转导p16 cDNA对Jurkat细胞的生长抑制作用
作者：武莎莎 王申五 马丽萍 刘玉京 潘秀英
单位：武莎莎(100044 北京医科大学人民医院血液病研究所)；王申五(100044 北京医科大学人民医院血液病研究所)；马丽萍(北京医科大学人民医院中心实验室)；刘玉京(北京医科大学人民医院中心实验室)；潘秀英(北京医科大学人民医院中心实验室)
关键词：
中华血液学杂志000609 P16(MTS-1/CDKN2)蛋白是细胞从G1期向S期转换的主要抑制因子,许多白血病细胞p16基因缺失，尤其是急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)，缺失率可达83%[1]。 提示p16基因与T-ALL的发生、发展有关。我们构建了p16的逆转录病毒载体，体外转导缺失p16的T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat, 以探讨p16对T淋巴细胞白血病的治疗作用。
, http://www.100md.com 材料和方法
1 细胞培养 Jurkat细胞由中国医学科学院基础医学研究所吴宁华教授惠赠，文献报道和实验均证明其p16基因纯合性缺失，Rb基因正常表达[2]。双嗜性包装细胞PT67购自Clontech公司，单嗜性包装细胞Ψ2由首都医科大学商永磊赠。Jurkat细胞培养于RPMI 1640(BRL)培养液,其它贴壁细胞培养于含体积分数为10%的胎牛血清(FBS，天津川页生物制品有限公司) 的高糖DMEM(GIBCO/BRL)中。无特殊说明的培养条件均为体积分数为5% CO2, 37℃培养。P16单抗及内对照Actin(相对分子质量为46000)购自美国Santa Crus公司。PCR分子量标准购于华美公司，pUC19/Msp Ⅰ分子量标准为自制。
2 p16逆转录病毒载体的构建 0.8kb的p16 cDNA(美国冷泉港实验室David Beach 教授惠赠)以两端EcoR Ⅰ和XhoⅠ定向插入逆转录病毒载体pLXSN(5.8kb)5′LTR下游的多克隆位点。T4 DNA连接酶(Promega)16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌MC1061，菌落原位杂交法筛选阳性克隆[3]，酶切鉴定。大量扩增重组质粒。用含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)[4]的逆转录病毒载体pLESN作为对照。
, 百拇医药
3 重组逆转录病毒的体外包装 根据Fugene6TM转染试剂说明书(Boehringer Mannheim公司)提供的方法对双嗜性包装细胞PT67进行转染。48h后加G418(GIBCO/BRL) 500μg/ml进行筛选，直至抗性克隆形成。在扩增形成的克隆中用斑点杂交法筛选产高滴度病毒上清的包装细胞，收集上清与单嗜性包装细胞Ψ2 进行“乒乓”感染(用从一个类型的包装细胞短暂产生的病毒感染另一个带有不同类别的包膜基因的包装细胞系)[5]。
4 体外转导Jurkat细胞 转导前一天传代生长良好的细胞，调细胞浓度达5×105/ml。离心弃去培养液，加入含聚溴化季锭(polybrene)(Sigma) 4μg/ml的病毒上清，37℃孵育2h，每隔半小时轻摇1次。离心去病毒上清，更换新鲜培养液，24h后重复以上操作，共4次。将上述Jurkat细胞加入到含G418 600μg/ml的培养液中进行筛选，直至克隆形成。混合形成克隆，扩增冻存备用。
, 百拇医药
5 外源性p16基因表达分析 常规方法提取细胞总RNA,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，p16基因引物、内参照引物及扩增条件见文献[6]。Western blot检测外源性P16蛋白的表达。常规方法提取细胞总蛋白，以120g/L SDS聚丙烯酰胺凝脉作电泳,碱性磷酸酶标记显色检测P16抗原的存在。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。
6 细胞生长特性观察 倒置相差显微镜、台盼蓝染色计数活细胞，每一种细胞培养3瓶，每瓶计数3次，取平均值，连续计数5d，绘制生长曲线。采用流式细胞仪检测细胞周期及亚二倍体峰。
7 软琼脂集落形成实验 配制50g/L的低融点琼脂糖，以培养液稀释为5g/L作为底层，上层3g/L琼脂中含G418 600μg/ml，上层琼脂中种入1000个细胞，充分混匀，每种细胞重复3个孔。培养12～20d后计数大于50个细胞的集落。
