薏苡仁提取物诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡和抑制增殖的体内实验
作者：郑世营 李德春 张志德 沈振亚 匡玉庭
单位：郑世营 李德春 张志德 沈振亚 匡玉庭(苏州大学附属第一医院 苏州 215006)
关键词：胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的；细胞凋亡；细胞增殖；薏苡仁
肿瘤000624
中图分类号：R73-36，R735.2 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0460-02
细胞凋亡(Apoptosis)是由基因调控的主动的细胞死亡过程，与细胞增殖互补，共同维持机体的器官组织细胞数量的稳定。恶性肿瘤的发生和发展的过程，是细胞的过度增殖和细胞凋亡受到抑制的过程[1]。化疗诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤综合治疗中的重要手段。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，但目前有关化疗诱导胃癌细胞凋亡的研究极少。本研究用小鼠SGC-7901胃癌模型，研究体内薏苡仁提取物(康莱特，KLT)对SGC-7901胃癌细胞凋亡和增殖的影响，以评价KLT化疗的临床价值。
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材料与方法
一、动物模型 昆明种小鼠20只，25 g左右，由苏州大学医学院实验动物中心提供。在小鼠右腋皮下接种SGC-7901小鼠胃癌细胞2×106个/只(胃癌SGC-7901细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供)，随机分为两组，荷瘤对照组和化疗组，每组10只。
二、药物 KLT(10%)由浙江康莱特药业有限公司提供，规格100 ml/瓶，批号：0004061-2
三、主要试剂 ABC试剂盒，购自Vector公司。PCNA(PC10)，购自DAKO公司。TUNEL试剂盒，购自Boehringer Mannheim公司。
四、实验方法 1.动物实验部分 小鼠接种胃癌细胞后第2天开始给药。化疗组：KLT剂量10 μl/ml(12.5 ml/kg)，腹腔注射。荷瘤对照组：每只腹腔注射生理盐水0.2 ml/d。连续10天，第11天处死小鼠，取出瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率：
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并制作石蜡切片，供免疫组化用。
2.PCNA测定 切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，加PCNA(PC10)单抗，工作浓度1∶50，60 min后，4 ℃过夜，加二抗马抗鼠IgG，工作浓度1∶200， 60 min后，加ABC试剂，工作浓度1∶100，60 min后，DAB显色，苏木精对比染色，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。以PBS替代PCNA单抗，作阴性对照。细胞核有棕色颗粒，即为PCNA阳性细胞。每张切片选染色最强，最集中的10个高倍视野(×400)，共计数4000个肿瘤细胞中的阳性细胞数，得出阳性细胞百分数，为增殖细胞核抗原指数(PI)。
3.细胞凋亡的测定 采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP末端标记技术(TUNEL标记法)。切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，滴加0.05 %胰酶，消化30 min，滴加配制的含脱氧核苷酸末端转移酶和dUTP的反应混合液，置37 ℃湿盒，温育60 min，滴加连接过氧化物酶的抗荧光素抗体，37 ℃湿盒，60 min，DAB显色，见到棕黄色的阳性细胞后，终止反应，苏木精对比染色，二甲苯透明，树胶封固。选取切片中阳性染色最明显的区域，根据凋亡形态，或结合切片，同上计数凋亡细胞。得出阳性细胞百分数(AI)。
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五、统计学处理 采用SPSS软件，进行t检验。
结 果
一、两组荷瘤鼠瘤重的比较
化疗组的抑瘤率为47.2%，KLT能有效地抑制肿瘤生长。
二、两组荷瘤鼠肿瘤细胞的PCNA表达及凋亡指数的比较
两组肿瘤细胞的PCNA(PI)表达及凋亡指数(AI)，见附表。LKT能抑制荷瘤鼠SGC-7901胃癌细胞的增殖及诱导该细胞的凋亡。
