川芎嗪注射液对脑缺血-再灌注损伤家兔血清白细胞介素-8的影响
作者：王万铁 徐正衸 陈寿权 林丽娜 王卫 李东 王宗敏
单位：王万铁 徐正衸 王卫 李东(温州医学院，浙江 温州 325027)；陈寿权 林丽娜(温州医学院附属第一医院)
关键词：川芎嗪注射液；再灌注损伤；脑；白细胞介素-8
中国中西医结合急救杂志000617 摘要：目的：观察川芎嗪注射液(TMRI)对脑缺血-再灌注损伤(CIRI)家兔血清白细胞介素-8(IL-8)的合成和释放的影响，并探讨其脑保护机制。方法：制备家兔CIRI模型，随机分为假手术对照组、缺血-再灌注组和TMRI组，分别在缺血前、缺血30分钟、再灌注30、60、120分钟取静脉血，测定血清IL-8浓度，实验结束取脑皮质HE染色，光镜观察脑组织病理学改变。结果：缺血-再灌注组在脑缺血-再灌注期间不同时间点血清IL-8水平随脑缺血-再灌注时间延长呈进行性升高，分别为缺血前的1.38、1.62、1.93和2.29倍，明显高于假手术组，光镜下白细胞大量浸润、神经元明显损伤：TMRI组不同时间点血清IL-8浓度显著低于缺血-再灌注组，光镜下白细胞浸润、神经元损伤程度较缺血-再灌注组明显减轻，而与假手术组比较均无显著性差异。结论：TMRI能有效抑制IL-8的合成和释放，这可能是它减轻CIRI的又一重要机制。
, http://www.100md.com
中图分类号：R285.5;R363.2 文献标识码：A
文章编号：1008-9691(2000)06-0359-03
Effect of tetramethylpyrazine injection on serum interleukin-8 in rabbits following cerebral ischemia-reperfusion injury
WANG Wan-tie,XU Zheng-jie
(Wenzhou Medical College,Wenzhou Zhejiang 325027)
CHEN Shou-quan,et al
Abstract:Objective:To observe the effect of tetramethylpyrazine injection (TMRI) on the synthesis and release of serum interleukin-8(IL-8) in rabbits following cerebral ischemia-reperfusion injury (CIRI),and to explore its mechanism.Methods:CIRI models of rabbits (n=26) were randomly divided into three groups:control group (group A),ischemia-reperfusion group (group B) and TMRI group (group C).The serum concentrations of IL-8 in vein blood at different time points (before ischemia),30 minutes after ischemia,30,60 and 120 minutes following reperfusion were measured respectively.By the end of experiments using HE stain the pathological changes in cerebral tissues were observed by microscope.Results:During cerebral ischemia-reperfusion all of the levels of serum IL-8 at different time points in group B were significantly higher than those in group A and as the prolongation of ischemia-reperfusion duration they were progressively increased even reached 1.38,1.62，1.93,and 2.29 times respectively compared with before ischemia.Under microscope large amount of leukocyte infiltration and obvious neutron damage were seen.At different time points the serum concentrations of IL-8 in group C were significantly lower than those in group B.Under microscope the extents of leukocyte infiltration and neutron damage in group B were markedly reduced but there were not significantly differents in comparison with group A. Conclusions:TMRI is able to inhibit the synthesis and release of IL-8 effectively.This may be another important mechanism to reduce CIRI.
