铁对大鼠黑质神经递质影响的初步研究
作者：曹学兵 孙圣刚 童萼塘 徐岩 杨卉
单位：曹学兵(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)；孙圣刚(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)；童萼塘(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)；徐岩(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)；杨卉(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)
关键词：铁/亚铁离子；神经递质；黑质；大鼠
脑与神经疾病杂志000602 摘 要 目的：探讨Fe3+/Fe2+对大鼠黑质神经递质影响。 方法： 黑质内分别注射FeCl3、FeCl2和6-羟多巴胺(6-OHDA)， 四周后应用阿朴吗啡诱发旋转行为、 高压液相色谱分析检测黑质内多巴胺、 去甲肾上腺素、 肾上腺素和5-羟色胺水平。 结果： 注射FeCl3的大鼠出现向损毁同侧的旋转行为； 注射FeCl3和FeCl2侧黑质内多巴胺水平显著降低， 去甲肾上腺素、 肾上腺素和5-羟色胺水平不受影响。 结论： Fe3+/Fe2+对大鼠黑质多巴胺能神经元具有特异性的毒性作用。
, 百拇医药
Primary study the effect of Fe3+/Fe2+ on neurotransmitters in nigra with rats.
Cao Xuebing,Sun Shenggang,Tong Eatang, et al
(The Department of Neurology,the Union Affiliated Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022)
Abstract Objective： To explore the effect of Fe3+/Fe2+ on neurotransmitters in nigra with rats. Methods: Injecting FeCl3, FeCl2 and 6-OHDA respectively to nigra and applying apomorphine-induced rotation in 4 week after operation, we analyzed the levels of dopamine (DA), adrenalin(A), non-adrenalin (NA) and serotonin (5-HT) by high performance liquid chromatograhpy (HPLC). Results:The rats occurred rotational behavior to ipsilateral side of intranigral FeCl3 injection; the DA level of FeCl3 and FeCl2 injection side reduced significantly (P<0.01), the A, NA and 5-HT were uneffected. Conclusion: Fe3+/Fe2+ had specific toxic effect on dopaminergic neuron in nigra.
, 百拇医药
Key words Ferric/Ferrous-ion Neurotransmitter Nigra Rats
帕金森病(Parkinson disease,PD)是老年人常见的一种以黑质纹 状体区多巴胺(DA)能神经元进行性缺失为特征的中枢神经系统变性疾病。 其确切的发病机制仍不清楚。 大量影像学及生化分析研究表明PD中黑质致密区内铁水平增高。 这些研究都倾向于认为黑质致密区内铁水平的升高是神经元变性的继发事件[1，2]。 那么， 增高的Fe3+/Fe2+对这一区域的各种神经递质有何影响呢? 本文就此进行探讨。
材 料 与 方 法
一、 实验分组
成年SD大鼠， 雌雄不拘， 体重200～250g， 由同济医科大学实验动物学部提供。 大鼠分为4组： FeCl3注射组(FeCl3.6H2O， 10μg/μl)、 FeCl2注射组(FeCl2*6H2O，10μg/μl)、 6-羟多巴胺(6-OHDA)注射组(2μg/μl)和盐水注射对照组。 其中FeCl3注射组、 FeCl2注射组和盐水注射对照组各12只、 6-OHDA注射组为选取制备成功的偏侧PD模型者6只。
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二、 偏侧黑质内注射铁和6-OHDA的操作步骤
