口腔变形链球菌耐氟菌株的产生
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国外医学口腔医学分册 2000年1月第27卷第1期
口腔变形链球菌耐氟菌株的产生
上海第二医科大学口腔医学院 盛江筠(综述) 刘正(审校)
摘 要 氟化物的广泛应用可能导致变形链球菌耐氟菌株的产生。为了解变形链球菌耐氟菌株的致龋毒力变化，国外学者对耐氟变形链球菌的粘附、产酸、及脱矿等致龋特性进行了研究，并对耐氟菌株产生机制予以探讨。本文就目前研究现状作一综述。
关键词：氟化物 变形链球菌 耐氟菌株
氟化物为行之有效并广为采用的防龋药物。而多种氟化物制剂经常广泛使用很可能有耐氟菌株选择性生长[1]。已有学者在体内及体外获得耐氟变链菌株，并对其致龋毒力进行了系列研究[2，3]。本文就其研究现状作一综述。
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1 耐氟菌株的诱导
耐氟菌株(fluoride-resistant strains,FRS)具有比野生菌株更强的耐氟性，即可以在高于自身氟耐受水平的氟化物中生存。氟耐受可分为表型与基因型两种。前者当细菌离开高氟环境后，耐氟性消失；而后者在无氟培养基中传代多次，仍保持其原有耐氟水平[3]。至今没有关于基因型氟耐爱的确切定义。van Loveren将其定义为在无氟培养基中连续传代20次，细菌耐氟性不消失[4]。
耐氟菌株可从体内及体外两种途径获得。Brown等最初从肿瘤放疗后，每天使用1%NaF凝胶预防猛性龋的患者口腔中分离出可耐受300 ppm和600 ppm的耐氟变菌株(变链菌自身氟耐受水平为100～150 ppm)，并发现随氟化钠凝胶使用时间的延长，菌斑中耐氟变链菌株的比例上升，菌斑产酸能力下降[5]。此后，又有多数人从干燥症患者口腔中分离出耐氟变链菌株[6]。虽然活体内预防水平氟化物的应用并未检测出耐氟菌株的存在[7]，但高浓度氟化物导致干燥症患者口腔中耐氟株产生的事实，提示正常人群中耐氟菌株产生的可能性。
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为研究耐氟菌株致龋特征，并与亲代野生菌株进行横向比较，多采用体外诱导方法获得稳定传代的耐氟突变株。最初有学者利用紫外线照射获得耐氟菌株，但这种方法与体内突变株自然产生过程相差甚远。随后，有人采用培养基中增加氟化物浓度的方法诱导变链菌自发产生耐氟突变株[2，8]。Brussock等[8]在THA固体培养基中加入不同浓度氟化钠(0～1000 μg/ml,以50 μg/ml递增)，将变链菌GS-5由含有低浓度氟化钠的THA中逐步转种至含有高浓度氟化钠的THA中，遂得到稳定耐氟菌株。而van Loveren等[4]则将变逻菌C180-2直接由无氟培养基转种至含有1000 μg/ml NaF的蔗糖琼脂平板，获得单个耐氟菌落，并能稳定传代培养。
2 耐氟菌株的致龋特征
2.1 耐氟菌株的粘附能力
, 百拇医药 氟化物可通过改变釉质表面吸附性，作用于唾液获得性膜上某些基团及减少细菌胞外多糖合成而影响变逻菌蔗糖非依赖性粘附及蔗糖依赖性粘附[9]。变链菌耐氟突变后，其粘附特性发生改变。Streckfuss等[10]研究发现，远缘链球菌6715耐氟突变株的蔗糖依赖性粘附力较亲代菌株下降。动物实验中，变链菌C180-2而氟菌株C180-2FR在与亲代菌株共同定居至大鼠牙齿表面时，其竞争力减弱，且无法在已有亲代菌株定居的牙面上生长[4]。但最近研究有不同发现，Hoelscher等[2]在对变链菌UA130及其耐氟突变株的体外研究中发现，耐氟菌株具有与亲代菌株相同的竞争粘附至唾液包被羟磷灰石珠上的能力。