, 百拇医药
Key words:tetramethylpyrazine injection;cerebral ischemia-reperfusion injury;interleukin-8
急性脑缺血再灌注损伤(CIRI)是临床上常见且预后较差的一种疾病，如何防治CIRI、促进中枢神经系统功能恢复一直是急救和重症医学研究的重点之一。再灌注损伤的发生是多种因素促成的，Onodera等[1]报道炎症细胞因子的释放及白细胞的浸润在其中起重要作用。白细胞介素8(IL8)是一种促进白细胞激活的细胞因子，它与CIRI有密切的联系[2]。我们先前的研究证实，川芎嗪注射液(TMRI)可通过提高一氧化氮浓度、减少内皮素含量及降低氧自由基(OFR)水平而减轻CIRI[3]，但关于它对IL8的产生和释放有何影响，国内外未见报道。本实验拟观察TMRI对CIRI家兔血清IL8的影响，以探讨其脑保护作用的机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 模型建立：健康家兔26只，雌雄兼有，体重2.2～3.0 kg，氨基甲酸乙酯1.0 g/kg静脉麻醉，分离一侧颈外静脉以备采血及注射药物；分离双侧椎动脉和颈总动脉。然后同时结扎双侧椎动脉及夹闭双侧颈总动脉，造成脑完全性缺血，30分钟后打开动脉夹重新灌注120分钟形成CIRI[4]。
1.2 动物分组：随机将家兔分为3组：假手术对照组，8只，仅进行手术损伤而不阻断血流；缺血再灌注组，10只，缺血前20分钟及再灌注即刻分别静滴生理盐水(NS)1.0 ml/kg；TMRI组，8只，将NS改为TMRI(无锡市第七制药厂生产，批号9610051)40 mg*2 ml*kg-1，分别于以上相同时点静滴。
1.3 标本采集：3组动物分别在脑缺血前、缺血30分钟、再灌注30、60、120分钟不同时间点，自颈外静脉取血以测定IL8浓度，并在再灌注120分钟取皮层脑组织以备光镜观察。
, 百拇医药
1.4 检测方法：放射免疫法检测IL8浓度，试剂盒购自北京华英放射免疫技术研究所，测定操作完全按照试剂盒说明书。HE染色，光镜观察白细胞浸润和神经元损伤程度。
1.5 统计学方法：所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，采用组内、组间t检验。
2 结 果
2.1 3组家兔CIRI时血清IL8浓度的变化，见表1。经t检验证实，缺血前3组家兔血清IL8浓度无统计学差异。缺血再灌注组IL8在缺血再灌注期间，进行性升高，尤以再灌注120分钟为著(P<0.05或P<0.01)；TMRI组IL8仅轻度增高(P>0.05)，与缺血再灌注组相应时值比较均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且与假手术对照组相应时值相比，差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
2.2 脑组织病理学结果：光镜下观察假手术对照组兔脑皮质细胞未见水肿，神经细胞结构基本正常；缺血再灌注组脑皮质水肿、淤血明显，甚至出血，神经核变性，核固缩多见，有较多白细胞浸润灶和血管套形成；TMRI组脑皮质轻度水肿、淤血，神经元核固缩较少，未见白细胞聚集、浸润。
3 讨 论
IL8是一种由中性粒细胞、单核细胞、多形核白细胞及内皮细胞等多种细胞在缺血、缺氧、IL1、内毒素(LPS)、内皮素1(ET1)和肿瘤坏死因子(TNF)等诱导作用下合成与释放的多源性细胞因子[4，5]，对炎性细胞具有趋化作用。Yamasaki等发现IL8能促进白细胞浸润、聚集、细胞粘附和产生大量自由基并促进脂质过氧化和细胞因子的释放失调[6]，Muksaida等[7]报道应用IL8单克隆抗体或阻断IL8释放可明显减轻炎性反应，阻止白细胞浸润和减轻CIRI，这些研究可表明IL8在CIRI中起着重要作用。由于血清和脑脊液中IL8产生早于脑水肿形成和白细胞浸润[7]，因此检测IL8水平，不仅可了解上述病理变化，而且能预告CIRI程度。
, 百拇医药
本研究结果显示，缺血再灌注组家兔血清IL8随脑缺血再灌注时间的延长呈进行性升高(分别为缺血前的1.38、1.62、1.93和2.29倍)，显著高于假手术对照组相同时值；TMRI组IL8值则无明显变化，且明显低于缺血再灌注组相同时值。表明脑缺血再灌注时IL8水平升高，川芎嗪注射液可抑制IL8的合成和释放。光镜观察显示，缺血再灌注组可见白细胞浸润灶和血管套形成，反映大量白细胞激活和细胞粘附；TMRI组无明显白细胞浸润、聚集和血管套形成，提示白细胞无明显激活。鉴于IL8是缺血、缺氧、白细胞激活等多种因素作用的产物，TMRI组白细胞激活现象明显减弱，与IL8无明显增高二者相互印证，互为因果。另外，我们以往实验已证实[3]，家兔脑缺血再灌注期间体内OFR水平明显升高，TMRI可降低OFR水平。而OFR可直接诱导IL8转录、复制，加速IL8合成和释放[8]，又因IL8本身能耐受肽酶的降解，使其不断聚积增加，并促进OFR产生，进而加重炎