用10%水合氯醛行腹腔麻醉(450mg/kg i.p)， 麻醉成功后， 将鼠放置于位体定位仪上， 前端套齿、 两侧耳凿固定头部。 刮除头顶毛发， 剪刀沿头尾方向剪开头皮， 暴露出头盖骨， 蘸取双氧水擦拭头盖骨， 使前囟暴露清晰(即纵横骨缝的交点)。 根据Paxson《The Rat Brain》图谱， 用微量注射器向右侧黑质注射FeCl3、 FeCl2、 6-OHDA和盐水。 注射部位的坐标为： 门齿棒高于耳杆2mm， 前囟后4.3mm， 中线右旁开1.5mm， 颅内表面下8.5mm。 用5μl微量注射器， 每点注射上述物质各5μl， 在5分钟内注射完毕然后留置10分钟， 缓慢拔针， 缝合皮肤， 放入笼中喂养。 对照组只向脑内注射入经盐酸调整PH值后的0.9%生理盐水。 手术完毕， 麻醉醒后观察大鼠行为的改变； 手术后四周， 用阿朴吗啡(0.5mg/kg,ip)诱导试验动物向一侧旋转， 每次记录40分钟内的旋转圈数， 结果以圈/分表示。
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三、 脑组织标本的处理 待动物行为学观察完后， 在深度麻醉下断头取鼠脑， 冰盘上分离黑质区域称重脑组织， 以10μg/μl加入0.32M蔗糖， 然后用匀浆器匀浆， 直接取上清液150μl， 加入等量的0.4M高氯酸， 混匀， 离心1400rpm×3min， 取上清待检。
四、 脑组织内神经递质含量的测定
仪器： 采用Gilson 116型高效液相色谱仪(HPLC)， C18反相柱4.6mm×100mm， 粒度5μm， 紫外检测器。 试剂： 去甲肾上腺素(noradrenaline，NA)， 肾上腺素(adrenaline，A)， 多巴胺(dopamine,DA)， 5-羟色胺(serotonin,5-HT)均购自Sigma或Fluka公司； 甲醇为色谱级， 其余试剂均为AR规格。 试剂用水均为亚沸重蒸馏水。 上述标准样品用0.1M高氯酸(内含0.1%半胱氨酸)配成浓度为1μg/μl的储存液， 分析时用洗脱液稀释至0.1μg/μl。 色谱条件： 进样量为20μl， 以0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.2)和甲醇为流动相， 洗脱时甲醇与缓冲液的比例为7∶93， 流速为0.8ml/min， 约25min洗脱结束， 打印出洗脱曲线。 结果以μg/g脑湿重表示。
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五、 统计学分析 脑组织内NA、 A、DA和5-HT含量的分析用小样本t-检验和多样本均数方差分析。 数值均以平均值标准差表示。 统计显著性意义设定为P<0.05。
结 果
一、 行为学的改变
FeCl2组的大鼠在麻醉醒后出现自发的向对侧旋转， 特别是撩抖时(如拍击笼子)， 当握住鼠尾提起时出现大鼠头朝向对侧弯曲身体。 大鼠这种行为的改变持续7～10天。 FeCl3组、 6-OHDA组和盐水组的大鼠不出现这一特殊行为。 术后4周时进行阿朴吗啡诱导旋转试验， 发现注射FeCl3组大鼠出现了不同程度的向手术同侧旋转的行为， 6-OHDA组出现 不同程度的向手术对侧旋转的行为， 而注射FeCl2组和盐水组的大鼠不出现旋转行为。
二、 各组黑质内DA、 NA、 A和5-HT水平的变化
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盐水组注射侧与健侧比较， 两侧的DA、 NA、 A和5-HT水平无显著性差异(P>0.05)； FeCl2组和FeCl3组注射侧分别与健侧比较， 注射侧DA水平都显著低于健侧(P<0.01)， 两侧的NA、 A和5-HT水平比较， 差异均无显著性意义(P>0.05)； 6-OHDA组注射侧与健侧比较， 注射侧DA、 5-HT水平显著低于健侧(P<0.01)， 两侧的NA、 A和5-HT水平比较， 差异均无显著性意义(P>0.05)， FeCl2组和FeCl3组注射侧分别与6-OHDA组注射侧比较， 6-OHDA组注射侧DA、 5-HT水平都显著低于健侧(P<0.01)， 而两侧NA和A的水平差异均无显著性意义(P>0.05)。 详见表1。
表1 黑质内注射FeCl2、FeCl3及6-OHDA后DA、NA、A和5-HT水平的变化(
±s)
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Uninfused健侧
infused注射侧
FeCl3
FeCl2
6-OHDA
vehicle盐水
DA
13.06±1.59
5.66±3.78*
6.24±2.69*
1.78±0.55**
