川芎嗪、黄芪合用对脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白表达影响
作者：曲友直 高国栋 赵燕玲
单位：
关键词：局灶性脑缺血；缺血性脑卒中；c-jun蛋白；川芎嗪；黄芪
安徽中医学院学报000629 摘要：目的：探讨局灶性脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白的表达及川芎嗪、黄芪对其表达的影响。方法：成年雄性SD大鼠24只随机分成4组。A组：模型组，即脑缺血再灌注组(n=6)；B组：川芎嗪治疗组(n=6)；C组：黄芪治疗组(n=6)；D组：川芎嗪、黄芪合用组(n=6)。采用免疫组化与医学图像分析系统相结合的方法，测定4组大鼠大脑皮层c-jun蛋白阳性细胞平均灰度值。结果：4组大鼠脑组织缺血侧c-jun蛋白阳性细胞平均灰度均低于对侧，即非缺血侧(P<0.01)；在缺血侧脑组织，B、C、D 3组分别与A组比较，c-jun蛋白阳性细胞平均灰度均明显升高(P<0.01)，D组与B、C组比较，c-jun蛋白阳性细胞平均灰度明显升高(P<0.01)。结论：局灶性脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白表达显著升高；川芎嗪、黄芪以及两药合用均可部分抑制c-jun蛋白表达；两药合用比单用川芎嗪或黄芪降低c-jun蛋白表达的作用更显著，这可能是临床使用益气活血法治疗缺血性脑卒中的机制之一。
, 百拇医药
中图分类号：R743.3 文献标识码：A
文章编号：1000-2219(2000)06-0057-02
研究表明，外周神经组织和中枢神经组织受到损伤后，神经细胞均出现c-jun基因表达。c-jun基因的蛋白产物在迟发性神经元坏死、神经元可塑性、梗死灶远隔神经元损害、神经元缺血耐受性影响等方面有重要意义。中医学认为[1，2]，缺血性脑卒中的主要病机是气虚血瘀，临床多采用益气活血法作为主要治则，疗效显著，但其作用机制尚未阐明。本研究通过观察活血药川芎嗪、益气药黄芪以及两药合用对局灶性脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白表达的影响，探讨益气活血药对缺血性脑卒中保护作用的机制。
1 材料和方法
1.1 材料 川芎嗪注射液(丽珠集团利民制药厂，批号990402)；黄芪注射液(上海市福达制药有限公司，批号980601)；c-jun免疫组化试剂盒购于湖北省武汉博士德公司，抗体效价1∶80；HPIAS1000医学图像分析系统，同济医科大学千屏影像公司生产；正常成年雄性SD大鼠24只，购自本校实验动物中心，体质量350～400g，随机分为4组，每组6只。
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1.2 方法 参照Longa[3]报道的颈外动脉栓线法复制局灶性脑缺血再灌注模型。模型组(A)：缺血90min后拔出栓线再灌注60min；川芎嗪治疗组(B)：缺血前30min腹腔注射川芎嗪33mg/kg；黄芪治疗组(C)：缺血前30min腹腔注射黄芪4.5g/kg；川芎嗪、黄芪合用组(D)：缺血前30min腹腔注射川芎嗪16.5mg/kg及黄芪2.25g/kg。4组大鼠均于再灌注60min时深麻醉，迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，用40ml/L多聚甲醛(4℃，pH 7.4)500ml灌注固定2h。断头取脑，自额极至枕叶分为A、B、C、D、E 5等份，取C脑片石蜡包埋，制备4μm厚的连续切片。采用ABC法进行免疫组化染色，染色步骤参照免疫组化ABC试剂盒说明书。每张切片在栓塞侧及栓塞对侧大脑皮层各随机采集5个视野，输入医学图像分析系统(MIPS)进行图像处理，检测阳性细胞平均灰度值。
1.3 统计学分析 所有数据均以
±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
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2 结果
4组大鼠脑组织缺血侧c-jun蛋白阳性细胞平均灰度值均低于非缺血侧(P<0.01)；在缺血侧脑组织，B、C、D 3组分别与A组比较，c-jun蛋白阳性细胞平均灰度均高于A组(P<0.01)，D组与B、C组比较，c-jun蛋白阳性细胞平均灰度较B、C组明显升高(P<0.01)。4组大鼠非缺血侧c-jun蛋白阳性细胞平均灰度无显著差异(P>0.05)。平均灰度在图像分析中用来表示图像的透光率，分为256级，最黑为0级，最亮为256级。c-jun蛋白阳性细胞平均灰度数值越高，说明其免疫组化染色越浅，即细胞内c-jun蛋白含量越低。脑组织缺血再灌注后c-jun蛋白阳性细胞平均灰度值减少提示表达增强，川芎嗪、黄芪以及两药合用使缺血再灌注后c-jun阳性细胞平均灰度值增高即表达下降，其中两药合用下调c-jun蛋白表达作用比单用川芎嗪或黄芪更强。见表1。
表1 川芎嗪、黄芪对脑缺血再灌注后c-jun
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蛋白表达的影响(±s)
组别
n
缺血侧灰度值
非缺血侧灰度值
A
6
139.7±4.9**
168.8±4.6
B
6
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156.6±3.3**△△
171.3±5.0
C
6
153.9±3.1**△△
168.6±2.9
D
6
162.3±4.0**△△##
169.1±3.7
与非缺血侧比较，**P<0.01；
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与A组缺血侧比较，△△P<0.01；
与B、C组缺血侧比较，##P<0.01
3 讨论