表1 3组家兔CIRI不同时间点血清IL8浓度的变化(±s)ng/L 组别
, http://www.100md.com
动物数(只)
缺血前
缺血30分钟
再灌注30分钟
再灌注60分钟
再灌注120分钟
假手术对照组
8
0.46±0.06
0.43±0.08
0.45±0.09
0.47±0.06
, 百拇医药
0.44±0.07
缺血再灌注组
10
0.45±0.07
0.62±0.18*▲
0.73±0.19**▲▲
0.87±0.29**△▲▲
1.03±0.43**△▲▲
TMRI组
8
, http://www.100md.com 0.44±0.06
0.47±0.09#
0.48±0.08##
0.54±0.14##
0.57±0.22#
注：与本组缺血前比较:P<0.05，P<0.01；与本组缺血30分钟比较：△P<0.05；与假手术对照组相应时值比较：▲P<0.05，▲▲ P<0.01；与缺血再灌注组相应时值比较：＃P<0.05，＃＃P<0.01症反应和促进IL8等细胞因子释放[9]，形成恶性循环和放大效应[10]。缺血再灌注组细胞损伤严重，而TMRI组核固缩的细胞较少，这种不同的组织病理学改变或许是缺血再灌注与TMRI两组IL8和OFR差异所致的又一佐证。从上述IL8与白细胞激活、IL8与OFR关系以及病理改变3方面来看，TMRI除拮抗OFR外，还能有效抑制IL8的合成和释放，从而阻断IL8与炎症反应及OFR之间的恶性循环及连锁反应。可见，抑制IL8合成和释放可能是TMRI减轻TMRI的又一重要机制。
, 百拇医药
(致谢：温州医学院附属第一医院急诊科李惠萍、黄唯佳、程俊彦、赵初环等医师)
基金项目：浙江省跨世纪学术和技术带头人培养基金资助项目(No.992086)
作者简介：王万铁(1963-)，男( 汉族)，浙江省温州市人，副教授，硕士研究生导师。主要从事脏器缺血再灌注损伤机制及其防治的研究，完成课题10余项，多次获省、市科技进步奖，发表学术论文60余篇。
参考文献：
[1]Onodera H,Yamasaki Y,Matsuo Y,et al.Ischemia and neurommunology injury.Nippon Rinsho,1994,52:2995-2999.
[2]曹学兵，孙圣刚，黄怀钧，等.CINC/IL-8与缺血再灌注损伤.国外医学神经病学神经外科分册，1999，26(3)：155-157.
, http://www.100md.com
[3]王万铁，陈寿权，王卫，等.醒脑静注射液抗脑缺血再灌注损伤作用的实验研究.中国急救医学，1999，19(12)：701-703.
[4]Metinko A P,Kunkel S L,Standiford T J,et al.Anoxia-hyperoxia induces monocyte-derived interleukin-8.J Clin Invest,1992,90:791-798.
[5]Hofman F M,Chen P,Jeyaseelan R,et al.Endothelin1 induces production of the neutrophil cells.Blood,1998,92:3064-3072.
[6]Yamasaki Y,Itoyama Y,Kogure K,et al.Involvment of cytokine production in pathogenesis of transient cerebral ischemic damage.Keio J Med,1996,45:225-229.
, 百拇医药
[7]Muksaida N,Matsumoto T,Yokoi K,et al.Inhibition of neutrophyil-mediated acute inflammation injury by antibody against interleukin-8(IL-8).Inflamm Res,1998,47(Suppl 3):S151-157.
[8]Deforge L E,Fantone J C,Kenney J S,et al.Oxygen radical scavengers selectively inhibit interleukin-8 production in human whole blood.J Clin Invest,1992,90:2123-2129.
[9]Helen F,Anne M,Nigel R,et al.The effect of midazolam and propofol on interleukin8 from human polymorphonuclear leukocytes.Anesth Analg,1998,86:1289-1293.
