西比灵对大鼠急性脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究
作者：刘松岩 韩雪梅 刘松柏
单位：刘松岩 韩雪梅(白求恩医科大学三院神经内科，吉林 长春 130021)；刘松柏(吉林油田矿医院内科)
关键词：脑缺血再灌注；过氧化脂质；超氧化物歧化酶；西比灵
中国急救医学000604 [摘 要] 目的 进一步探讨西比灵对急性脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法 采用Pulsinelli四血管闭塞法制备大鼠急性脑缺血再灌注模型，利用Tsuchida的WSPS法测定LPO，利用化学发光法测定SOD活性，同时观察了脑组织水含量及病理变化，并观察西比灵对上述指标影响。结果 ①脑缺血后脑组织水含量升高，再灌注后升高更明显，西比灵能明显降低脑缺血再灌注期间脑水含量。②西比灵降低LPO含量，稳定SOD活性。③图像分析显示西比灵可增加再灌注后神经元面数密度。结论 西比灵不但可防止Ca2+过量跨膜进入细胞内，还具有抑制血由基生成的作用，减轻脑水肿，减轻脑组织的病理损害，从而在脑缺血再灌注期间达到脑保护作用。
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[中图分类号] R 97；R 969.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)06-0327-03
Experimental research of protective effect of Sibelium on acute cerebral ischemia reperfusion injury of rats
LIU Song-yan,HAN Xue-mei
(Department of Neurology, the Third Clinical College, Normen Bethune University of Medical Science,Changchun 130021, China)
LIU Song-bai
, 百拇医药
[Abstract] Objective Probing into the mechanism of Sibelium protective effect on brain tissue in acute cerebral ischemia reperfusion.Methods The model is prepared rat acute cerebral ischemia reperfusion by Pulsinelli's 4VO method,to assay LPO using Tsuchida's WSPS method,to assay SOD activity by chemiluminescence's method,meanwhile observe the water content of brain tessue and pathology change,and observe Sibelium's influence on above index.Results Sibelium can decrease LPO content,stabilize SOD activity,decrease the water content of brain tissue during reperfusion.The image analysis shows Sibelium can increase the neuron density.Conclusions Sibelium can inhibit free radical production during cerebral ischemia reperfusion.Thereby can protect brain tissue.
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[Key words] Cerebral ischemia reperfusion； LPO； SOD； Sibelium▲