局灶性脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白表达显著增高，表明缺血再灌注可诱发c-jun蛋白表达。c-jun基因是哺乳动物细胞内基因的一个家庭，因其在组织癌变过程中进行表达以及它与RNA病毒转移癌基因v-jun有相同的DNA序列，故称之为癌基因。细胞受到创伤或刺激时c-jun基因是最早表达的基因之一，故又属于立早基因。c-jun基因能被创伤、缺血、抽搐和感觉刺激等诱导表达。脑组织缺血再灌注损伤后，其EAA释放急剧增多，NMDA受体被激活，使内质网释放Ca2+，活化Ca2+通道，增加细胞Ca2+内流，从而激发了c-jun基因的表达。c-jun基因的蛋白产物c-jun蛋白与同时表达的FOS蛋白通过亮氨酸拉链区结合成异构二聚体AP-1，AP-1通过与靶基因promotor区TAGC/GTCA序列结合，刺激靶基因表达。AP-1靶基因有脑啡肽前体基因、强啡肽基因、神经营养因子基因、碱性成纤维细胞生长因子基因[4]。AP-1通过激活上述靶基因的表达，最终对刺激作出反应。
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本研究表明，川芎嗪、黄芪及两药合用组缺血侧脑组织c-jun蛋白表达与缺血对侧比较明显增多，但低于模型组缺血侧，表明活血类中药川芎嗪、益气类中药黄芪以及两药合用均可部分下调脑缺血再灌注后脑组织中c-jun蛋白的表达。川芎嗪是活血化瘀类中药川芎的主要有效成分，化学结构为四甲基吡嗪。目前已知川芎嗪具有扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、抗脂质氧化、增加NO等作用[5，6]。黄芪属益气类中药，具有补气升阳、利水消肿等功效。现代药理研究表明，黄芪具有抗自由基[7]、减少脑缺血后脑组织水肿、保护血脑屏障等作用[8]。由于川芎嗪及黄芪对缺血后脑组织具有多种保护作用，可缓解缺血导致的EAA释放增多和细胞Ca2+增多，缓解缺血、缺氧所致的代谢紊乱，从而减轻了缺血导致的脑损害，使缺血诱导的c-jun蛋白高表达显著下调。
本研究发现活血和益气中药合用可显著下调脑缺血再灌注后c-jun蛋白表达，并且其作用明显优于单用活血类药物或单用益气类药物，证明两类药物有明显协同作用。这与中医认为缺血性脑卒中病机为气虚血瘀的理论及中医治疗缺血性脑卒中常采用益气活血药物配伍并用的治则相符。因此我们推测，活血化瘀配伍益气升阳类药物显著下调c-jun蛋白的表达，可能是其治疗缺血性脑卒中的分子机制之一。
, 百拇医药
EFFECT OF LIGUSTRAZINE AND ASTRAGUS ON
EXPRESSION OF c-jun IN RAT BRAINS AFTER CEREBRAL
ISCHEMIA- REPERFUSION INJURY
QU You-zhi,GAO Guo-dong,ZHAO Yan-ling
(Department of Neurosurgery,Tangdu Hospital,The 4th Military Medical University,Shaanxi Xi’an 710038,China)
Abstract：Objective：To investigate the expression of c-jun protein in rat brains after focal cerebral ischemia followed by reperfusion and effects of ligustrazine,astragus.Method:24 SD adult male rats were divided into 4 groups at random.Group A:model group or ischemia and reperfusion group(n=6)；group B:treated with ligustrazine(n=6);group C:treated with astragus(n=6);group D:treated with ligustrazine and astragus(n=6).The immunohistochemistry and medical image processing system(MIPS) were used to measure mean grey level of c-jun positive cells in rat cerebral cortex of 4 groups.Result:In 4 groups,mean grey level of c-jun positive cells was lower in ischemic sides than that in non-ischemic sides(P<0.01),In ischemic sides,mean grey level of c-jun positive cellsin group B or C or D was higher than that in group A(P<0.01)，mean grey level of c-jun positive cells in group D was higher than that in group B or group C(P<0.01).Conclusion:Expression of c-jun protein increased significantly after cerebral ischemia and reperfusion.Ligustrazine,astragus,ligustrazine and astragus all could inhibit partly the expression of c-jun protein.Prescription of ligustrazine and astragus has stronger inhibiting actions than ligustrazine or astragus.It may be one of mechanisms that ischemia stroke is treated by reinforcing Qi and activating blood circulation therapy in TCM clinics.