附表 各组小鼠瘤重及凋亡指数和增殖指数的比较 组 别
鼠数(只)
瘤重(克)
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AI(%)
PI(%)
荷瘤对照组
10
1.02±0.45
1.12±0.78
57±9
化 疗 组
10
0.47±0.14
2.11±0.45
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35±11
与荷瘤对照组比较P<0.05，P<0.01 光镜下观察发现，凋亡细胞散在分布于肿瘤组织中，细胞核特征性浓缩聚集于核膜周边成新月状或车轮状，可见凋亡小体。
讨 论
恶性肿瘤的成因与增殖失控，凋亡受阻有关[2]。细胞凋亡是当前肿瘤研究的热点之一。KLT是传统中药薏苡仁中提取天然有效活性物质，经药理学证实，对体内、体外多种癌细胞有杀伤作用。其作用机理是抑制肿瘤细胞增殖与阻滞G2+M期，减少S期细胞数目，减少癌细胞的有丝分裂有关。但尚未见KLT诱导胃癌细胞凋亡的报道。本研究用小鼠SGC-7901胃癌模型，观察体内KLT对SGC-7901胃癌细胞凋亡和增殖的影响。研究结果显示，对照组胃癌细胞PCNA阳性表达率57%，化疗组PCNA阳性表达率明显下降(38%)，表明KLT能抑制肿瘤细胞的增殖；在SGC-7901小鼠胃癌细胞皮下接种建立的荷瘤鼠模型中发现，小鼠SGC-7901移植瘤的凋亡指数为1.12%，而KLT组的凋亡指数是2.11%，表明KLT能诱导肿瘤细胞的凋亡。最终表现其抑瘤率达47.2%。
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以上结果提示：KLT抑制SGC-7901胃癌细胞生长是通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来实现的。其作用机理尚待进一步研究。
郑世营，男，博士，副主任医师，硕士生导师。
参考文献
[1]Cummings MC, Winterford CM, Walker NL. Apoptosis〔J〕. Am J Surg Pathol,1997,21:88
[2]Enoch T. Cell responses to DNA damage:cell cycle checkpoints apoptosis and the role of p53 and ATM〔J〕. TIBS,1995,20:426
(收稿日期：2000-08-15), 百拇医药
单位：郑世营 李德春 张志德 沈振亚 匡玉庭(苏州大学附属第一医院 苏州 215006)
关键词：胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的；细胞凋亡；细胞增殖；薏苡仁
肿瘤000624
中图分类号：R73-36，R735.2 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0460-02
细胞凋亡(Apoptosis)是由基因调控的主动的细胞死亡过程，与细胞增殖互补，共同维持机体的器官组织细胞数量的稳定。恶性肿瘤的发生和发展的过程，是细胞的过度增殖和细胞凋亡受到抑制的过程[1]。化疗诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤综合治疗中的重要手段。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，但目前有关化疗诱导胃癌细胞凋亡的研究极少。本研究用小鼠SGC-7901胃癌模型，研究体内薏苡仁提取物(康莱特，KLT)对SGC-7901胃癌细胞凋亡和增殖的影响，以评价KLT化疗的临床价值。
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材料与方法
一、动物模型 昆明种小鼠20只，25 g左右，由苏州大学医学院实验动物中心提供。在小鼠右腋皮下接种SGC-7901小鼠胃癌细胞2×106个/只(胃癌SGC-7901细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供)，随机分为两组，荷瘤对照组和化疗组，每组10只。
二、药物 KLT(10%)由浙江康莱特药业有限公司提供，规格100 ml/瓶，批号：0004061-2
三、主要试剂 ABC试剂盒，购自Vector公司。PCNA(PC10)，购自DAKO公司。TUNEL试剂盒，购自Boehringer Mannheim公司。
