非小细胞肺癌组织中的人类疱疹病毒7型DNA
作者：吴一龙 李扬秋 杨学宁 王思愚
单位：吴一龙(中山医科大学肺癌研究中心 附属三院 广州 510630)；李扬秋(暨南大学血液病研究室)；杨学宁 王思愚(中山医科大学肿瘤医院)
关键词：肺肿瘤；癌，非小细胞肺；疱疹病毒，人，7型；多聚酶链反应
肿瘤000603
摘要：目的 了解肺癌组织中人类疱疹病毒7型(HHV-7)的感染情况。方法 利用巢式PCR分析50例肺癌和26例癌旁正常组织石腊切片中的HHV-7的DNA。结果 巢式PCR检出1例肺腺癌及其癌旁组织和1例肺鳞癌组织的HHV-7的DNA阳性带。结论 某些类型的肺癌组织石腊切片中存在HHV-7的DNA，阳性率为4%。
中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0401-03
, http://www.100md.com
HERPESVIRUS 7 DNA IN SPECIMENS FROM NON-SMALL-CELL LUNG CANCER
WU Yi-long LI Yang-qiu YANG Xue-ning
Lung Cancer Research Center,SUN Yat-sen University of Medical Sciences(Guangzhou 510630, China)
Abstract：Objective The infection of herpesvirus 7 (HHV-7) in tissue specimens from non-small-cell lung cancer was analyzed.Methods The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect HHV-7 from 50 cases of embedded lung cancer specimens.Results There were 1 case with adenocarcinoma and its paracarcinoma tissue and 1 case with squamous carcinoma were positive bands for HHV-7 by PCR.Conclusion There are HHV-7 DNA in paraffin embedded tissues of some types of NSCLC. The positive rate of HHV-7 in NSCLC was 4%.
, 百拇医药
Key words： Pulmonary neoplasms; Carcinoma,non-small cell lung; Herpesvirus ,human,type 7; Polymerase chain reaction
人类疱疹病毒7型(HHV-7)是1990年由Frenkel等从健康成人外周血的CD4+T细胞经有丝分裂原活化后分离出来的一种DNA病毒，是继HHV-6之后的又一种新型疱疹病毒[1]。研究结果表明，HHV-7是一种多嗜细胞性病毒，主要靶细胞为CD4+T细胞，它对机体的细胞免疫功能有一定影响。新近的研究发现，HHV-7与细胞增殖的相关因子如bcl-2、细胞周期素等有关，并可能与某些人类肿瘤的发生有一定关系[2～4]。本研究检测了50例不同病理类型的肺癌组织HHV-7的感染情况。
材料与方法
, 百拇医药
一、标本 50例手术切除的肺癌组织标本，按1999年WHO的肺癌病理学分型标准，其中鳞癌19例，腺癌15例，肺泡癌7例，鳞腺癌7例，大细胞癌1例，肺恶性神经鞘瘤1例，同时收集其中26例癌旁正常肺组织作为对照。
二、方法
1.肺癌组织DNA的提取
取5～10 μmol/L厚度的石蜡切片组织，经二甲苯脱蜡，蛋白酶K(终浓度为500 μg/ml)缓冲液消化(50℃)，加入酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液提取DNA后，用乙醇沉淀，最后溶解于20 μl的TE缓冲液中(10 mmol/L Tris-HCl,pH7.5；1 mmol/L EDTA)中，于-20 ℃保存备用。
2.多聚酶链反应(PCR)
从Berneman等所报道的HHV-7的DNA序列中设计引物2对(外侧引物和内侧引物)(GenBank:Accession L03525)[5]。引物的序列(如表1)所示，由德国柏林TIB公司合成。PCR按常规操作。第一次PCR总反应体积为25 μl，其中含0.5 μmol/L引物HHV-7-1/HHV-7-2;0.125 μmol/L的dNTP(dATP,dCTP,dGTP及dTTP)，2U Taq聚合酶及2 μl DNA样品。反应在PCR缓冲液(0.1 mmol/L Tris-HCl, pH8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.001%明胶)中进行。全部试剂为Perkin Elmer公司产品。于PCR扩增仪(Perkin Elmer)扩增DNA。条件为：92 ℃1 min (首次3 min)，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min(末次10 min)，共进行30次循环后于4 ℃保存。所得产物于2.5 %琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳分析结果。第2次PCR中，引物为HHV 7-3/HHV7-4，模板为第1次PCR产物(1 μl)，其它条件同上。反应中退火温度为58 ℃，余同上。全部试验设阳性对照和阴性对照。
, 百拇医药
表1 用于PCR扩增的HHV-7基因的引物序列 引物
作用
序列
位置
产物(bp)
HHV-7-1
out primer(sense)
5′-TATCCCAGCTGTTTTCATATAGTAAC
1-25 bp
186
HHV-7-2
, 百拇医药 out primer