, http://www.100md.com
Key words：Focal cerebral ischemia;Ischemic stroke;c-jun;Ligustrazine;Astragus
作者简介：曲友直(1973-)，男，医师，医学硕士。
参考文献
[1]王玉升，王军.中药治疗脑缺血实验研究概况[J].中医研究，1997，10(4)：52.
[2]郭改会，董鸿瑞，傅仁杰.益气活血化瘀法治疗缺血性中风研究近况[J].中国中医药信息杂志，1997，4(8)：11.
[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84.
, http://www.100md.com
[4]Lun HM,Chen HH.c-fos protein expression and ischemic change in neurons vulnurable to ischemia/hypoxia,correlated with basic fibroblast growth factor immunoreactivity[J].J Neuropathol Exp Neurol,1994,53:598.
[5]戈继业，张振岭.川芎药理作用研究及临床应用新进展[J].中国中西医结合杂志，1994，14(10)：638.
[6]汪远金，申国明，王钦茂.川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].安徽中医学院学报，2000，19(1)：44.
[7]汪德清，沈文梅，田亚平，等.黄芪总黄酮对羟自由基所致哺乳动物细胞损伤的防护作用[J].中国中药杂志，1995，20：240.
[8]陈春富，新述苏，冯林，等.黄芪对大鼠脑缺血血脑屏障及脑血流的影响[J].卒中与神经疾病杂志，1998，5：132.
收稿日期：2000-07-04, 百拇医药
单位：
关键词：局灶性脑缺血；缺血性脑卒中；c-jun蛋白；川芎嗪；黄芪
安徽中医学院学报000629 摘要：目的：探讨局灶性脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白的表达及川芎嗪、黄芪对其表达的影响。方法：成年雄性SD大鼠24只随机分成4组。A组：模型组，即脑缺血再灌注组(n=6)；B组：川芎嗪治疗组(n=6)；C组：黄芪治疗组(n=6)；D组：川芎嗪、黄芪合用组(n=6)。采用免疫组化与医学图像分析系统相结合的方法，测定4组大鼠大脑皮层c-jun蛋白阳性细胞平均灰度值。结果：4组大鼠脑组织缺血侧c-jun蛋白阳性细胞平均灰度均低于对侧，即非缺血侧(P<0.01)；在缺血侧脑组织，B、C、D 3组分别与A组比较，c-jun蛋白阳性细胞平均灰度均明显升高(P<0.01)，D组与B、C组比较，c-jun蛋白阳性细胞平均灰度明显升高(P<0.01)。结论：局灶性脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白表达显著升高；川芎嗪、黄芪以及两药合用均可部分抑制c-jun蛋白表达；两药合用比单用川芎嗪或黄芪降低c-jun蛋白表达的作用更显著，这可能是临床使用益气活血法治疗缺血性脑卒中的机制之一。
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中图分类号：R743.3 文献标识码：A
文章编号：1000-2219(2000)06-0057-02
研究表明，外周神经组织和中枢神经组织受到损伤后，神经细胞均出现c-jun基因表达。c-jun基因的蛋白产物在迟发性神经元坏死、神经元可塑性、梗死灶远隔神经元损害、神经元缺血耐受性影响等方面有重要意义。中医学认为[1，2]，缺血性脑卒中的主要病机是气虚血瘀，临床多采用益气活血法作为主要治则，疗效显著，但其作用机制尚未阐明。本研究通过观察活血药川芎嗪、益气药黄芪以及两药合用对局灶性脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白表达的影响，探讨益气活血药对缺血性脑卒中保护作用的机制。
1 材料和方法
1.1 材料 川芎嗪注射液(丽珠集团利民制药厂，批号990402)；黄芪注射液(上海市福达制药有限公司，批号980601)；c-jun免疫组化试剂盒购于湖北省武汉博士德公司，抗体效价1∶80；HPIAS1000医学图像分析系统，同济医科大学千屏影像公司生产；正常成年雄性SD大鼠24只，购自本校实验动物中心，体质量350～400g，随机分为4组，每组6只。
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1.2 方法 参照Longa[3]报道的颈外动脉栓线法复制局灶性脑缺血再灌注模型。模型组(A)：缺血90min后拔出栓线再灌注60min；川芎嗪治疗组(B)：缺血前30min腹腔注射川芎嗪33mg/kg；黄芪治疗组(C)：缺血前30min腹腔注射黄芪4.5g/kg；川芎嗪、黄芪合用组(D)：缺血前30min腹腔注射川芎嗪16.5mg/kg及黄芪2.25g/kg。4组大鼠均于再灌注60min时深麻醉，迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，用40ml/L多聚甲醛(4℃，pH 7.4)500ml灌注固定2h。断头取脑，自额极至枕叶分为A、B、C、D、E 5等份，取C脑片石蜡包埋，制备4μm厚的连续切片。采用ABC法进行免疫组化染色，染色步骤参照免疫组化ABC试剂盒说明书。每张切片在栓塞侧及栓塞对侧大脑皮层各随机采集5个视野，输入医学图像分析系统(MIPS)进行图像处理，检测阳性细胞平均灰度值。