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13.28±1.66
NA
97.00±12.92
96.12±12.27
100.05±10.93
94.12±11.34
97.98±14.99
A
64.69±8.51
67.57±2.19
65.44±8.33
61.45±7.88
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64.09±20.56
5-HT
68.46±8.92
62.66±9.71
61.96±9.51
32.72±8.78**
68.64±8.95
*P<0.01 compared uninfused with infused in each group.各组注射侧与健侧比较，*P<0.01
**P<0.01 compared with FeCl3 group. 与FeCl3组比较，**P<0.01表2 FeCl3组大鼠行为改变与递质水平间的相关性(±s)
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DA
NA
A
5-HT
uninfused
<5圈
13.22±1.77
101.28±9.18
70.18±9.18
63.45±9.54
健侧
≥5圈
12.67±1.15
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95.60±10.21
63.88±7.73
67.99±4.56
infused
<5圈
7.54±1.551)
102.18±10.33
62.94±9.74
64.92±9.35
注射侧
≥5圈
2.77±1.692)3)
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94.37±12.54
59.40±10.34
66.82±6.10
1)P<0.05，2)P<0.01 compared with uninfused.与健侧比较，1)P<0.05 2)P<0.01；
3)P<0.01 compared with <5ring/min；<5圈者比较，3)P<0.01
三、 FeCl3组行为改变与递质水平间的相关性、两侧比较， 注射侧DA水平显著低于健侧； 旋转圈数≥5圈者， 健侧DA水平之间差异无显著性意义(P>0.05),注射侧DA水平之间差异有显著性意义(P<0.01)， 见表2。
讨 论
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铁是一种人体完成诸项生理机能所必须的过渡性金属元素， 它一般有两种价态即Fe2+和Fe3+， 并随电子的得失而相互转化。 PD是以黑质(SN)出现多巴胺能细胞变性为特征的疾病。 虽然提出了许多假说， 但是变性的真正原因仍不清楚。 最近[3，4]， 一些学者发现PD黑质存在氧化应激和铁水平升高。 铁水平升高能催化活性羟自由基的产生从而导致细胞死亡。 越来越多的证据显示它是PD致病过程中非常重要的因素。 但是， 铁如何吸收到PD黑质的机制尚不清楚。
诸多证据表明黑质内铁积聚不仅是PD病程中的伴随现象， 它还直接作用于PD神经变性的发展[5]。 本试验发现， 黑质内注射FeCl2的大鼠出现向对侧的旋转行为， 这种现象可能揭示同侧黑质纹状体DA能神经元的功能亢进。 Hironishi等[6]已发现用50mmol/L的FeCl2处理的大鼠出现自发性向注射侧旋转。 他们的发现与我们的结果一致， 他们认为向对侧转是由于在黑质纹状体神经元的神经末梢区DA释放增加， 象3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、DOPAC/DA比明显增高。 虽然神经元功能亢进的确切机制尚不清， 但据推测可能是氧自由基如OH对特定神经元群的活动造成了影响所致。
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Ben Shanchar[7]运用立体定位仪将50μg的Fe3+直接注射大鼠黑质内， 3周后出现了PD类似的行为学改变及同侧DA及其代谢产物DOPAC和高香草酸(HVA)浓度的显著下降。 本试验中注射FeCl3组在术后4周经阿朴吗啡诱发下出现了向损害同侧的旋转行为； 与旋转圈数在5圈以下的大鼠比较， 5圈以上的大鼠损害侧黑质内的DA水平显著降低(P<0.01)。 此结果表明损害侧DA水平的降低程度与大鼠旋转行为有密切的关系。 为什么注射铁后出现的行为改变不同于6-OHDA呢? 虽然黑质内注射铁引起同侧旋转行为的机制尚不清楚， 但是几个研究表明[8，9]， 当用电解或神经毒素损害黑质致密部(SNc)和黑质网状部(SNr)时， 出现的自发性和阿朴吗啡诱发的旋转行为的方向不同于6-OHDA仅损害SNc时的方向。 因此， 很可能SNr的非-DA神经元参与了旋转行为， 这不同于黑质纹状体-DA神经元的方式。 在本研究中，黑质SNr中高铁(由于注射铁)可能诱发神经元缺失或SNr的功能失调， 而它可能是与阿朴吗啡引起的同侧旋转行为有关。 本组资料中， 注射FeCl2组在术后4周经阿朴吗啡诱发下未出现了旋转行为， 我们推测可能与注射FeCl2的量有一定的关系， 这有待今后深入性的研究加以证实。