(antisense)
5′-GCCTTGCGGTAGCACTAGATTTTTTTG
186-161 bp
HHV-7-3
inner primer
(sense)
5′-CATCCAGAAATGATAGACAG
44-63 bp
92
HHV-7-4
, 百拇医药
inner primer
(antisense)
5′-AGGAGAATTCTGTACCCATG
135-116 bp
结 果
经HHV-7-1/HHV-7-2一对引物扩增全长186 bp HHV-7 DNA片段，50 例肺癌和26例癌旁正常组织标本均未检测到阳性产物。经一对内侧引物(HHV-7-3/HHV-7-4)进行巢式PCR，1例肺腺癌及其癌旁正常组织标本均可检测到一92 bp大小的DNA片段，1例鳞癌同样可检测到HHV-7 DNA，而其癌旁组织则未检测到HHV-7 DNA(见表2)。
表2 肺癌和正常肺组织石蜡切片HHV-7巢式PCR检测 病理类型
, 百拇医药
例数
巢式PCR阳性数
鳞 癌
19
1
腺 癌
15
1
肺泡癌
7
0
鳞腺癌
7
0
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大细胞癌
1
0
恶性神经鞘瘤
1
0
正常肺组织
26
1
讨 论
HHV-7与其家族的另两个成员巨细胞病毒(CMV)和HHV-6十分相似，是一在健康人群中广泛传播的DNA病毒，国外研究报道，血清学检查发现75%～98%人群存在HHV-7抗体[6]。主要靶细胞是CD4+细胞，也影响机体的细胞免疫功能。有研究发现，HHV-7感染后，可以在机体的部分组织中持续潜伏，并发现肺、皮肤、肾和扁桃体等组织细胞表达HHV-7的结构抗原[7]。
, 百拇医药
近年，对HHV病毒与细胞增殖和细胞凋亡关系的研究提示：HHV-6和HHV-7均能诱导细胞因子GM-CFS产生，HHV-7感染细胞凋亡减少而使细胞持续增殖，HHV-7能编码细胞周期素蛋白，后者是细胞增殖的一个重要因子，提示病毒编码细胞周期素蛋白可能是诱导肿瘤形成的机制之一[8]。有关HHV病毒与肿瘤的关系在目前倍受重视，有报道在宫颈癌和鼻咽癌的组织石蜡切片中应用PCR方法检测到HHV-6 DNA[9]。本实验也利用巢式PCR方法发现非小细胞肺癌组织中存在HHV-6 DNA[10]。在HHV-7中，除了淋巴瘤和Kaposi's肉瘤外，未见报道与其它肿瘤的关系。本研究利用巢式PCR方法检测50例非小细胞肺癌和26例癌旁正常组织石蜡切片中HHV-7 DNA，结果首次PCR均未检测到阳性产物，经巢式PCR发现1例肺腺癌及其癌旁正常组织标本和1例鳞癌可检测到HHV-7 DNA，阳性率为4%。
有关肺癌HHV-7 DNA的检测，国内外均未有报道。本研究首次报道肺癌病人HHV-7感染的情况，提示肺癌病人HHV-7的感染率并不高(4%)，其临床意义有待进一步研究。
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吴一龙，男，大学本科教授，博士导师。
参考文献
[1]Frenkel N, Schirmer EC, Wyatt LS, et al. Isolation of a new herpesvirus from human CD4+ T cells〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87(2):748
[2]Secchiero P, Bertolaso L, Gibellinin D, et al. Enforced expression of human bcl-2 in CD4+ T cells enhances human herpesvirus 7 replication and induction of cytopathic effects〔J〕. Eur J Immunol,1998,28(5):1587
, 百拇医药
[3]Cannell E, Mittnacht S. Viral encoded cyclins〔J〕. Semin Cancer Biol,1990,9(3)：221
[4]Kashanchi F, Araujo J, Muralidhar S, et al. Human herpersvirus 6 (HHV-6) ORF-1 transactivating gene exhibits malignant transforming activity and its protein binds to p53〔J〕. Oncogene,1997,14(3):359
[5]Berneman ZN, Ablashi DV, Li G, et al. Human herpesvirus 7 is a T-lymphotropic virus and is related to, but significantly different from human herpesvirus 6 and human cytomegalovirus〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:10552
, 百拇医药
[6]Krueger GR, Koch B, Leyssens N, et al. Comparison of seroprevalences of human herpesvirus-6 and -7 in healthy blood donors from nine countries〔J〕. Vox Sang,1998,75(3):193
[7]Kempf W, Adams V, Mirandola P, et al. Persistence of human herpesvirus 7 in normal tissues detected by expression of a structureal antigen〔J〕. J Infect Dis, 1998,178(3):841