[10]Suzuki s,Konno H,Nakamura S,et al.Role of cytokines in hepatic ischemia and reperfusion injury.Nippon Geka Gakkai Zasshi,1999,100:325-330.
(收稿日期：2000-05-05), 百拇医药
单位：王万铁 徐正衸 王卫 李东(温州医学院，浙江 温州 325027)；陈寿权 林丽娜(温州医学院附属第一医院)
关键词：川芎嗪注射液；再灌注损伤；脑；白细胞介素-8
中国中西医结合急救杂志000617 摘要：目的：观察川芎嗪注射液(TMRI)对脑缺血-再灌注损伤(CIRI)家兔血清白细胞介素-8(IL-8)的合成和释放的影响，并探讨其脑保护机制。方法：制备家兔CIRI模型，随机分为假手术对照组、缺血-再灌注组和TMRI组，分别在缺血前、缺血30分钟、再灌注30、60、120分钟取静脉血，测定血清IL-8浓度，实验结束取脑皮质HE染色，光镜观察脑组织病理学改变。结果：缺血-再灌注组在脑缺血-再灌注期间不同时间点血清IL-8水平随脑缺血-再灌注时间延长呈进行性升高，分别为缺血前的1.38、1.62、1.93和2.29倍，明显高于假手术组，光镜下白细胞大量浸润、神经元明显损伤：TMRI组不同时间点血清IL-8浓度显著低于缺血-再灌注组，光镜下白细胞浸润、神经元损伤程度较缺血-再灌注组明显减轻，而与假手术组比较均无显著性差异。结论：TMRI能有效抑制IL-8的合成和释放，这可能是它减轻CIRI的又一重要机制。
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中图分类号：R285.5;R363.2 文献标识码：A
文章编号：1008-9691(2000)06-0359-03
Effect of tetramethylpyrazine injection on serum interleukin-8 in rabbits following cerebral ischemia-reperfusion injury
WANG Wan-tie,XU Zheng-jie
(Wenzhou Medical College,Wenzhou Zhejiang 325027)
CHEN Shou-quan,et al
Abstract:Objective:To observe the effect of tetramethylpyrazine injection (TMRI) on the synthesis and release of serum interleukin-8(IL-8) in rabbits following cerebral ischemia-reperfusion injury (CIRI),and to explore its mechanism.Methods:CIRI models of rabbits (n=26) were randomly divided into three groups:control group (group A),ischemia-reperfusion group (group B) and TMRI group (group C).The serum concentrations of IL-8 in vein blood at different time points (before ischemia),30 minutes after ischemia,30,60 and 120 minutes following reperfusion were measured respectively.By the end of experiments using HE stain the pathological changes in cerebral tissues were observed by microscope.Results:During cerebral ischemia-reperfusion all of the levels of serum IL-8 at different time points in group B were significantly higher than those in group A and as the prolongation of ischemia-reperfusion duration they were progressively increased even reached 1.38,1.62，1.93,and 2.29 times respectively compared with before ischemia.Under microscope large amount of leukocyte infiltration and obvious neutron damage were seen.At different time points the serum concentrations of IL-8 in group C were significantly lower than those in group B.Under microscope the extents of leukocyte infiltration and neutron damage in group B were markedly reduced but there were not significantly differents in comparison with group A. Conclusions:TMRI is able to inhibit the synthesis and release of IL-8 effectively.This may be another important mechanism to reduce CIRI.