8 统计学处理 数据以均数形式表示，显著性检验用t检验。
, 百拇医药
结果
1 以p16 cDNA为探针，菌落原位杂交法筛选出阳性菌落，酶切和质粒测序证明重组成功。pLMSN转染PT67,经与Ψ2 “乒乓”感染6次后病毒上清克隆形成法测其滴度为1×106cfu/ml。
2 Jurkat细胞分别转导重组绿色荧光蛋白逆转录病毒和p16逆转录病毒，经G418筛选所得克隆分别命名为Jurkat-p16、Jurkat-EGFP。荧光显微镜观察到Jurkat-EGFP绿色荧光蛋白的表达,证明转导成功。分别提取两种细胞的RNA,逆转录成cDNA后进行PCR,只有Jurkat-p16中能够扩增出310bp的p16cDNA片段(图1)。Western blot结果显示只有Jurkat-p16中有外源性p16蛋白的表达(图2)。
3 转导p16基因后Jurkat细胞发生表型改变，细胞体积变小，折光性降低，细胞周边的“毛刺状”突起减少。细胞生长明显受抑制(图3)。流式细胞仪检测可见Jurkat-p16 G0/G1期细胞明显多于对照Jurkat-EGFP细胞(表1)。
, 百拇医药
4 Jurkat-p16细胞在软琼脂中的集落形成率下降了48%，且形成的集落明显小于Jurkat-EGFP细胞(表1)。
5 转导pLMSN和转导pLESN的Jurkat细胞亚二倍体峰均有增高，但二者经统计学检验差异无显著性。
1：pUC19/MspⅠ Marker; 2:Jurkat-EGFP细胞；3：Jurkat-p16细胞；4：PCR Marker
图1 RT-PCR扩增p16 cDNA(310bp)片段β-actin(392bp)为内对照
1：Hela细胞；2：Jurkat-p16细胞；3:Jurkat-EGFP细胞
, 百拇医药
图2 Western blot 分析p16蛋白的表达
图3 转导p16及对照病毒对Jurkat细胞生长的影响
讨论
白血病是国内较为多发的恶性肿瘤，尤其是急性T细胞白血病，治疗效果差，生存率低。而p16在T淋巴细胞白血病细胞系中缺失率高达83%[1]。因此，p16缺失可能与T细胞白血病的发生有关，p16基因的重建对此类白血病有潜在的治疗意义。为提高逆转录病毒的转导效率,我们购进新型兼性包装细胞PT67和单嗜性包装细胞Ψ2“乒乓”感染,将治疗基因病毒滴度提高到1×106cfu/ml。增强型绿色荧光蛋白荧光强度高、对细胞毒性小，是目前使用较为广泛的活细胞分子探针[5]。用其作对照基因，测得转导效率为30%。在本实验中，病毒连续作用2d后即可产生明显的生长抑制作用，细胞计数明显少于转染对照载体和未转染细胞。但6～7d后细胞生长开始恢复，说明p16的异位表达不易稳定存在。经G418筛选出的Jurkat-p16细胞生长慢于对照Jurkat-EGFP和Jurkat,说明整合后的p16基因可以抑制细胞生长。流式细胞仪检测发现此时G1期细胞明显增多，表明生长抑制作用是通过G1期阻滞实现的。光镜下观察Jurkat-p16细胞表型改变，表现为折光性降低，细胞表面突起减少，细胞内颗粒增多。对p16是否引起凋亡国内外看法不一，多数认为它与其它抑癌基因同时作用才致凋亡[7]。我们经多次试验Jurkat-p16和Jurkat-neo的亚二倍体峰虽都有增高，但结果经统计学检验差异无显著性。即这个凋亡很可能是由病毒本身引起的，而非p16基因的作用，即从本试验来看p16无明显促凋亡作用。
, 百拇医药
通过以上实验证明：肿瘤抑制基因p16在其缺失白血病细胞系中的重建可以在体外抑制细胞的增殖，这一抑制作用是通过Rb依赖性途径实现的。p16体外转导无明显促凋亡作用。
表1 转染后的Jurkat细胞周期分布及集落形成率(
±s) 组别
细胞周期
集落形成率(个/103细胞)
G0/G1
S
G2/M
Jurkat-EGFP细胞
, 百拇医药
50.18±2.10
32.95±2.40
16.87±1.03
157.0±11.4
Jurkat-p16细胞
68.79±3.40*
20.14±0.70
11.08±2.90
82.0±9.1*
注：与对照组相比,*P<0.01 参考文献
1，Stranks G, Height SE, Mitchell P, et al. Deletions and rearrangements of CDKN2 in lymphoid malignancy. Blood，1995，85:893-901.