[8]Cannell E, Mittnacht S. Viral encoded cyclins〔J〕. Semin Cancer Biol,1999,9(3):221
[9]Chen M, Wang H, Woodworth CD, et al. Detection of human herpesvirus 6 and human papillomavirus 16 in cervical carcinoma〔J〕. Am J Pathol,1994,145(6):1509
[10]吴一龙，李扬秋，黄植蕃，等.利用巢式PCR检测肺癌组织的人类疱疹病毒6型〔J〕.中国肿瘤临床，1999，26(7)：540
(收稿日期：2000-07-17), 百拇医药
单位：吴一龙(中山医科大学肺癌研究中心 附属三院 广州 510630)；李扬秋(暨南大学血液病研究室)；杨学宁 王思愚(中山医科大学肿瘤医院)
关键词：肺肿瘤；癌，非小细胞肺；疱疹病毒，人，7型；多聚酶链反应
肿瘤000603
摘要：目的 了解肺癌组织中人类疱疹病毒7型(HHV-7)的感染情况。方法 利用巢式PCR分析50例肺癌和26例癌旁正常组织石腊切片中的HHV-7的DNA。结果 巢式PCR检出1例肺腺癌及其癌旁组织和1例肺鳞癌组织的HHV-7的DNA阳性带。结论 某些类型的肺癌组织石腊切片中存在HHV-7的DNA，阳性率为4%。
中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0401-03
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HERPESVIRUS 7 DNA IN SPECIMENS FROM NON-SMALL-CELL LUNG CANCER
WU Yi-long LI Yang-qiu YANG Xue-ning
Lung Cancer Research Center,SUN Yat-sen University of Medical Sciences(Guangzhou 510630, China)
Abstract：Objective The infection of herpesvirus 7 (HHV-7) in tissue specimens from non-small-cell lung cancer was analyzed.Methods The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect HHV-7 from 50 cases of embedded lung cancer specimens.Results There were 1 case with adenocarcinoma and its paracarcinoma tissue and 1 case with squamous carcinoma were positive bands for HHV-7 by PCR.Conclusion There are HHV-7 DNA in paraffin embedded tissues of some types of NSCLC. The positive rate of HHV-7 in NSCLC was 4%.
, 百拇医药
Key words： Pulmonary neoplasms; Carcinoma,non-small cell lung; Herpesvirus ,human,type 7; Polymerase chain reaction
人类疱疹病毒7型(HHV-7)是1990年由Frenkel等从健康成人外周血的CD4+T细胞经有丝分裂原活化后分离出来的一种DNA病毒，是继HHV-6之后的又一种新型疱疹病毒[1]。研究结果表明，HHV-7是一种多嗜细胞性病毒，主要靶细胞为CD4+T细胞，它对机体的细胞免疫功能有一定影响。新近的研究发现，HHV-7与细胞增殖的相关因子如bcl-2、细胞周期素等有关，并可能与某些人类肿瘤的发生有一定关系[2～4]。本研究检测了50例不同病理类型的肺癌组织HHV-7的感染情况。
材料与方法
, 百拇医药
一、标本 50例手术切除的肺癌组织标本，按1999年WHO的肺癌病理学分型标准，其中鳞癌19例，腺癌15例，肺泡癌7例，鳞腺癌7例，大细胞癌1例，肺恶性神经鞘瘤1例，同时收集其中26例癌旁正常肺组织作为对照。
二、方法
1.肺癌组织DNA的提取
取5～10 μmol/L厚度的石蜡切片组织，经二甲苯脱蜡，蛋白酶K(终浓度为500 μg/ml)缓冲液消化(50℃)，加入酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液提取DNA后，用乙醇沉淀，最后溶解于20 μl的TE缓冲液中(10 mmol/L Tris-HCl,pH7.5；1 mmol/L EDTA)中，于-20 ℃保存备用。
2.多聚酶链反应(PCR)
从Berneman等所报道的HHV-7的DNA序列中设计引物2对(外侧引物和内侧引物)(GenBank:Accession L03525)[5]。引物的序列(如表1)所示，由德国柏林TIB公司合成。PCR按常规操作。第一次PCR总反应体积为25 μl，其中含0.5 μmol/L引物HHV-7-1/HHV-7-2;0.125 μmol/L的dNTP(dATP,dCTP,dGTP及dTTP)，2U Taq聚合酶及2 μl DNA样品。反应在PCR缓冲液(0.1 mmol/L Tris-HCl, pH8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.001%明胶)中进行。全部试剂为Perkin Elmer公司产品。于PCR扩增仪(Perkin Elmer)扩增DNA。条件为：92 ℃1 min (首次3 min)，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min(末次10 min)，共进行30次循环后于4 ℃保存。所得产物于2.5 %琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳分析结果。第2次PCR中，引物为HHV 7-3/HHV7-4，模板为第1次PCR产物(1 μl)，其它条件同上。反应中退火温度为58 ℃，余同上。全部试验设阳性对照和阴性对照。
