神经元Glu合成、 分解和分泌与癫痫发病的研究
作者：胡元元 徐仁伵 张 洪 何善述 童萼塘
单位：胡元元(430030 武汉同济医科大学基础医学院生物化学研究室)；何善述(430030 武汉同济医科大学基础医学院生物化学研究室)；徐仁伵(同济医科大学协和医院神经内科)；张洪(同济医科大学协和医院神经内科)；童萼塘(同济医科大学协和医院神经内科)
关键词：癫痫；谷氨酸；谷氨酸脱羧酶；细胞培养；海马
脑与神经疾病杂志000605
摘 要 目的：研究神经元谷氨酸(Glu)合成、 分解和分泌与癫痫发病的关系。 方法： 用致痫剂马桑内酯(CL)处理培养大鼠海马神经元， 用高效液相色谱仪、 液体闪烁仪分别检测培养神经元内外Glu含量和神经元内谷氨酸脱羧酶(GAD)活性。 结果： 与对照组比较， CL致痫神经元内Glu浓度没有显著差异， 神经元外Glu浓度显著升高(P<0.05)， 神经元内GAD活性显著增高(P<0.05)。 结论： 癫病发病中， 痫性神经元Glu合成、 分解、 分泌增强。
, http://www.100md.com
Study on the metabolism and secretion of gluntamate in kindle hippocampus neurons in vitro
Hu Yuanyuan, Xu Renshi, Zhang Hong, et al.
(Dept. of Biochemistry, Basic Medical Institute, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Objective To study the relationship between the metabolism of glutamate(Glu) in hippocampus neurons and the pathogenesis of epilepsy. Methods: The amount of Glu and glutamic decarboxylase (GAD) in coriaria lactone(CL) treated hippocampus neurons were detected by high performance liquid chromatograph(HPLC) and liquid-scintillation radioassary. Results: The amount of extracellular Glu and the activity of GAD in hippocampuas neurons treated with CL were markly higher than those in control group (P<0.05). Conclusions: During the attake of epilepsy, the Glu in kindle hippocampus neurons synthesis, secret and decompose increased, which may by the cause of epilepsy attack.
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Key words Epilepsy Glutamate Glutamic decarboxylase Cell culture Hippocampus
谷氨酸(Glu)作为一种重要的脑内兴奋性神经递质， 其与癫痫发病的关系， 已经得到广泛的关注。 国内外许多研究者通过多种实验动物模型和检测技术， 证实痫性病灶组织或/和组织间液Glu含量显著升高[1，2]。 本实验利用细胞培养技术观察致痫神经元Glu合成、 分解和分泌情况， 进一步探索痫性神经元Glu神经递质与癫痫发病的关系。
材料与方法
1. 主要试剂与仪器 Neurobasal/B27培养基， UL-14C Glu、 L-Glu标准品购自美国Sigma公司， 马桑内酯(CL)为中国华西医科大学制药厂产品。 Gilson 716型高效液相色谱议(HPLC)， 西安二六二厂FG型P-液体内烁计数仪。
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2. 大鼠海马神经元细胞培养 无菌取新生SD大鼠海马组织，0.125%胰酶消化1.5分钟。悬浮于含10%胎牛血清和20%小牛血清的DMEM/F12培养基中，按1×106细胞/ml接种于培养板，37℃5%CO2培养。第三天换培养基一次，第六天换无血清培养基后，随机分为2组，对照组(n=16)和CL处理组(n=16)。CL处理组加入100μmol/L CL培养24小时。收集两组细胞、细胞培养基，用于检测Glu和GAD。
3. 神经元内外Glu的检测 细胞培养时收集的细胞和细胞培养基加入等体积0.4mol/L HClO4，4℃ 12000g离心45分钟。取上清10μl与20pmol/L高丝氨酸10μl和100μl邻苯二甲醛混合，室温下准确反应2分钟。从中取10μl进样，流动相开始为35%甲醇和0.1mol/L pH 8.6 磷酸钠缓冲液，按流速1ml/min，甲醇比例每分钟增加2%进行梯度洗脱20分钟，以标准品曲线面积与高丝氨酸面积比进行定量。