, 百拇医药
2，Quesnel B, Preudhomme C, Phillippe N, et al. p16 gene homozygous deletions in acute lymphoblastic leukemia. Blood,1995, 85：657-663.
3，陈德喜，魏姝，王申五.化学发光杂交进行菌落克隆的原位筛选. 生物化学杂志，1997，5：537-539.
4，Bierhuizen MF, Westerman Y, Visser TP, et al. Enhanced green fluorescent protein as an electable marker of retroviral-mediated gene transfer in immature hematopoietic bone marrow cells. Blood， 1997，90:3304-3315.
, 百拇医药
5，奥斯伯 F，金斯顿 RE， 塞德曼 JG，等. 精编分子生物学实验指南.颜子颖，王海林,译. 第1版. 北京：科学出版社，1998. 317.
6，武莎莎,王申五,马丽萍，等. p16逆转录病毒载体的构建及其高滴度克隆的杂交筛选.中国生物化学和分子生物学报，2000，1：82-85.
7，Sandig V, Brand K, Herwig S, et al. Adenovirally transferred p16 INK4/CDKN2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death. Nat Med， 1997，3:313-319.
(收稿日期：1999-12-08), 百拇医药
单位：武莎莎(100044 北京医科大学人民医院血液病研究所)；王申五(100044 北京医科大学人民医院血液病研究所)；马丽萍(北京医科大学人民医院中心实验室)；刘玉京(北京医科大学人民医院中心实验室)；潘秀英(北京医科大学人民医院中心实验室)
关键词：
中华血液学杂志000609 P16(MTS-1/CDKN2)蛋白是细胞从G1期向S期转换的主要抑制因子,许多白血病细胞p16基因缺失，尤其是急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)，缺失率可达83%[1]。 提示p16基因与T-ALL的发生、发展有关。我们构建了p16的逆转录病毒载体，体外转导缺失p16的T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat, 以探讨p16对T淋巴细胞白血病的治疗作用。
, http://www.100md.com 材料和方法
1 细胞培养 Jurkat细胞由中国医学科学院基础医学研究所吴宁华教授惠赠，文献报道和实验均证明其p16基因纯合性缺失，Rb基因正常表达[2]。双嗜性包装细胞PT67购自Clontech公司，单嗜性包装细胞Ψ2由首都医科大学商永磊赠。Jurkat细胞培养于RPMI 1640(BRL)培养液,其它贴壁细胞培养于含体积分数为10%的胎牛血清(FBS，天津川页生物制品有限公司) 的高糖DMEM(GIBCO/BRL)中。无特殊说明的培养条件均为体积分数为5% CO2, 37℃培养。P16单抗及内对照Actin(相对分子质量为46000)购自美国Santa Crus公司。PCR分子量标准购于华美公司，pUC19/Msp Ⅰ分子量标准为自制。
2 p16逆转录病毒载体的构建 0.8kb的p16 cDNA(美国冷泉港实验室David Beach 教授惠赠)以两端EcoR Ⅰ和XhoⅠ定向插入逆转录病毒载体pLXSN(5.8kb)5′LTR下游的多克隆位点。T4 DNA连接酶(Promega)16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌MC1061，菌落原位杂交法筛选阳性克隆[3]，酶切鉴定。大量扩增重组质粒。用含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)[4]的逆转录病毒载体pLESN作为对照。