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本研究发现， 黑质内注射Fe2+和Fe3+都能对DA水平造成显著的影响， 使注射侧脑组织内DA水平降低，而对A、NA和5-HT的水平无明显影响。 本研究还证实了6-OHDA不仅能影响DA水平， 而且对5-HT水平也有影响。 上述结果表明铁对DA能神经元具有特异性的毒害作用， 但是显然不能完全用氧化损伤途径所能解释， 而可能涉及铁与黑色素的相互作用。 绝大多数DA能神经元含有黑色。 正常生理条件下， 黑色素作为一种抗氧化物， 与Fe3+结合使其处于氧化态而不具活性。 但PD中游离Fe3+浓度升高时， 它可大量的与Fe3+结合并将其降解为Fe2+， Fe2+与黑色素亲和力低，释入胞浆后通过Fenton反应生成了OH-。 现有报道说PD中Fe2+：Fe3+的比率由正常时的3∶1降至1∶1[10]， 这支持铁螯合剂黑色素存在时Fe3+被还原为Fe2+从而自由基生成的观点。 此时的黑色素为铁选择性集聚及铁还原提供了良好的场所。 这点也很好的解释了为什么PD中含黑色素DA能神经元会选择性变性。 另外还可能与铁与DA的相互作用有关。 6-OHDA是DA的一种毒性衍生物， 人们通过大量的实验已证实将6-OHDA直接注入黑质内可诱发PD， 并将其作为一种常规的PD实验动物制模方法广为应用。 现有一些资料表明这种毒性复合物可在体内通过铁催化的DA氧化作用生成而可能有内源性毒素作用[11]。 这无疑为PD中铁病理作用的研究提供了一个全新的思路。
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总之， 本试验对不同价态铁对大鼠黑质区域神经递质影响的初步研究表明， 高铁对大鼠的行为有着显著的影响、 对DA能神经元具有特异性的毒害作用， 这为我们认识PD中黑质铁聚集的意义提供了生化改变的线索。
本课题系国家教委统招博士研究生课题基金资助
参考文献
1，Temlett JA, Landsberg JP, Watt F, et al. Increase iron in the substania nigra compacta of the MPTP-lesioned hemiparkinsonian African green monkey: evidence from proton microprobe elemental microanalysis. J Neurochem, 1994;62∶134～146.
, 百拇医药 2，He Y, Thong PSP, Lee T, et al. Increase iron in the substantia nigra of 6-OHDA induced parkinsonian rats: a nuclear microscopy study. Brain Res, 1996;735∶149～153.
3，Oalnow CW, Youdim MBH. Iron and neurodegeneration: prospects for neuroprotection. Neurodegeneration and neuroprotection in Parkinson's disease. 1996;55～67.
4，Sofic E, Paulus W, Jellinger K, et al. Selective increase of iron in substantia nigra zona compata of parkinsonianbrains. J Neurochem,1991;56∶978～982.
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5，He Y, Lee T, Leong SK. Time course of dopaminergic cell death and changes in iron, ferritin and transferrin level in the rat substantia nigra after 6-OHDA lesioning. Free Radic Res, 1999;31(2)∶103～112.