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表1 用于PCR扩增的HHV-7基因的引物序列 引物
作用
序列
位置
产物(bp)
HHV-7-1
out primer(sense)
5′-TATCCCAGCTGTTTTCATATAGTAAC
1-25 bp
186
HHV-7-2
, 百拇医药 out primer
(antisense)
5′-GCCTTGCGGTAGCACTAGATTTTTTTG
186-161 bp
HHV-7-3
inner primer
(sense)
5′-CATCCAGAAATGATAGACAG
44-63 bp
92
HHV-7-4
, 百拇医药
inner primer
(antisense)
5′-AGGAGAATTCTGTACCCATG
135-116 bp
结 果
经HHV-7-1/HHV-7-2一对引物扩增全长186 bp HHV-7 DNA片段，50 例肺癌和26例癌旁正常组织标本均未检测到阳性产物。经一对内侧引物(HHV-7-3/HHV-7-4)进行巢式PCR，1例肺腺癌及其癌旁正常组织标本均可检测到一92 bp大小的DNA片段，1例鳞癌同样可检测到HHV-7 DNA，而其癌旁组织则未检测到HHV-7 DNA(见表2)。
表2 肺癌和正常肺组织石蜡切片HHV-7巢式PCR检测 病理类型
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例数
巢式PCR阳性数
鳞 癌
19
1
腺 癌
15
1
肺泡癌
7
0
鳞腺癌
7
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大细胞癌
1
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恶性神经鞘瘤
1
0
正常肺组织
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1
讨 论
HHV-7与其家族的另两个成员巨细胞病毒(CMV)和HHV-6十分相似，是一在健康人群中广泛传播的DNA病毒，国外研究报道，血清学检查发现75%～98%人群存在HHV-7抗体[6]。主要靶细胞是CD4+细胞，也影响机体的细胞免疫功能。有研究发现，HHV-7感染后，可以在机体的部分组织中持续潜伏，并发现肺、皮肤、肾和扁桃体等组织细胞表达HHV-7的结构抗原[7]。
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近年，对HHV病毒与细胞增殖和细胞凋亡关系的研究提示：HHV-6和HHV-7均能诱导细胞因子GM-CFS产生，HHV-7感染细胞凋亡减少而使细胞持续增殖，HHV-7能编码细胞周期素蛋白，后者是细胞增殖的一个重要因子，提示病毒编码细胞周期素蛋白可能是诱导肿瘤形成的机制之一[8]。有关HHV病毒与肿瘤的关系在目前倍受重视，有报道在宫颈癌和鼻咽癌的组织石蜡切片中应用PCR方法检测到HHV-6 DNA[9]。本实验也利用巢式PCR方法发现非小细胞肺癌组织中存在HHV-6 DNA[10]。在HHV-7中，除了淋巴瘤和Kaposi's肉瘤外，未见报道与其它肿瘤的关系。本研究利用巢式PCR方法检测50例非小细胞肺癌和26例癌旁正常组织石蜡切片中HHV-7 DNA，结果首次PCR均未检测到阳性产物，经巢式PCR发现1例肺腺癌及其癌旁正常组织标本和1例鳞癌可检测到HHV-7 DNA，阳性率为4%。
有关肺癌HHV-7 DNA的检测，国内外均未有报道。本研究首次报道肺癌病人HHV-7感染的情况，提示肺癌病人HHV-7的感染率并不高(4%)，其临床意义有待进一步研究。
, http://www.100md.com
吴一龙，男，大学本科教授，博士导师。
参考文献
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[5]Berneman ZN, Ablashi DV, Li G, et al. Human herpesvirus 7 is a T-lymphotropic virus and is related to, but significantly different from human herpesvirus 6 and human cytomegalovirus〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:10552
, 百拇医药
[6]Krueger GR, Koch B, Leyssens N, et al. Comparison of seroprevalences of human herpesvirus-6 and -7 in healthy blood donors from nine countries〔J〕. Vox Sang,1998,75(3):193
[7]Kempf W, Adams V, Mirandola P, et al. Persistence of human herpesvirus 7 in normal tissues detected by expression of a structureal antigen〔J〕. J Infect Dis, 1998,178(3):841
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[10]吴一龙，李扬秋，黄植蕃，等.利用巢式PCR检测肺癌组织的人类疱疹病毒6型〔J〕.中国肿瘤临床，1999，26(7)：540
(收稿日期：2000-07-17), 百拇医药