, 百拇医药
4. 神经元内GAD活性的测量 以GAD催化Glu生成游离CO2的量来反映GAD的活性， 取pH为6.8的磷酸钾缓冲液150μl放入EP管中(缓冲液含P-巯基乙醇、 磷酸吡哆醛、 L-Glu、 UL-14C Glu)， 将EP管放入闪烁瓶， 吸附有NaoH的擦镜纸亦放入瓶内封盖。 加入50μl细胞匀浆上清于EP管中， 37℃反应1小时， 加入50μl H2SO4中止反应， 37℃继续振摇30分钟， 取出EP管， 加入10ml闪烁液于瓶内， 于P-液体闪烁仪上读数。
5. 统计学处理 数据以“
±s”表示， 资料进行正态检验和方差齐性检验， 组间比较采用t检验， 检验水准α=0.05。
结 果
数据统计分析结果表明， 资料呈正态分布， 方差齐。 100μmol/L CL处理大鼠海马培养神经元24小时后， 神经元内Glu浓度较对照组无显著差异， 神经元内Glu活性显著增强(P<0.05)， 神经元外Glu浓度较对照组显著性增加(P<0.05)见表1， 表2。
, 百拇医药
表1 海马培养神经元细胞内、 外Glu浓度的变化(±s nmol/mgpr n=6)
对照
CL
细胞内
细胞外
细胞内
细胞外
5分钟
32.22±5.66
0.42±0.22
37.15±6.01
, 百拇医药
1.16±0.64*
10分钟
31.89±5.69
0.69±0.36
36.54±6.81
2.67±1.34*
30分钟
32.36±5.34
2.03±0.56
35.27±5.92
4.72±1.55*
, 百拇医药
60分钟
32.19±5.13
3.98±1.01
33.76±5.22
6.75±2.03*
*P<0.05与对照组比较表2 海马培养神经元细胞内GAD活性的变化(±s IU/mgpr n=6)
对照
CL
5分钟
61.26±11.42
, 百拇医药
79.88±11.31*
10分钟
58.33±12.15
80.39±12.25*
30分钟
60.02±10.87
79.92±10.09*
60分钟
62.64±11.97
77.77±12.63*
*P<0.05与对照组比较
, 百拇医药
讨 论
Glu是脑内重要的兴奋性神经递质， Glu对中枢神经系统所有神经元均起兴奋作用， 使神经元放电[3]。 癫痫是一组神经元异常放电所致的中枢神经系统功能失常的症候群。 其发病机制认为与Glu、 天门冬氨酸(Asp)、 -氨基丁酸(GABA)、 甘氨酸(Gly)等氨基酸类神经递质失衡有关[4]。 这些递质的失衡使神经元异常放电， 神经元放电频率过高和无限制地向邻近神经元扩散， 导致癫痫发作[2]。
Glu脑内合成有4条途径： ①α-酮戊二酸经过转氨酶产生Glu； ②α-酮戊二酸经过谷氨酸脱氢酶逆反应产生Glu； ③鸟氨酸在鸟氨酸转氨酶的作用下生成Glu； ④谷氨酰胺在谷氨酰酶的作用下水解成Glu。 神经元合成的Glu既为神经递质， 又是物质代谢的中间产物[5]。 研究表明来自谷氨酰胺的Glu起递质作用， 而来自葡萄糖的Glu起代谢作用[5]。 现在发现Glu、 Asp、 GABA、 Gly等神经元合成分泌的酸性氨基酸大部分为神经递质[6]。 神经元合成的Glu除大部分分泌到神经元外， 部分经GAD脱羧生成GABA。
, 百拇医药
实验结果分析表明： 致痫剂CL使神经元内GAD活性显著增强， 神经元外(培养基)Glu浓度显著增高， 而神经元内Glu浓度没有显著性改变。 这说明痫性神经元合成Glu增强。 因为GAD活性增强说明神经元内Glu分解增强， 神经元外Glu浓度增高说明神经元分泌Glu增加。 只有神经元合成Glu增强， 才会保持神经内Glu浓度相对稳定。
致痫剂CL是当今广泛应用的较理想的实验性癫痫(癫痫大发作)工具药[7，8]。 其实验结果可科学地反应癫痫发病情况， 由此， 我们认为， 癫痫发病时， 癫性神经元合成、 分解Glu增强， Glu分泌增加。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39330210)
参考文献
1，Meldrum BS. Neurotransmisson in epilepsy. Epilepsia, 1995, 36(Suppl. 1)∶S30.
, 百拇医药
2，Meldrum BS. The role of glutamate in epilepsy and other CNS disorders. Neurology, 1994, 44(suppl 8)∶s14.
3，徐仁伵 兴奋性氨基酸与脑缺血损伤的研究概况. 国外医学神经病学神经外科学分册， 1998，25∶62.
4，解学孔主编. 癫痫病学. 第1版. 人民卫生出版社， 1995.86.
5，韩济生， 关新民主编. 医用神经生物学. 第1版. 武汉出版社， 1996. 119.
6，韩济生主编. 神经科学纲要. 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1993，339.
7，徐小平， 郭平， 宋玉如， 等. 马桑内酯对大鼠脑内-氨基丁酸和谷氨酸含量的影响. 华西医科大学学报， 1991，22∶213～215.
8，朱晓峰， 失长庚， 吴英杰. 马桑内酯对大鼠脑内-氨基丁酸酸及其受体结合力的影响. 中华医学杂志， 1995，75∶363～365.