6，Hironishi M, Ueyama E, Senba E. Systematic expression of immediated early genes and intensive astrocyte activation induced by intrastriatal ferrous iron injection. Brain Res 1999 May 15∶828(1～2)∶145～53.
7，Ben-Shachar D, Youdim MBH. Intranigral iron injection induces behaviral and biochemical `parkinsonism' in rats. J Neurochem, 1991;57∶2133～2135.
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8，Levt A, G.J.Kant,J.L.meyerhoff, et al. Non-cholinergic neurotoxic effects of AF64A in the substantia nigra. Brain Res. 1984;305∶169～172。
9，Ungerstedt, U, and G.W. arsuthnott. Quantitative recording or rotational behavior in rats after 6-hydroxydopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 1970;24∶485～493.
10，Gold R, Lenox RH. Is there a rationale for iron supplementation in the treatment of Akathisia? J Clin Psychiatry, 1995;56∶4764.
11，Jellinger K, Linert L, Kienzi E, et al. Chemical evidence for 6-OHDA to be an endogenous toxic factor in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neural Transm, 1995;46(Suppl)∶293～310.
(2000-6-2收稿), 百拇医药
单位：曹学兵(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)；孙圣刚(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)；童萼塘(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)；徐岩(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)；杨卉(430022 同济医科大学附属协和医院神经内科帕金森病研究组)
关键词：铁/亚铁离子；神经递质；黑质；大鼠
脑与神经疾病杂志000602 摘 要 目的：探讨Fe3+/Fe2+对大鼠黑质神经递质影响。 方法： 黑质内分别注射FeCl3、FeCl2和6-羟多巴胺(6-OHDA)， 四周后应用阿朴吗啡诱发旋转行为、 高压液相色谱分析检测黑质内多巴胺、 去甲肾上腺素、 肾上腺素和5-羟色胺水平。 结果： 注射FeCl3的大鼠出现向损毁同侧的旋转行为； 注射FeCl3和FeCl2侧黑质内多巴胺水平显著降低， 去甲肾上腺素、 肾上腺素和5-羟色胺水平不受影响。 结论： Fe3+/Fe2+对大鼠黑质多巴胺能神经元具有特异性的毒性作用。
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Primary study the effect of Fe3+/Fe2+ on neurotransmitters in nigra with rats.
Cao Xuebing,Sun Shenggang,Tong Eatang, et al
(The Department of Neurology,the Union Affiliated Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022)
Abstract Objective： To explore the effect of Fe3+/Fe2+ on neurotransmitters in nigra with rats. Methods: Injecting FeCl3, FeCl2 and 6-OHDA respectively to nigra and applying apomorphine-induced rotation in 4 week after operation, we analyzed the levels of dopamine (DA), adrenalin(A), non-adrenalin (NA) and serotonin (5-HT) by high performance liquid chromatograhpy (HPLC). Results:The rats occurred rotational behavior to ipsilateral side of intranigral FeCl3 injection; the DA level of FeCl3 and FeCl2 injection side reduced significantly (P<0.01), the A, NA and 5-HT were uneffected. Conclusion: Fe3+/Fe2+ had specific toxic effect on dopaminergic neuron in nigra.