1.3 统计学分析 所有数据均以
±s表示，以组间t检验进行统计学处理。, 百拇医药
2 结果
4组大鼠脑组织缺血侧c-jun蛋白阳性细胞平均灰度值均低于非缺血侧(P<0.01)；在缺血侧脑组织，B、C、D 3组分别与A组比较，c-jun蛋白阳性细胞平均灰度均高于A组(P<0.01)，D组与B、C组比较，c-jun蛋白阳性细胞平均灰度较B、C组明显升高(P<0.01)。4组大鼠非缺血侧c-jun蛋白阳性细胞平均灰度无显著差异(P>0.05)。平均灰度在图像分析中用来表示图像的透光率，分为256级，最黑为0级，最亮为256级。c-jun蛋白阳性细胞平均灰度数值越高，说明其免疫组化染色越浅，即细胞内c-jun蛋白含量越低。脑组织缺血再灌注后c-jun蛋白阳性细胞平均灰度值减少提示表达增强，川芎嗪、黄芪以及两药合用使缺血再灌注后c-jun阳性细胞平均灰度值增高即表达下降，其中两药合用下调c-jun蛋白表达作用比单用川芎嗪或黄芪更强。见表1。
表1 川芎嗪、黄芪对脑缺血再灌注后c-jun
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蛋白表达的影响(
±s)组别
n
缺血侧灰度值
非缺血侧灰度值
A
6
139.7±4.9**
168.8±4.6
B
6
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156.6±3.3**△△
171.3±5.0
C
6
153.9±3.1**△△
168.6±2.9
D
6
162.3±4.0**△△##
169.1±3.7
与非缺血侧比较，**P<0.01；
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与A组缺血侧比较，△△P<0.01；
与B、C组缺血侧比较，##P<0.01
3 讨论
局灶性脑缺血再灌注后脑组织c-jun蛋白表达显著增高，表明缺血再灌注可诱发c-jun蛋白表达。c-jun基因是哺乳动物细胞内基因的一个家庭，因其在组织癌变过程中进行表达以及它与RNA病毒转移癌基因v-jun有相同的DNA序列，故称之为癌基因。细胞受到创伤或刺激时c-jun基因是最早表达的基因之一，故又属于立早基因。c-jun基因能被创伤、缺血、抽搐和感觉刺激等诱导表达。脑组织缺血再灌注损伤后，其EAA释放急剧增多，NMDA受体被激活，使内质网释放Ca2+，活化Ca2+通道，增加细胞Ca2+内流，从而激发了c-jun基因的表达。c-jun基因的蛋白产物c-jun蛋白与同时表达的FOS蛋白通过亮氨酸拉链区结合成异构二聚体AP-1，AP-1通过与靶基因promotor区TAGC/GTCA序列结合，刺激靶基因表达。AP-1靶基因有脑啡肽前体基因、强啡肽基因、神经营养因子基因、碱性成纤维细胞生长因子基因[4]。AP-1通过激活上述靶基因的表达，最终对刺激作出反应。
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本研究表明，川芎嗪、黄芪及两药合用组缺血侧脑组织c-jun蛋白表达与缺血对侧比较明显增多，但低于模型组缺血侧，表明活血类中药川芎嗪、益气类中药黄芪以及两药合用均可部分下调脑缺血再灌注后脑组织中c-jun蛋白的表达。川芎嗪是活血化瘀类中药川芎的主要有效成分，化学结构为四甲基吡嗪。目前已知川芎嗪具有扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、抗脂质氧化、增加NO等作用[5，6]。黄芪属益气类中药，具有补气升阳、利水消肿等功效。现代药理研究表明，黄芪具有抗自由基[7]、减少脑缺血后脑组织水肿、保护血脑屏障等作用[8]。由于川芎嗪及黄芪对缺血后脑组织具有多种保护作用，可缓解缺血导致的EAA释放增多和细胞Ca2+增多，缓解缺血、缺氧所致的代谢紊乱，从而减轻了缺血导致的脑损害，使缺血诱导的c-jun蛋白高表达显著下调。
本研究发现活血和益气中药合用可显著下调脑缺血再灌注后c-jun蛋白表达，并且其作用明显优于单用活血类药物或单用益气类药物，证明两类药物有明显协同作用。这与中医认为缺血性脑卒中病机为气虚血瘀的理论及中医治疗缺血性脑卒中常采用益气活血药物配伍并用的治则相符。因此我们推测，活血化瘀配伍益气升阳类药物显著下调c-jun蛋白的表达，可能是其治疗缺血性脑卒中的分子机制之一。
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EFFECT OF LIGUSTRAZINE AND ASTRAGUS ON
EXPRESSION OF c-jun IN RAT BRAINS AFTER CEREBRAL
ISCHEMIA- REPERFUSION INJURY
QU You-zhi,GAO Guo-dong,ZHAO Yan-ling
(Department of Neurosurgery,Tangdu Hospital,The 4th Military Medical University,Shaanxi Xi’an 710038,China)