脑血管病是严重危害人类生命安全的三大疾病之一，其中缺血性脑血管病占大多数。长时间的脑缺血后再灌注期间组织发生复杂的继发性改变，加重组织损伤[1，2]。目前认为与能量代谢障碍、微循环障碍、自由基损伤、细胞内钙超载以及兴奋性氨基酸类神经递质异常有关[2]。细胞内钙超载被认为是脑缺血再灌注损伤的重要环节。西比灵作为第四代钙离子拮抗剂己普遍应用于临床并得到肯定性证实[3]，但在脑缺血再灌注损伤中是否存在其他保护作用尚未见报导。本文通过观察西比灵对LPO、SOD活性的影响，进一步探讨其在脑缺血再灌注期间抑制自由基生成作用，为开发其在缺血性脑血管病治疗上进一步应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作及分组 由白求恩医科大学实验动物部提供的健康雄性Wistar大鼠32只，随机分成4组，每组8只，分别为假手术组、单纯缺血30分钟组、单纯缺血30分钟再灌注60分钟组、西比灵治疗组。手术采用Pulsinelli的4VO方法，届时断头处死，冰盘中分离出海马置液氮中冷冻保存待测。
, 百拇医药
1.2 仪器与药品 由长沙生化制药厂提供SOD标准品，活力为4 000 U/mg。由LKB公司提供Luminol。西比灵为西安杨森制药有限公司产品。其余药品均为国产分析纯。F-3000荧光分光光度计(日本)，LKB-Wallac-1250发光仪(瑞典)，KUBOTA KR-20000 T型低温高速离心机(日本)，LUZEX-F图像分析仪。
1.3 给药剂量和途径 西比灵用生理盐水稀释成1 mg/ml，按1 mg/kg腹腔注射给药，生理盐水按与西比灵相同体积注射。
1.4 测定方法
1.4.1 脑组织中LPO含量测定 应用Tsuchida的WSPS法[3]。
1.4.2 脑组织中SOD活性测定 采用李益新的化学发光法[4]。
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1.4.3 脑组织水含量测定 采用干湿重法[5]。
1.4.4 图像分析 将切片置于光学显微镜下放大100倍显示于监视器屏幕上，用光笔对所测细胞进行标记，每个标本于外颗粒锥体细胞层随机选六个视野，通过计算机自动确定测量单位面积内的锥体细胞数量，即面数密度(N/Amm)。
2 结果
2.1 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内LPO含量及西比灵对其影响 脑缺血后LPO含量增加，再灌注后增加更加明显，西比灵可显著降低缺血再灌注后大鼠脑组织LPO含量，与NS对照组相比差异显著，见图1。
图1 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内
过氧化脂质含量及西比灵对其影响
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2.2 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内SOD活性变化及西比灵对其影响 西比灵组SOD活性较对照组略高，但无明显差异，见图2。
图2 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内
超氧化物歧化酶活性变化及西比灵对其影响
2.3 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内水含量及西比灵对其影响 脑缺血再灌注后脑水含量逐渐增高，西比灵可显著降低缺血再灌注组脑水含量，与NS对照组相比差异显著，见图3。
图3 脑组织水含量及西比灵对其影响
2.4 图像分析 大脑皮质外颗粒锥体细胞层面数密度(N/A)于缺血后无明显改变，再灌注后明显减少，西比灵组与NS对照组相比N/A轻度减少，见附表。
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3 讨论
钙通道系指镶嵌在细胞膜上的一种大分子蛋白质，其分子中间有一水溶性微孔道，允许Ca2+及其他少许几种2价阳离子通过[6]。钙通道分为电压依赖性和受体依赖性通道。目前的钙通道阻滞剂均是作用于电压依赖性钙通道的。但并非所有的钙拮抗剂都对脑血管和神经系统有显著作用。目前西比灵被认为是钙通道阻滞剂中唯一能通过血脑屏障的药物。
附表 大脑皮质外颗粒锥体细胞层神经元密度(mm2) 分 组
例 数
密 度
假手术组
8
332±81.40
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缺血组
8
327±30.81
缺血再灌注组*
8
258±33.13
西比灵组**
8
304±27.94
*与**比较P<0.05