, 百拇医药
3 重组逆转录病毒的体外包装 根据Fugene6TM转染试剂说明书(Boehringer Mannheim公司)提供的方法对双嗜性包装细胞PT67进行转染。48h后加G418(GIBCO/BRL) 500μg/ml进行筛选，直至抗性克隆形成。在扩增形成的克隆中用斑点杂交法筛选产高滴度病毒上清的包装细胞，收集上清与单嗜性包装细胞Ψ2 进行“乒乓”感染(用从一个类型的包装细胞短暂产生的病毒感染另一个带有不同类别的包膜基因的包装细胞系)[5]。
4 体外转导Jurkat细胞 转导前一天传代生长良好的细胞，调细胞浓度达5×105/ml。离心弃去培养液，加入含聚溴化季锭(polybrene)(Sigma) 4μg/ml的病毒上清，37℃孵育2h，每隔半小时轻摇1次。离心去病毒上清，更换新鲜培养液，24h后重复以上操作，共4次。将上述Jurkat细胞加入到含G418 600μg/ml的培养液中进行筛选，直至克隆形成。混合形成克隆，扩增冻存备用。
, 百拇医药
5 外源性p16基因表达分析 常规方法提取细胞总RNA,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，p16基因引物、内参照引物及扩增条件见文献[6]。Western blot检测外源性P16蛋白的表达。常规方法提取细胞总蛋白，以120g/L SDS聚丙烯酰胺凝脉作电泳,碱性磷酸酶标记显色检测P16抗原的存在。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。
6 细胞生长特性观察 倒置相差显微镜、台盼蓝染色计数活细胞，每一种细胞培养3瓶，每瓶计数3次，取平均值，连续计数5d，绘制生长曲线。采用流式细胞仪检测细胞周期及亚二倍体峰。
7 软琼脂集落形成实验 配制50g/L的低融点琼脂糖，以培养液稀释为5g/L作为底层，上层3g/L琼脂中含G418 600μg/ml，上层琼脂中种入1000个细胞，充分混匀，每种细胞重复3个孔。培养12～20d后计数大于50个细胞的集落。
8 统计学处理 数据以均数形式表示，显著性检验用t检验。
, 百拇医药
结果
1 以p16 cDNA为探针，菌落原位杂交法筛选出阳性菌落，酶切和质粒测序证明重组成功。pLMSN转染PT67,经与Ψ2 “乒乓”感染6次后病毒上清克隆形成法测其滴度为1×106cfu/ml。
2 Jurkat细胞分别转导重组绿色荧光蛋白逆转录病毒和p16逆转录病毒，经G418筛选所得克隆分别命名为Jurkat-p16、Jurkat-EGFP。荧光显微镜观察到Jurkat-EGFP绿色荧光蛋白的表达,证明转导成功。分别提取两种细胞的RNA,逆转录成cDNA后进行PCR,只有Jurkat-p16中能够扩增出310bp的p16cDNA片段(图1)。Western blot结果显示只有Jurkat-p16中有外源性p16蛋白的表达(图2)。
3 转导p16基因后Jurkat细胞发生表型改变，细胞体积变小，折光性降低，细胞周边的“毛刺状”突起减少。细胞生长明显受抑制(图3)。流式细胞仪检测可见Jurkat-p16 G0/G1期细胞明显多于对照Jurkat-EGFP细胞(表1)。
, 百拇医药
4 Jurkat-p16细胞在软琼脂中的集落形成率下降了48%，且形成的集落明显小于Jurkat-EGFP细胞(表1)。
5 转导pLMSN和转导pLESN的Jurkat细胞亚二倍体峰均有增高，但二者经统计学检验差异无显著性。
1：pUC19/MspⅠ Marker; 2:Jurkat-EGFP细胞；3：Jurkat-p16细胞；4：PCR Marker
图1 RT-PCR扩增p16 cDNA(310bp)片段β-actin(392bp)为内对照
1：Hela细胞；2：Jurkat-p16细胞；3:Jurkat-EGFP细胞
, 百拇医药
图2 Western blot 分析p16蛋白的表达
图3 转导p16及对照病毒对Jurkat细胞生长的影响
讨论