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Key words Ferric/Ferrous-ion Neurotransmitter Nigra Rats
帕金森病(Parkinson disease,PD)是老年人常见的一种以黑质纹 状体区多巴胺(DA)能神经元进行性缺失为特征的中枢神经系统变性疾病。 其确切的发病机制仍不清楚。 大量影像学及生化分析研究表明PD中黑质致密区内铁水平增高。 这些研究都倾向于认为黑质致密区内铁水平的升高是神经元变性的继发事件[1，2]。 那么， 增高的Fe3+/Fe2+对这一区域的各种神经递质有何影响呢? 本文就此进行探讨。
材 料 与 方 法
一、 实验分组
成年SD大鼠， 雌雄不拘， 体重200～250g， 由同济医科大学实验动物学部提供。 大鼠分为4组： FeCl3注射组(FeCl3.6H2O， 10μg/μl)、 FeCl2注射组(FeCl2*6H2O，10μg/μl)、 6-羟多巴胺(6-OHDA)注射组(2μg/μl)和盐水注射对照组。 其中FeCl3注射组、 FeCl2注射组和盐水注射对照组各12只、 6-OHDA注射组为选取制备成功的偏侧PD模型者6只。
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二、 偏侧黑质内注射铁和6-OHDA的操作步骤
用10%水合氯醛行腹腔麻醉(450mg/kg i.p)， 麻醉成功后， 将鼠放置于位体定位仪上， 前端套齿、 两侧耳凿固定头部。 刮除头顶毛发， 剪刀沿头尾方向剪开头皮， 暴露出头盖骨， 蘸取双氧水擦拭头盖骨， 使前囟暴露清晰(即纵横骨缝的交点)。 根据Paxson《The Rat Brain》图谱， 用微量注射器向右侧黑质注射FeCl3、 FeCl2、 6-OHDA和盐水。 注射部位的坐标为： 门齿棒高于耳杆2mm， 前囟后4.3mm， 中线右旁开1.5mm， 颅内表面下8.5mm。 用5μl微量注射器， 每点注射上述物质各5μl， 在5分钟内注射完毕然后留置10分钟， 缓慢拔针， 缝合皮肤， 放入笼中喂养。 对照组只向脑内注射入经盐酸调整PH值后的0.9%生理盐水。 手术完毕， 麻醉醒后观察大鼠行为的改变； 手术后四周， 用阿朴吗啡(0.5mg/kg,ip)诱导试验动物向一侧旋转， 每次记录40分钟内的旋转圈数， 结果以圈/分表示。
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三、 脑组织标本的处理 待动物行为学观察完后， 在深度麻醉下断头取鼠脑， 冰盘上分离黑质区域称重脑组织， 以10μg/μl加入0.32M蔗糖， 然后用匀浆器匀浆， 直接取上清液150μl， 加入等量的0.4M高氯酸， 混匀， 离心1400rpm×3min， 取上清待检。
四、 脑组织内神经递质含量的测定
仪器： 采用Gilson 116型高效液相色谱仪(HPLC)， C18反相柱4.6mm×100mm， 粒度5μm， 紫外检测器。 试剂： 去甲肾上腺素(noradrenaline，NA)， 肾上腺素(adrenaline，A)， 多巴胺(dopamine,DA)， 5-羟色胺(serotonin,5-HT)均购自Sigma或Fluka公司； 甲醇为色谱级， 其余试剂均为AR规格。 试剂用水均为亚沸重蒸馏水。 上述标准样品用0.1M高氯酸(内含0.1%半胱氨酸)配成浓度为1μg/μl的储存液， 分析时用洗脱液稀释至0.1μg/μl。 色谱条件： 进样量为20μl， 以0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.2)和甲醇为流动相， 洗脱时甲醇与缓冲液的比例为7∶93， 流速为0.8ml/min， 约25min洗脱结束， 打印出洗脱曲线。 结果以μg/g脑湿重表示。
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五、 统计学分析 脑组织内NA、 A、DA和5-HT含量的分析用小样本t-检验和多样本均数方差分析。 数值均以平均值标准差表示。 统计显著性意义设定为P<0.05。
结 果
一、 行为学的改变
FeCl2组的大鼠在麻醉醒后出现自发的向对侧旋转， 特别是撩抖时(如拍击笼子)， 当握住鼠尾提起时出现大鼠头朝向对侧弯曲身体。 大鼠这种行为的改变持续7～10天。 FeCl3组、 6-OHDA组和盐水组的大鼠不出现这一特殊行为。 术后4周时进行阿朴吗啡诱导旋转试验， 发现注射FeCl3组大鼠出现了不同程度的向手术同侧旋转的行为， 6-OHDA组出现 不同程度的向手术对侧旋转的行为， 而注射FeCl2组和盐水组的大鼠不出现旋转行为。