在脑缺血再灌注期间有大量自由基生成。氧自由基能与蛋白、核酸、脂质及透明质酸等反应并破坏其分子结构。脑组织尤其容易受到氧自由基的侵袭，这是由于脑组织内富含胆固醇及不饱和脂肪酸易与氧自由基反应。LPO作为自由基与脂质过氧化反应的产物，其含量的变化间接地反应了脑组织中氧自由基含量的变化。本实验通过LPO来估价脑组织中自由基水平和脂质过氧化反应的强弱。实验结果表明大鼠急性脑缺血30分钟后脑内LPO含量上升，再灌注后含量进一步增加，这是因为缺血时梗死区内细胞能量消耗，Na+堆积，通过Na+—Ca2+转运使大量Ca2+进入细胞内，激活了Ca2+依赖的蛋白激酶，此酶催化黄嘌呤脱氢酶转化为XOD，XOD催化次黄嘌呤生成尿酸的同时产生
，而且由于Ca2+负荷过重使线粒体功能失调不能进行正常的有氧氧化，影响了三羧酸循环中电子的正常传递，使电子与O2结合生成。再灌注时由于线粒体功能进一步下降，因此带入与O2只能在XOD作用下生成，带入的Fe+++等也成为过氧化反应的催化剂，使缺血期因O2缺乏而停滞的烷自由基向脂质过氧化自由基转化得以延续，造成新的恶性循环，进一步攻击不饱和脂肪酸。西比灵治疗组LPO含量较对照组明显降低，其途径有以下几方面：通过阻滞Ca2+过量进入细胞内使依赖Ca2+激活的蛋白激酶不具活性，不能催化黄嘌呤脱氢酶为XOD，使生成减少；另外，使水肿区痉挛的血管扩张，缓解脑组织的缺血缺氧状态；缓解线粒体中有氧代谢的障碍，保留脑组织的能量，减少的生成。由于氧自由基生成量下降，其脂质过氧化反应的产物LPO含量也随之下降。
, 百拇医药
体内正常情况下就存在氧自由基清除系统，如SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化氢酶等，以及内源性防止氧自由基生成的VitC、VitE等。但这些清除系统能力有限，当短期内氧自由基大量生成时就会引发组织损害。由于SOD的作用底物半衰期仅为6秒，给研究其催化机理带来了困难。目前认为反应如下：2+2H+O2+H2O2。H2O2在CAT和过氧化物酶的作用下生成H2O，从而使毒性消失。在此反应中SOD的生物活性会有所改变。以往实验表明当氧自由基大量生成时SOD的活性会有所下降或保持不变[6]，这是因为SOD在反应中被消耗所致。本实验结果表明，脑缺血再灌注期间SOD活性无明显改变，说明SOD的生成系统存在一定的代偿能力。西比灵组SOD活性略升高但无明显差异，在氧自由基大量生成并不断消耗SOD的情况下，SOD能不断生成并维持在基本正常的水平，使脑组织受到保护。
, 百拇医药
脑水肿是脑缺血再灌注不可避免的结果。脑组织水含量的测定是检验脑水肿最直接的方法。本实验结果表明，脑缺血再灌注时脑水含量显著增加，西比灵组较对照组明显减低。由于缺血缺氧，细胞内能量耗竭，Na+K+—ATP酶活性下降，导致细胞内H2O、Na+的积聚，再灌注后代谢紊乱加剧，细胞内外渗透压差值更为显著，细胞毒性水肿更为明显，而且由于血管内皮的损伤，使血脑屏障通透性增高，血浆漏出到组织间隙，形成血管源性脑水肿。这种混合性脑水肿的形成使脑组织水含量显著增加。西比灵由于抑制了自由基的生成，阻滞Ca2+过量内流，避免了细胞膜及血管内皮细胞受到氧自由基及白三烯、花生四烯酸等有害物质的损伤，使血脑屏障得以维持正常的通透性，减少了血浆的渗漏。西比灵由于抑制了细胞毒性水肿和血管源性水肿，使西比灵组脑组织水含量明显下降。图像分析结果亦表明应用西比灵后神经元的面数密度增加，说明西比灵对神经细胞有保护作用。
综上所述，本实验从自由基代谢、脑组织水含量 变化及病理组织学检查探讨了西比灵在大鼠急性脑缺血再灌注损伤中的作用，阐明西比灵不但具有拮抗钙离子内流的作用，而且可抑制自由基生成，为开发西比灵在缺血性脑血管病方面的临床应用提供了理论依据。
, 百拇医药
[参考文献]
[1]Diaz NG.Free radical injury in cerebral ischemia[J].J Neurosury,1979,51:644.
[2]Hossmann KA,Kogure K.The machanism of ischemia-induced brain all injury[J].J Cereb Blood Flew Metwb,1989,6:15.
[3]Tsuchida M,et al.Free radical and the patho physiology of hypoaic ischemia brain damage[J].Biochem Biophys Acta,1984,34:196.
[4]李益新.化学发光法检测SOD[J].生物化学与生物物理学进展，1983，2：59.
[5]黄志宏，王子灿，李麟仙.钙和TXA2在猫局部脑缺血再灌注损伤中的作用[J].中国病理生理杂志，1990，6：459-462.
[6]祝世功，张显峰，李金成.脑缺血再灌注过程中大鼠脑皮质LPO、SOD和Ach含量的变化[J].中风与神经疾病杂志，1993，10：142.