白血病是国内较为多发的恶性肿瘤，尤其是急性T细胞白血病，治疗效果差，生存率低。而p16在T淋巴细胞白血病细胞系中缺失率高达83%[1]。因此，p16缺失可能与T细胞白血病的发生有关，p16基因的重建对此类白血病有潜在的治疗意义。为提高逆转录病毒的转导效率,我们购进新型兼性包装细胞PT67和单嗜性包装细胞Ψ2“乒乓”感染,将治疗基因病毒滴度提高到1×106cfu/ml。增强型绿色荧光蛋白荧光强度高、对细胞毒性小，是目前使用较为广泛的活细胞分子探针[5]。用其作对照基因，测得转导效率为30%。在本实验中，病毒连续作用2d后即可产生明显的生长抑制作用，细胞计数明显少于转染对照载体和未转染细胞。但6～7d后细胞生长开始恢复，说明p16的异位表达不易稳定存在。经G418筛选出的Jurkat-p16细胞生长慢于对照Jurkat-EGFP和Jurkat,说明整合后的p16基因可以抑制细胞生长。流式细胞仪检测发现此时G1期细胞明显增多，表明生长抑制作用是通过G1期阻滞实现的。光镜下观察Jurkat-p16细胞表型改变，表现为折光性降低，细胞表面突起减少，细胞内颗粒增多。对p16是否引起凋亡国内外看法不一，多数认为它与其它抑癌基因同时作用才致凋亡[7]。我们经多次试验Jurkat-p16和Jurkat-neo的亚二倍体峰虽都有增高，但结果经统计学检验差异无显著性。即这个凋亡很可能是由病毒本身引起的，而非p16基因的作用，即从本试验来看p16无明显促凋亡作用。
, 百拇医药
通过以上实验证明：肿瘤抑制基因p16在其缺失白血病细胞系中的重建可以在体外抑制细胞的增殖，这一抑制作用是通过Rb依赖性途径实现的。p16体外转导无明显促凋亡作用。
表1 转染后的Jurkat细胞周期分布及集落形成率(
±s) 组别细胞周期
集落形成率(个/103细胞)
G0/G1
S
G2/M
Jurkat-EGFP细胞
, 百拇医药
50.18±2.10
32.95±2.40
16.87±1.03
157.0±11.4
Jurkat-p16细胞
68.79±3.40*
20.14±0.70
11.08±2.90
82.0±9.1*
注：与对照组相比,*P<0.01 参考文献
1，Stranks G, Height SE, Mitchell P, et al. Deletions and rearrangements of CDKN2 in lymphoid malignancy. Blood，1995，85:893-901.
, 百拇医药
2，Quesnel B, Preudhomme C, Phillippe N, et al. p16 gene homozygous deletions in acute lymphoblastic leukemia. Blood,1995, 85：657-663.
3，陈德喜，魏姝，王申五.化学发光杂交进行菌落克隆的原位筛选. 生物化学杂志，1997，5：537-539.
4，Bierhuizen MF, Westerman Y, Visser TP, et al. Enhanced green fluorescent protein as an electable marker of retroviral-mediated gene transfer in immature hematopoietic bone marrow cells. Blood， 1997，90:3304-3315.
, 百拇医药
5，奥斯伯 F，金斯顿 RE， 塞德曼 JG，等. 精编分子生物学实验指南.颜子颖，王海林,译. 第1版. 北京：科学出版社，1998. 317.
6，武莎莎,王申五,马丽萍，等. p16逆转录病毒载体的构建及其高滴度克隆的杂交筛选.中国生物化学和分子生物学报，2000，1：82-85.
7，Sandig V, Brand K, Herwig S, et al. Adenovirally transferred p16 INK4/CDKN2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death. Nat Med， 1997，3:313-319.
(收稿日期：1999-12-08), 百拇医药