(2000-02-12 收稿), http://www.100md.com
单位：胡元元(430030 武汉同济医科大学基础医学院生物化学研究室)；何善述(430030 武汉同济医科大学基础医学院生物化学研究室)；徐仁伵(同济医科大学协和医院神经内科)；张洪(同济医科大学协和医院神经内科)；童萼塘(同济医科大学协和医院神经内科)
关键词：癫痫；谷氨酸；谷氨酸脱羧酶；细胞培养；海马
脑与神经疾病杂志000605
摘 要 目的：研究神经元谷氨酸(Glu)合成、 分解和分泌与癫痫发病的关系。 方法： 用致痫剂马桑内酯(CL)处理培养大鼠海马神经元， 用高效液相色谱仪、 液体闪烁仪分别检测培养神经元内外Glu含量和神经元内谷氨酸脱羧酶(GAD)活性。 结果： 与对照组比较， CL致痫神经元内Glu浓度没有显著差异， 神经元外Glu浓度显著升高(P<0.05)， 神经元内GAD活性显著增高(P<0.05)。 结论： 癫病发病中， 痫性神经元Glu合成、 分解、 分泌增强。
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Study on the metabolism and secretion of gluntamate in kindle hippocampus neurons in vitro
Hu Yuanyuan, Xu Renshi, Zhang Hong, et al.
(Dept. of Biochemistry, Basic Medical Institute, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Objective To study the relationship between the metabolism of glutamate(Glu) in hippocampus neurons and the pathogenesis of epilepsy. Methods: The amount of Glu and glutamic decarboxylase (GAD) in coriaria lactone(CL) treated hippocampus neurons were detected by high performance liquid chromatograph(HPLC) and liquid-scintillation radioassary. Results: The amount of extracellular Glu and the activity of GAD in hippocampuas neurons treated with CL were markly higher than those in control group (P<0.05). Conclusions: During the attake of epilepsy, the Glu in kindle hippocampus neurons synthesis, secret and decompose increased, which may by the cause of epilepsy attack.
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Key words Epilepsy Glutamate Glutamic decarboxylase Cell culture Hippocampus
谷氨酸(Glu)作为一种重要的脑内兴奋性神经递质， 其与癫痫发病的关系， 已经得到广泛的关注。 国内外许多研究者通过多种实验动物模型和检测技术， 证实痫性病灶组织或/和组织间液Glu含量显著升高[1，2]。 本实验利用细胞培养技术观察致痫神经元Glu合成、 分解和分泌情况， 进一步探索痫性神经元Glu神经递质与癫痫发病的关系。
材料与方法
1. 主要试剂与仪器 Neurobasal/B27培养基， UL-14C Glu、 L-Glu标准品购自美国Sigma公司， 马桑内酯(CL)为中国华西医科大学制药厂产品。 Gilson 716型高效液相色谱议(HPLC)， 西安二六二厂FG型P-液体内烁计数仪。
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2. 大鼠海马神经元细胞培养 无菌取新生SD大鼠海马组织，0.125%胰酶消化1.5分钟。悬浮于含10%胎牛血清和20%小牛血清的DMEM/F12培养基中，按1×106细胞/ml接种于培养板，37℃5%CO2培养。第三天换培养基一次，第六天换无血清培养基后，随机分为2组，对照组(n=16)和CL处理组(n=16)。CL处理组加入100μmol/L CL培养24小时。收集两组细胞、细胞培养基，用于检测Glu和GAD。
3. 神经元内外Glu的检测 细胞培养时收集的细胞和细胞培养基加入等体积0.4mol/L HClO4，4℃ 12000g离心45分钟。取上清10μl与20pmol/L高丝氨酸10μl和100μl邻苯二甲醛混合，室温下准确反应2分钟。从中取10μl进样，流动相开始为35%甲醇和0.1mol/L pH 8.6 磷酸钠缓冲液，按流速1ml/min，甲醇比例每分钟增加2%进行梯度洗脱20分钟，以标准品曲线面积与高丝氨酸面积比进行定量。
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4. 神经元内GAD活性的测量 以GAD催化Glu生成游离CO2的量来反映GAD的活性， 取pH为6.8的磷酸钾缓冲液150μl放入EP管中(缓冲液含P-巯基乙醇、 磷酸吡哆醛、 L-Glu、 UL-14C Glu)， 将EP管放入闪烁瓶， 吸附有NaoH的擦镜纸亦放入瓶内封盖。 加入50μl细胞匀浆上清于EP管中， 37℃反应1小时， 加入50μl H2SO4中止反应， 37℃继续振摇30分钟， 取出EP管， 加入10ml闪烁液于瓶内， 于P-液体闪烁仪上读数。