[收稿：1999-11-27，修回：2000-03-25], 百拇医药
单位：刘松岩 韩雪梅(白求恩医科大学三院神经内科，吉林 长春 130021)；刘松柏(吉林油田矿医院内科)
关键词：脑缺血再灌注；过氧化脂质；超氧化物歧化酶；西比灵
中国急救医学000604 [摘 要] 目的 进一步探讨西比灵对急性脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法 采用Pulsinelli四血管闭塞法制备大鼠急性脑缺血再灌注模型，利用Tsuchida的WSPS法测定LPO，利用化学发光法测定SOD活性，同时观察了脑组织水含量及病理变化，并观察西比灵对上述指标影响。结果 ①脑缺血后脑组织水含量升高，再灌注后升高更明显，西比灵能明显降低脑缺血再灌注期间脑水含量。②西比灵降低LPO含量，稳定SOD活性。③图像分析显示西比灵可增加再灌注后神经元面数密度。结论 西比灵不但可防止Ca2+过量跨膜进入细胞内，还具有抑制血由基生成的作用，减轻脑水肿，减轻脑组织的病理损害，从而在脑缺血再灌注期间达到脑保护作用。
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[中图分类号] R 97；R 969.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)06-0327-03
Experimental research of protective effect of Sibelium on acute cerebral ischemia reperfusion injury of rats
LIU Song-yan,HAN Xue-mei
(Department of Neurology, the Third Clinical College, Normen Bethune University of Medical Science,Changchun 130021, China)
LIU Song-bai
, 百拇医药
[Abstract] Objective Probing into the mechanism of Sibelium protective effect on brain tissue in acute cerebral ischemia reperfusion.Methods The model is prepared rat acute cerebral ischemia reperfusion by Pulsinelli's 4VO method,to assay LPO using Tsuchida's WSPS method,to assay SOD activity by chemiluminescence's method,meanwhile observe the water content of brain tessue and pathology change,and observe Sibelium's influence on above index.Results Sibelium can decrease LPO content,stabilize SOD activity,decrease the water content of brain tissue during reperfusion.The image analysis shows Sibelium can increase the neuron density.Conclusions Sibelium can inhibit free radical production during cerebral ischemia reperfusion.Thereby can protect brain tissue.
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[Key words] Cerebral ischemia reperfusion； LPO； SOD； Sibelium▲