二、 各组黑质内DA、 NA、 A和5-HT水平的变化
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盐水组注射侧与健侧比较， 两侧的DA、 NA、 A和5-HT水平无显著性差异(P>0.05)； FeCl2组和FeCl3组注射侧分别与健侧比较， 注射侧DA水平都显著低于健侧(P<0.01)， 两侧的NA、 A和5-HT水平比较， 差异均无显著性意义(P>0.05)； 6-OHDA组注射侧与健侧比较， 注射侧DA、 5-HT水平显著低于健侧(P<0.01)， 两侧的NA、 A和5-HT水平比较， 差异均无显著性意义(P>0.05)， FeCl2组和FeCl3组注射侧分别与6-OHDA组注射侧比较， 6-OHDA组注射侧DA、 5-HT水平都显著低于健侧(P<0.01)， 而两侧NA和A的水平差异均无显著性意义(P>0.05)。 详见表1。
表1 黑质内注射FeCl2、FeCl3及6-OHDA后DA、NA、A和5-HT水平的变化(
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Uninfused健侧
infused注射侧
FeCl3
FeCl2
6-OHDA
vehicle盐水
DA
13.06±1.59
5.66±3.78*
6.24±2.69*
1.78±0.55**
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13.28±1.66
NA
97.00±12.92
96.12±12.27
100.05±10.93
94.12±11.34
97.98±14.99
A
64.69±8.51
67.57±2.19
65.44±8.33
61.45±7.88
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64.09±20.56
5-HT
68.46±8.92
62.66±9.71
61.96±9.51
32.72±8.78**
68.64±8.95
*P<0.01 compared uninfused with infused in each group.各组注射侧与健侧比较，*P<0.01
**P<0.01 compared with FeCl3 group. 与FeCl3组比较，**P<0.01表2 FeCl3组大鼠行为改变与递质水平间的相关性(
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DA
NA
A
5-HT
uninfused
<5圈
13.22±1.77
101.28±9.18
70.18±9.18
63.45±9.54
健侧
≥5圈
12.67±1.15
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95.60±10.21
63.88±7.73
67.99±4.56
infused
<5圈
7.54±1.551)
102.18±10.33
62.94±9.74
64.92±9.35
注射侧
≥5圈
2.77±1.692)3)
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94.37±12.54
59.40±10.34
66.82±6.10
1)P<0.05，2)P<0.01 compared with uninfused.与健侧比较，1)P<0.05 2)P<0.01；
3)P<0.01 compared with <5ring/min；<5圈者比较，3)P<0.01
三、 FeCl3组行为改变与递质水平间的相关性、两侧比较， 注射侧DA水平显著低于健侧； 旋转圈数≥5圈者， 健侧DA水平之间差异无显著性意义(P>0.05),注射侧DA水平之间差异有显著性意义(P<0.01)， 见表2。
讨 论
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铁是一种人体完成诸项生理机能所必须的过渡性金属元素， 它一般有两种价态即Fe2+和Fe3+， 并随电子的得失而相互转化。 PD是以黑质(SN)出现多巴胺能细胞变性为特征的疾病。 虽然提出了许多假说， 但是变性的真正原因仍不清楚。 最近[3，4]， 一些学者发现PD黑质存在氧化应激和铁水平升高。 铁水平升高能催化活性羟自由基的产生从而导致细胞死亡。 越来越多的证据显示它是PD致病过程中非常重要的因素。 但是， 铁如何吸收到PD黑质的机制尚不清楚。