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Key words:tetramethylpyrazine injection;cerebral ischemia-reperfusion injury;interleukin-8
急性脑缺血再灌注损伤(CIRI)是临床上常见且预后较差的一种疾病，如何防治CIRI、促进中枢神经系统功能恢复一直是急救和重症医学研究的重点之一。再灌注损伤的发生是多种因素促成的，Onodera等[1]报道炎症细胞因子的释放及白细胞的浸润在其中起重要作用。白细胞介素8(IL8)是一种促进白细胞激活的细胞因子，它与CIRI有密切的联系[2]。我们先前的研究证实，川芎嗪注射液(TMRI)可通过提高一氧化氮浓度、减少内皮素含量及降低氧自由基(OFR)水平而减轻CIRI[3]，但关于它对IL8的产生和释放有何影响，国内外未见报道。本实验拟观察TMRI对CIRI家兔血清IL8的影响，以探讨其脑保护作用的机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 模型建立：健康家兔26只，雌雄兼有，体重2.2～3.0 kg，氨基甲酸乙酯1.0 g/kg静脉麻醉，分离一侧颈外静脉以备采血及注射药物；分离双侧椎动脉和颈总动脉。然后同时结扎双侧椎动脉及夹闭双侧颈总动脉，造成脑完全性缺血，30分钟后打开动脉夹重新灌注120分钟形成CIRI[4]。
1.2 动物分组：随机将家兔分为3组：假手术对照组，8只，仅进行手术损伤而不阻断血流；缺血再灌注组，10只，缺血前20分钟及再灌注即刻分别静滴生理盐水(NS)1.0 ml/kg；TMRI组，8只，将NS改为TMRI(无锡市第七制药厂生产，批号9610051)40 mg*2 ml*kg-1，分别于以上相同时点静滴。
1.3 标本采集：3组动物分别在脑缺血前、缺血30分钟、再灌注30、60、120分钟不同时间点，自颈外静脉取血以测定IL8浓度，并在再灌注120分钟取皮层脑组织以备光镜观察。
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1.4 检测方法：放射免疫法检测IL8浓度，试剂盒购自北京华英放射免疫技术研究所，测定操作完全按照试剂盒说明书。HE染色，光镜观察白细胞浸润和神经元损伤程度。
1.5 统计学方法：所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，采用组内、组间t检验。2 结 果
2.1 3组家兔CIRI时血清IL8浓度的变化，见表1。经t检验证实，缺血前3组家兔血清IL8浓度无统计学差异。缺血再灌注组IL8在缺血再灌注期间，进行性升高，尤以再灌注120分钟为著(P<0.05或P<0.01)；TMRI组IL8仅轻度增高(P>0.05)，与缺血再灌注组相应时值比较均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且与假手术对照组相应时值相比，差异无显著性(P>0.05)。
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2.2 脑组织病理学结果：光镜下观察假手术对照组兔脑皮质细胞未见水肿，神经细胞结构基本正常；缺血再灌注组脑皮质水肿、淤血明显，甚至出血，神经核变性，核固缩多见，有较多白细胞浸润灶和血管套形成；TMRI组脑皮质轻度水肿、淤血，神经元核固缩较少，未见白细胞聚集、浸润。
3 讨 论
IL8是一种由中性粒细胞、单核细胞、多形核白细胞及内皮细胞等多种细胞在缺血、缺氧、IL1、内毒素(LPS)、内皮素1(ET1)和肿瘤坏死因子(TNF)等诱导作用下合成与释放的多源性细胞因子[4，5]，对炎性细胞具有趋化作用。Yamasaki等发现IL8能促进白细胞浸润、聚集、细胞粘附和产生大量自由基并促进脂质过氧化和细胞因子的释放失调[6]，Muksaida等[7]报道应用IL8单克隆抗体或阻断IL8释放可明显减轻炎性反应，阻止白细胞浸润和减轻CIRI，这些研究可表明IL8在CIRI中起着重要作用。由于血清和脑脊液中IL8产生早于脑水肿形成和白细胞浸润[7]，因此检测IL8水平，不仅可了解上述病理变化，而且能预告CIRI程度。
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本研究结果显示，缺血再灌注组家兔血清IL8随脑缺血再灌注时间的延长呈进行性升高(分别为缺血前的1.38、1.62、1.93和2.29倍)，显著高于假手术对照组相同时值；TMRI组IL8值则无明显变化，且明显低于缺血再灌注组相同时值。表明脑缺血再灌注时IL8水平升高，川芎嗪注射液可抑制IL8的合成和释放。光镜观察显示，缺血再灌注组可见白细胞浸润灶和血管套形成，反映大量白细胞激活和细胞粘附；TMRI组无明显白细胞浸润、聚集和血管套形成，提示白细胞无明显激活。鉴于IL8是缺血、缺氧、白细胞激活等多种因素作用的产物，TMRI组白细胞激活现象明显减弱，与IL8无明显增高二者相互印证，互为因果。另外，我们以往实验已证实[3]，家兔脑缺血再灌注期间体内OFR水平明显升高，TMRI可降低OFR水平。而OFR可直接诱导IL8转录、复制，加速IL8合成和释放[8]，又因IL8本身能耐受肽酶的降解，使其不断聚积增加，并促进OFR产生，进而加重炎
表1 3组家兔CIRI不同时间点血清IL8浓度的变化(