脑血管病是严重危害人类生命安全的三大疾病之一，其中缺血性脑血管病占大多数。长时间的脑缺血后再灌注期间组织发生复杂的继发性改变，加重组织损伤[1，2]。目前认为与能量代谢障碍、微循环障碍、自由基损伤、细胞内钙超载以及兴奋性氨基酸类神经递质异常有关[2]。细胞内钙超载被认为是脑缺血再灌注损伤的重要环节。西比灵作为第四代钙离子拮抗剂己普遍应用于临床并得到肯定性证实[3]，但在脑缺血再灌注损伤中是否存在其他保护作用尚未见报导。本文通过观察西比灵对LPO、SOD活性的影响，进一步探讨其在脑缺血再灌注期间抑制自由基生成作用，为开发其在缺血性脑血管病治疗上进一步应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作及分组 由白求恩医科大学实验动物部提供的健康雄性Wistar大鼠32只，随机分成4组，每组8只，分别为假手术组、单纯缺血30分钟组、单纯缺血30分钟再灌注60分钟组、西比灵治疗组。手术采用Pulsinelli的4VO方法，届时断头处死，冰盘中分离出海马置液氮中冷冻保存待测。
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1.2 仪器与药品 由长沙生化制药厂提供SOD标准品，活力为4 000 U/mg。由LKB公司提供Luminol。西比灵为西安杨森制药有限公司产品。其余药品均为国产分析纯。F-3000荧光分光光度计(日本)，LKB-Wallac-1250发光仪(瑞典)，KUBOTA KR-20000 T型低温高速离心机(日本)，LUZEX-F图像分析仪。
1.3 给药剂量和途径 西比灵用生理盐水稀释成1 mg/ml，按1 mg/kg腹腔注射给药，生理盐水按与西比灵相同体积注射。
1.4 测定方法
1.4.1 脑组织中LPO含量测定 应用Tsuchida的WSPS法[3]。
1.4.2 脑组织中SOD活性测定 采用李益新的化学发光法[4]。
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1.4.3 脑组织水含量测定 采用干湿重法[5]。
1.4.4 图像分析 将切片置于光学显微镜下放大100倍显示于监视器屏幕上，用光笔对所测细胞进行标记，每个标本于外颗粒锥体细胞层随机选六个视野，通过计算机自动确定测量单位面积内的锥体细胞数量，即面数密度(N/Amm)。
2 结果
2.1 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内LPO含量及西比灵对其影响 脑缺血后LPO含量增加，再灌注后增加更加明显，西比灵可显著降低缺血再灌注后大鼠脑组织LPO含量，与NS对照组相比差异显著，见图1。
图1 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内
过氧化脂质含量及西比灵对其影响
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2.2 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内SOD活性变化及西比灵对其影响 西比灵组SOD活性较对照组略高，但无明显差异，见图2。
图2 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内
超氧化物歧化酶活性变化及西比灵对其影响
2.3 大鼠急性脑缺血再灌注后脑组织内水含量及西比灵对其影响 脑缺血再灌注后脑水含量逐渐增高，西比灵可显著降低缺血再灌注组脑水含量，与NS对照组相比差异显著，见图3。
图3 脑组织水含量及西比灵对其影响
2.4 图像分析 大脑皮质外颗粒锥体细胞层面数密度(N/A)于缺血后无明显改变，再灌注后明显减少，西比灵组与NS对照组相比N/A轻度减少，见附表。
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3 讨论
钙通道系指镶嵌在细胞膜上的一种大分子蛋白质，其分子中间有一水溶性微孔道，允许Ca2+及其他少许几种2价阳离子通过[6]。钙通道分为电压依赖性和受体依赖性通道。目前的钙通道阻滞剂均是作用于电压依赖性钙通道的。但并非所有的钙拮抗剂都对脑血管和神经系统有显著作用。目前西比灵被认为是钙通道阻滞剂中唯一能通过血脑屏障的药物。
附表 大脑皮质外颗粒锥体细胞层神经元密度(mm2) 分 组
例 数
密 度
假手术组
8
332±81.40
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缺血组
8
327±30.81
缺血再灌注组*
8
258±33.13
西比灵组**
8
304±27.94
*与**比较P<0.05
在脑缺血再灌注期间有大量自由基生成。氧自由基能与蛋白、核酸、脂质及透明质酸等反应并破坏其分子结构。脑组织尤其容易受到氧自由基的侵袭，这是由于脑组织内富含胆固醇及不饱和脂肪酸易与氧自由基反应。LPO作为自由基与脂质过氧化反应的产物，其含量的变化间接地反应了脑组织中氧自由基含量的变化。本实验通过LPO来估价脑组织中自由基水平和脂质过氧化反应的强弱。实验结果表明大鼠急性脑缺血30分钟后脑内LPO含量上升，再灌注后含量进一步增加，这是因为缺血时梗死区内细胞能量消耗，Na+堆积，通过Na+—Ca2+转运使大量Ca2+进入细胞内，激活了Ca2+依赖的蛋白激酶，此酶催化黄嘌呤脱氢酶转化为XOD，XOD催化次黄嘌呤生成尿酸的同时产生