四、实验方法 1.动物实验部分 小鼠接种胃癌细胞后第2天开始给药。化疗组：KLT剂量10 μl/ml(12.5 ml/kg)，腹腔注射。荷瘤对照组：每只腹腔注射生理盐水0.2 ml/d。连续10天，第11天处死小鼠，取出瘤块，称瘤重，计算瘤重抑制率：
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并制作石蜡切片，供免疫组化用。
2.PCNA测定 切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，加PCNA(PC10)单抗，工作浓度1∶50，60 min后，4 ℃过夜，加二抗马抗鼠IgG，工作浓度1∶200， 60 min后，加ABC试剂，工作浓度1∶100，60 min后，DAB显色，苏木精对比染色，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。以PBS替代PCNA单抗，作阴性对照。细胞核有棕色颗粒，即为PCNA阳性细胞。每张切片选染色最强，最集中的10个高倍视野(×400)，共计数4000个肿瘤细胞中的阳性细胞数，得出阳性细胞百分数，为增殖细胞核抗原指数(PI)。
3.细胞凋亡的测定 采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP末端标记技术(TUNEL标记法)。切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，滴加0.05 %胰酶，消化30 min，滴加配制的含脱氧核苷酸末端转移酶和dUTP的反应混合液，置37 ℃湿盒，温育60 min，滴加连接过氧化物酶的抗荧光素抗体，37 ℃湿盒，60 min，DAB显色，见到棕黄色的阳性细胞后，终止反应，苏木精对比染色，二甲苯透明，树胶封固。选取切片中阳性染色最明显的区域，根据凋亡形态，或结合切片，同上计数凋亡细胞。得出阳性细胞百分数(AI)。
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五、统计学处理 采用SPSS软件，进行t检验。
结 果
一、两组荷瘤鼠瘤重的比较
化疗组的抑瘤率为47.2%，KLT能有效地抑制肿瘤生长。
二、两组荷瘤鼠肿瘤细胞的PCNA表达及凋亡指数的比较
两组肿瘤细胞的PCNA(PI)表达及凋亡指数(AI)，见附表。LKT能抑制荷瘤鼠SGC-7901胃癌细胞的增殖及诱导该细胞的凋亡。
附表 各组小鼠瘤重及凋亡指数和增殖指数的比较 组 别
鼠数(只)
瘤重(克)
, 百拇医药
AI(%)
PI(%)
荷瘤对照组
10
1.02±0.45
1.12±0.78
57±9
化 疗 组
10
0.47±0.14
2.11±0.45
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35±11
与荷瘤对照组比较P<0.05，P<0.01 光镜下观察发现，凋亡细胞散在分布于肿瘤组织中，细胞核特征性浓缩聚集于核膜周边成新月状或车轮状，可见凋亡小体。
讨 论
恶性肿瘤的成因与增殖失控，凋亡受阻有关[2]。细胞凋亡是当前肿瘤研究的热点之一。KLT是传统中药薏苡仁中提取天然有效活性物质，经药理学证实，对体内、体外多种癌细胞有杀伤作用。其作用机理是抑制肿瘤细胞增殖与阻滞G2+M期，减少S期细胞数目，减少癌细胞的有丝分裂有关。但尚未见KLT诱导胃癌细胞凋亡的报道。本研究用小鼠SGC-7901胃癌模型，观察体内KLT对SGC-7901胃癌细胞凋亡和增殖的影响。研究结果显示，对照组胃癌细胞PCNA阳性表达率57%，化疗组PCNA阳性表达率明显下降(38%)，表明KLT能抑制肿瘤细胞的增殖；在SGC-7901小鼠胃癌细胞皮下接种建立的荷瘤鼠模型中发现，小鼠SGC-7901移植瘤的凋亡指数为1.12%，而KLT组的凋亡指数是2.11%，表明KLT能诱导肿瘤细胞的凋亡。最终表现其抑瘤率达47.2%。
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以上结果提示：KLT抑制SGC-7901胃癌细胞生长是通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来实现的。其作用机理尚待进一步研究。
郑世营，男，博士，副主任医师，硕士生导师。
参考文献
[1]Cummings MC, Winterford CM, Walker NL. Apoptosis〔J〕. Am J Surg Pathol,1997,21:88
[2]Enoch T. Cell responses to DNA damage:cell cycle checkpoints apoptosis and the role of p53 and ATM〔J〕. TIBS,1995,20:426
(收稿日期：2000-08-15), 百拇医药