±s)ng/L 组别, http://www.100md.com
动物数(只)
缺血前
缺血30分钟
再灌注30分钟
再灌注60分钟
再灌注120分钟
假手术对照组
8
0.46±0.06
0.43±0.08
0.45±0.09
0.47±0.06
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0.44±0.07
缺血再灌注组
10
0.45±0.07
0.62±0.18*▲
0.73±0.19**▲▲
0.87±0.29**△▲▲
1.03±0.43**△▲▲
TMRI组
8
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0.47±0.09#
0.48±0.08##
0.54±0.14##
0.57±0.22#
注：与本组缺血前比较:P<0.05，P<0.01；与本组缺血30分钟比较：△P<0.05；与假手术对照组相应时值比较：▲P<0.05，▲▲ P<0.01；与缺血再灌注组相应时值比较：＃P<0.05，＃＃P<0.01症反应和促进IL8等细胞因子释放[9]，形成恶性循环和放大效应[10]。缺血再灌注组细胞损伤严重，而TMRI组核固缩的细胞较少，这种不同的组织病理学改变或许是缺血再灌注与TMRI两组IL8和OFR差异所致的又一佐证。从上述IL8与白细胞激活、IL8与OFR关系以及病理改变3方面来看，TMRI除拮抗OFR外，还能有效抑制IL8的合成和释放，从而阻断IL8与炎症反应及OFR之间的恶性循环及连锁反应。可见，抑制IL8合成和释放可能是TMRI减轻TMRI的又一重要机制。
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(致谢：温州医学院附属第一医院急诊科李惠萍、黄唯佳、程俊彦、赵初环等医师)
基金项目：浙江省跨世纪学术和技术带头人培养基金资助项目(No.992086)
作者简介：王万铁(1963-)，男( 汉族)，浙江省温州市人，副教授，硕士研究生导师。主要从事脏器缺血再灌注损伤机制及其防治的研究，完成课题10余项，多次获省、市科技进步奖，发表学术论文60余篇。
参考文献：
[1]Onodera H,Yamasaki Y,Matsuo Y,et al.Ischemia and neurommunology injury.Nippon Rinsho,1994,52:2995-2999.
[2]曹学兵，孙圣刚，黄怀钧，等.CINC/IL-8与缺血再灌注损伤.国外医学神经病学神经外科分册，1999，26(3)：155-157.
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[3]王万铁，陈寿权，王卫，等.醒脑静注射液抗脑缺血再灌注损伤作用的实验研究.中国急救医学，1999，19(12)：701-703.
[4]Metinko A P,Kunkel S L,Standiford T J,et al.Anoxia-hyperoxia induces monocyte-derived interleukin-8.J Clin Invest,1992,90:791-798.
[5]Hofman F M,Chen P,Jeyaseelan R,et al.Endothelin1 induces production of the neutrophil cells.Blood,1998,92:3064-3072.
[6]Yamasaki Y,Itoyama Y,Kogure K,et al.Involvment of cytokine production in pathogenesis of transient cerebral ischemic damage.Keio J Med,1996,45:225-229.
, 百拇医药
[7]Muksaida N,Matsumoto T,Yokoi K,et al.Inhibition of neutrophyil-mediated acute inflammation injury by antibody against interleukin-8(IL-8).Inflamm Res,1998,47(Suppl 3):S151-157.
[8]Deforge L E,Fantone J C,Kenney J S,et al.Oxygen radical scavengers selectively inhibit interleukin-8 production in human whole blood.J Clin Invest,1992,90:2123-2129.
[9]Helen F,Anne M,Nigel R,et al.The effect of midazolam and propofol on interleukin8 from human polymorphonuclear leukocytes.Anesth Analg,1998,86:1289-1293.
[10]Suzuki s,Konno H,Nakamura S,et al.Role of cytokines in hepatic ischemia and reperfusion injury.Nippon Geka Gakkai Zasshi,1999,100:325-330.
(收稿日期：2000-05-05), 百拇医药