电泳条带变弱，而内对照β-actin电泳条带无明显变化,提示在Vp16诱导HL-60细胞凋亡早期hTERT在mRNA水平的表达减弱。Kyo等[4]的研究表明，端粒酶催化亚基hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性呈正相关。由此我们推测Vp16诱导HL-60细胞凋亡早期即可能伴随端粒酶活性的下降。至于凋亡启动后端粒酶表达发生改变的机制，一方面可能是由于凋亡相关基因的直接调控；另一方面Fletcher等[5]注意到端粒酶活性的维持依赖于胞核结构的完整性。在凋亡过程中由于内源性核酸内切酶的活化致使细胞DNA断裂，细胞完整性受到破坏，这可能影响到端粒酶的表达和活性。
, 百拇医药
图2 Vp16诱导前后HL-60细胞hTERT及β-actin的RT-PCR检测
在Vp16诱导HL-60细胞凋亡的早期即出现端粒酶催化亚基hTERT基因mRNA表达的减弱,提示Vp16诱导HL-60细胞凋亡的调控可能与端粒酶基因表达调控之间存在较密切的联系。进一步研究Vp16等化疗药物诱导细胞凋亡与端粒酶改变的关系,不仅有助于深入了解二者间的内在联系,而且有助于进一步认识Vp16等化疗药物的作用机制,为联合促进凋亡并抑制端粒酶活性这一治疗恶性肿瘤的新途径提供理论依据。
参考文献
1，Nakamura TM,Morin GB,Chapman KB，et al.Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.Science,1997，277:955-959.
, http://www.100md.com
2，Meyerson M,Counter CM,Eaton EN，et al.hEST2,the putative human telomerase catalytic subunit gene,is up-regulated in tumor cells and during immortalization.Cell,1997，90:785-795.
3，陈协群,黄高升,王文亮，等.抗癌剂诱导白血病细胞凋亡的生化机理研究.第四军医大学学报,1996，17:415-417.
4，Kyo S,Takakura M,Kanaya T，et al.Expression of human telomerase subunits in gynecological tumors.Proc Am Associ Can Res,1998，39:569.
5，Fletcher T,Trevino A， Woynarowski JM.Enzymatic activity of telomerase associated with intact nuclei.Proc Am Associ Can Res,1998，39:567.
(收稿日期：1999-05-24), http://www.100md.com