Abstract：Objective：To investigate the expression of c-jun protein in rat brains after focal cerebral ischemia followed by reperfusion and effects of ligustrazine,astragus.Method:24 SD adult male rats were divided into 4 groups at random.Group A:model group or ischemia and reperfusion group(n=6)；group B:treated with ligustrazine(n=6);group C:treated with astragus(n=6);group D:treated with ligustrazine and astragus(n=6).The immunohistochemistry and medical image processing system(MIPS) were used to measure mean grey level of c-jun positive cells in rat cerebral cortex of 4 groups.Result:In 4 groups,mean grey level of c-jun positive cells was lower in ischemic sides than that in non-ischemic sides(P<0.01),In ischemic sides,mean grey level of c-jun positive cellsin group B or C or D was higher than that in group A(P<0.01)，mean grey level of c-jun positive cells in group D was higher than that in group B or group C(P<0.01).Conclusion:Expression of c-jun protein increased significantly after cerebral ischemia and reperfusion.Ligustrazine,astragus,ligustrazine and astragus all could inhibit partly the expression of c-jun protein.Prescription of ligustrazine and astragus has stronger inhibiting actions than ligustrazine or astragus.It may be one of mechanisms that ischemia stroke is treated by reinforcing Qi and activating blood circulation therapy in TCM clinics.
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Key words：Focal cerebral ischemia;Ischemic stroke;c-jun;Ligustrazine;Astragus
作者简介：曲友直(1973-)，男，医师，医学硕士。
参考文献
[1]王玉升，王军.中药治疗脑缺血实验研究概况[J].中医研究，1997，10(4)：52.
[2]郭改会，董鸿瑞，傅仁杰.益气活血化瘀法治疗缺血性中风研究近况[J].中国中医药信息杂志，1997，4(8)：11.
[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84.
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[4]Lun HM,Chen HH.c-fos protein expression and ischemic change in neurons vulnurable to ischemia/hypoxia,correlated with basic fibroblast growth factor immunoreactivity[J].J Neuropathol Exp Neurol,1994,53:598.
[5]戈继业，张振岭.川芎药理作用研究及临床应用新进展[J].中国中西医结合杂志，1994，14(10)：638.
[6]汪远金，申国明，王钦茂.川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].安徽中医学院学报，2000，19(1)：44.
[7]汪德清，沈文梅，田亚平，等.黄芪总黄酮对羟自由基所致哺乳动物细胞损伤的防护作用[J].中国中药杂志，1995，20：240.
[8]陈春富，新述苏，冯林，等.黄芪对大鼠脑缺血血脑屏障及脑血流的影响[J].卒中与神经疾病杂志，1998，5：132.
收稿日期：2000-07-04, 百拇医药