，而且由于Ca2+负荷过重使线粒体功能失调不能进行正常的有氧氧化，影响了三羧酸循环中电子的正常传递，使电子与O2结合生成。再灌注时由于线粒体功能进一步下降，因此带入与O2只能在XOD作用下生成，带入的Fe+++等也成为过氧化反应的催化剂，使缺血期因O2缺乏而停滞的烷自由基向脂质过氧化自由基转化得以延续，造成新的恶性循环，进一步攻击不饱和脂肪酸。西比灵治疗组LPO含量较对照组明显降低，其途径有以下几方面：通过阻滞Ca2+过量进入细胞内使依赖Ca2+激活的蛋白激酶不具活性，不能催化黄嘌呤脱氢酶为XOD，使生成减少；另外，使水肿区痉挛的血管扩张，缓解脑组织的缺血缺氧状态；缓解线粒体中有氧代谢的障碍，保留脑组织的能量，减少的生成。由于氧自由基生成量下降，其脂质过氧化反应的产物LPO含量也随之下降。, 百拇医药
体内正常情况下就存在氧自由基清除系统，如SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化氢酶等，以及内源性防止氧自由基生成的VitC、VitE等。但这些清除系统能力有限，当短期内氧自由基大量生成时就会引发组织损害。由于SOD的作用底物
半衰期仅为6秒，给研究其催化机理带来了困难。目前认为反应如下：2+2H+O2+H2O2。H2O2在CAT和过氧化物酶的作用下生成H2O，从而使毒性消失。在此反应中SOD的生物活性会有所改变。以往实验表明当氧自由基大量生成时SOD的活性会有所下降或保持不变[6]，这是因为SOD在反应中被消耗所致。本实验结果表明，脑缺血再灌注期间SOD活性无明显改变，说明SOD的生成系统存在一定的代偿能力。西比灵组SOD活性略升高但无明显差异，在氧自由基大量生成并不断消耗SOD的情况下，SOD能不断生成并维持在基本正常的水平，使脑组织受到保护。, 百拇医药
脑水肿是脑缺血再灌注不可避免的结果。脑组织水含量的测定是检验脑水肿最直接的方法。本实验结果表明，脑缺血再灌注时脑水含量显著增加，西比灵组较对照组明显减低。由于缺血缺氧，细胞内能量耗竭，Na+K+—ATP酶活性下降，导致细胞内H2O、Na+的积聚，再灌注后代谢紊乱加剧，细胞内外渗透压差值更为显著，细胞毒性水肿更为明显，而且由于血管内皮的损伤，使血脑屏障通透性增高，血浆漏出到组织间隙，形成血管源性脑水肿。这种混合性脑水肿的形成使脑组织水含量显著增加。西比灵由于抑制了自由基的生成，阻滞Ca2+过量内流，避免了细胞膜及血管内皮细胞受到氧自由基及白三烯、花生四烯酸等有害物质的损伤，使血脑屏障得以维持正常的通透性，减少了血浆的渗漏。西比灵由于抑制了细胞毒性水肿和血管源性水肿，使西比灵组脑组织水含量明显下降。图像分析结果亦表明应用西比灵后神经元的面数密度增加，说明西比灵对神经细胞有保护作用。
综上所述，本实验从自由基代谢、脑组织水含量 变化及病理组织学检查探讨了西比灵在大鼠急性脑缺血再灌注损伤中的作用，阐明西比灵不但具有拮抗钙离子内流的作用，而且可抑制自由基生成，为开发西比灵在缺血性脑血管病方面的临床应用提供了理论依据。
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[参考文献]
[1]Diaz NG.Free radical injury in cerebral ischemia[J].J Neurosury,1979,51:644.
[2]Hossmann KA,Kogure K.The machanism of ischemia-induced brain all injury[J].J Cereb Blood Flew Metwb,1989,6:15.
[3]Tsuchida M,et al.Free radical and the patho physiology of hypoaic ischemia brain damage[J].Biochem Biophys Acta,1984,34:196.
[4]李益新.化学发光法检测SOD[J].生物化学与生物物理学进展，1983，2：59.
[5]黄志宏，王子灿，李麟仙.钙和TXA2在猫局部脑缺血再灌注损伤中的作用[J].中国病理生理杂志，1990，6：459-462.
[6]祝世功，张显峰，李金成.脑缺血再灌注过程中大鼠脑皮质LPO、SOD和Ach含量的变化[J].中风与神经疾病杂志，1993，10：142.
[收稿：1999-11-27，修回：2000-03-25], 百拇医药