诸多证据表明黑质内铁积聚不仅是PD病程中的伴随现象， 它还直接作用于PD神经变性的发展[5]。 本试验发现， 黑质内注射FeCl2的大鼠出现向对侧的旋转行为， 这种现象可能揭示同侧黑质纹状体DA能神经元的功能亢进。 Hironishi等[6]已发现用50mmol/L的FeCl2处理的大鼠出现自发性向注射侧旋转。 他们的发现与我们的结果一致， 他们认为向对侧转是由于在黑质纹状体神经元的神经末梢区DA释放增加， 象3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、DOPAC/DA比明显增高。 虽然神经元功能亢进的确切机制尚不清， 但据推测可能是氧自由基如OH对特定神经元群的活动造成了影响所致。
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Ben Shanchar[7]运用立体定位仪将50μg的Fe3+直接注射大鼠黑质内， 3周后出现了PD类似的行为学改变及同侧DA及其代谢产物DOPAC和高香草酸(HVA)浓度的显著下降。 本试验中注射FeCl3组在术后4周经阿朴吗啡诱发下出现了向损害同侧的旋转行为； 与旋转圈数在5圈以下的大鼠比较， 5圈以上的大鼠损害侧黑质内的DA水平显著降低(P<0.01)。 此结果表明损害侧DA水平的降低程度与大鼠旋转行为有密切的关系。 为什么注射铁后出现的行为改变不同于6-OHDA呢? 虽然黑质内注射铁引起同侧旋转行为的机制尚不清楚， 但是几个研究表明[8，9]， 当用电解或神经毒素损害黑质致密部(SNc)和黑质网状部(SNr)时， 出现的自发性和阿朴吗啡诱发的旋转行为的方向不同于6-OHDA仅损害SNc时的方向。 因此， 很可能SNr的非-DA神经元参与了旋转行为， 这不同于黑质纹状体-DA神经元的方式。 在本研究中，黑质SNr中高铁(由于注射铁)可能诱发神经元缺失或SNr的功能失调， 而它可能是与阿朴吗啡引起的同侧旋转行为有关。 本组资料中， 注射FeCl2组在术后4周经阿朴吗啡诱发下未出现了旋转行为， 我们推测可能与注射FeCl2的量有一定的关系， 这有待今后深入性的研究加以证实。
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本研究发现， 黑质内注射Fe2+和Fe3+都能对DA水平造成显著的影响， 使注射侧脑组织内DA水平降低，而对A、NA和5-HT的水平无明显影响。 本研究还证实了6-OHDA不仅能影响DA水平， 而且对5-HT水平也有影响。 上述结果表明铁对DA能神经元具有特异性的毒害作用， 但是显然不能完全用氧化损伤途径所能解释， 而可能涉及铁与黑色素的相互作用。 绝大多数DA能神经元含有黑色。 正常生理条件下， 黑色素作为一种抗氧化物， 与Fe3+结合使其处于氧化态而不具活性。 但PD中游离Fe3+浓度升高时， 它可大量的与Fe3+结合并将其降解为Fe2+， Fe2+与黑色素亲和力低，释入胞浆后通过Fenton反应生成了OH-。 现有报道说PD中Fe2+：Fe3+的比率由正常时的3∶1降至1∶1[10]， 这支持铁螯合剂黑色素存在时Fe3+被还原为Fe2+从而自由基生成的观点。 此时的黑色素为铁选择性集聚及铁还原提供了良好的场所。 这点也很好的解释了为什么PD中含黑色素DA能神经元会选择性变性。 另外还可能与铁与DA的相互作用有关。 6-OHDA是DA的一种毒性衍生物， 人们通过大量的实验已证实将6-OHDA直接注入黑质内可诱发PD， 并将其作为一种常规的PD实验动物制模方法广为应用。 现有一些资料表明这种毒性复合物可在体内通过铁催化的DA氧化作用生成而可能有内源性毒素作用[11]。 这无疑为PD中铁病理作用的研究提供了一个全新的思路。
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总之， 本试验对不同价态铁对大鼠黑质区域神经递质影响的初步研究表明， 高铁对大鼠的行为有着显著的影响、 对DA能神经元具有特异性的毒害作用， 这为我们认识PD中黑质铁聚集的意义提供了生化改变的线索。
本课题系国家教委统招博士研究生课题基金资助
参考文献
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(2000-6-2收稿), 百拇医药