5. 统计学处理 数据以“
±s”表示， 资料进行正态检验和方差齐性检验， 组间比较采用t检验， 检验水准α=0.05。结 果
数据统计分析结果表明， 资料呈正态分布， 方差齐。 100μmol/L CL处理大鼠海马培养神经元24小时后， 神经元内Glu浓度较对照组无显著差异， 神经元内Glu活性显著增强(P<0.05)， 神经元外Glu浓度较对照组显著性增加(P<0.05)见表1， 表2。
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表1 海马培养神经元细胞内、 外Glu浓度的变化(
±s nmol/mgpr n=6)对照
CL
细胞内
细胞外
细胞内
细胞外
5分钟
32.22±5.66
0.42±0.22
37.15±6.01
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1.16±0.64*
10分钟
31.89±5.69
0.69±0.36
36.54±6.81
2.67±1.34*
30分钟
32.36±5.34
2.03±0.56
35.27±5.92
4.72±1.55*
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60分钟
32.19±5.13
3.98±1.01
33.76±5.22
6.75±2.03*
*P<0.05与对照组比较表2 海马培养神经元细胞内GAD活性的变化(
±s IU/mgpr n=6)对照
CL
5分钟
61.26±11.42
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79.88±11.31*
10分钟
58.33±12.15
80.39±12.25*
30分钟
60.02±10.87
79.92±10.09*
60分钟
62.64±11.97
77.77±12.63*
*P<0.05与对照组比较
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讨 论
Glu是脑内重要的兴奋性神经递质， Glu对中枢神经系统所有神经元均起兴奋作用， 使神经元放电[3]。 癫痫是一组神经元异常放电所致的中枢神经系统功能失常的症候群。 其发病机制认为与Glu、 天门冬氨酸(Asp)、 -氨基丁酸(GABA)、 甘氨酸(Gly)等氨基酸类神经递质失衡有关[4]。 这些递质的失衡使神经元异常放电， 神经元放电频率过高和无限制地向邻近神经元扩散， 导致癫痫发作[2]。
Glu脑内合成有4条途径： ①α-酮戊二酸经过转氨酶产生Glu； ②α-酮戊二酸经过谷氨酸脱氢酶逆反应产生Glu； ③鸟氨酸在鸟氨酸转氨酶的作用下生成Glu； ④谷氨酰胺在谷氨酰酶的作用下水解成Glu。 神经元合成的Glu既为神经递质， 又是物质代谢的中间产物[5]。 研究表明来自谷氨酰胺的Glu起递质作用， 而来自葡萄糖的Glu起代谢作用[5]。 现在发现Glu、 Asp、 GABA、 Gly等神经元合成分泌的酸性氨基酸大部分为神经递质[6]。 神经元合成的Glu除大部分分泌到神经元外， 部分经GAD脱羧生成GABA。
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实验结果分析表明： 致痫剂CL使神经元内GAD活性显著增强， 神经元外(培养基)Glu浓度显著增高， 而神经元内Glu浓度没有显著性改变。 这说明痫性神经元合成Glu增强。 因为GAD活性增强说明神经元内Glu分解增强， 神经元外Glu浓度增高说明神经元分泌Glu增加。 只有神经元合成Glu增强， 才会保持神经内Glu浓度相对稳定。
致痫剂CL是当今广泛应用的较理想的实验性癫痫(癫痫大发作)工具药[7，8]。 其实验结果可科学地反应癫痫发病情况， 由此， 我们认为， 癫痫发病时， 癫性神经元合成、 分解Glu增强， Glu分泌增加。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39330210)
参考文献
1，Meldrum BS. Neurotransmisson in epilepsy. Epilepsia, 1995, 36(Suppl. 1)∶S30.
, 百拇医药
2，Meldrum BS. The role of glutamate in epilepsy and other CNS disorders. Neurology, 1994, 44(suppl 8)∶s14.
3，徐仁伵 兴奋性氨基酸与脑缺血损伤的研究概况. 国外医学神经病学神经外科学分册， 1998，25∶62.
4，解学孔主编. 癫痫病学. 第1版. 人民卫生出版社， 1995.86.
5，韩济生， 关新民主编. 医用神经生物学. 第1版. 武汉出版社， 1996. 119.
6，韩济生主编. 神经科学纲要. 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1993，339.
7，徐小平， 郭平， 宋玉如， 等. 马桑内酯对大鼠脑内-氨基丁酸和谷氨酸含量的影响. 华西医科大学学报， 1991，22∶213～215.
8，朱晓峰， 失长庚， 吴英杰. 马桑内酯对大鼠脑内-氨基丁酸酸及其受体结合力的影响. 中华医学杂志， 1995，75∶363～365.
(2000-02-12 收稿), http://www.100md.com