2.2 耐氟菌株的产酸能力
已证实氟化物可通过多种机制抑制变链菌产酸[11]。许多学者在对变链菌耐氟菌株产酸力的研究中发现，耐氟菌株的产酸速度较亲代野生菌株减慢，无论有无氟化物存在，耐氟菌株皆无法将牙面pH值降至临界pH5.5以下[12，13]。由此推论，变链菌耐氟菌株不可能单独导致牙齿龋坏。这可以很好地解释干燥症患者口腔中，虽然变链菌及乳杆菌数目占有优势，但龋齿的进展却受到控制。
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近年，Van Loveren等[14]在体外通过连续培养技术，对不同pH条件下细菌产酸速度进行比较，发现变链菌耐氟菌株在pH≥6.0时，产酸速度小于亲代株，而当pH6.0～4.5时，产酸速度却大于亲代株。因活体内变链菌自发耐氟突变发生在部分菌株，耐氟菌株所占比例不超过变链菌总量的35%[5]。由此推测，含有混合变链菌群体的牙菌斑中，野生菌株可能开始导致菌斑pH下降，当pH降至6.0以下时，耐氟菌株依其较强的产酸力，继续产酸并脱矿，致使菌斑致龋力增强。Hoelscher等也发现[2]，在无氟条件下，耐氟变链菌株与亲代菌株的产酸量无明显差异。在氟化物存在下，野生变链菌株无法使培养基pH降至5.5以下，而耐氟菌株依其较多的产酸量，可将培养基终末pH降至5.5左右.全身及局部氟化物的常规使用,使正常人牙菌斑中含有低浓度氟化物。可以认为，有氟化物存在的菌斑中，由于变链菌耐氟菌株产酸力大于亲代野生株，从而使菌斑更具致龋力。
2.3 耐氟菌株的脱矿能力及致龋性
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在细菌致釉质脱矿体外实验中发现，不同变链菌株的耐氟突变株，其脱矿能力存在差异[6]。远缘链球菌S·sobrinus6715，其产酸力和脱矿力皆低于亲代菌株；而变链菌S.mutans C180-2和CS-5，无论有无氟化物存在，它们的耐氟菌株的产酸力及脱矿力皆大于亲代菌株。所以，耐氟菌株的产生并不一味地降低变链菌的致龋性。
在动物实验中，Eisenberg等[12]将刚出生大鼠口腔中分别接种S.sobrinus6715及其耐氟突变株，发现无论给大鼠无氟饮食或有氟饮食，耐氟菌株致动物光滑面龋数目皆较亲代菌株少。类似结果也见于变链蓖C180-2和其耐氟菌株C180-2 FR。Loveren等[15]发现，接种有C180-2 FR的大鼠，牙齿龋患率低于接种C180-2的大鼠。当菌斑pH为5.5～4.5时,C180-2 FR产酸速度大于亲代株，Loveren认为，C180-2 FR致动物龋患率低的原因是动物菌斑pH值未降至可以发挥耐氟菌株较强产酸力和致龋力的水平。最近，Yang等[6]动物实验结果表明，耐氟变链菌株与亲代菌株在致动物继发龋方面无明显差异。总之，不同耐氟菌株其致龋毒力不同，这可能是由于不同耐氟菌株产生耐氟突变的机制不同所造成。
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3 耐氟菌株产生机制
对于耐氟菌株产生原因至今没有明确解释，很多学者根据耐氟菌株的表型特征及研究结果，对耐氟菌株产生机制予以推测。
3.1 质粒转移
Brown等[5]从干燥症患者口腔中分离出耐氟变链菌株，并发现分离出耐氟菌株的菌斑中乳杆菌占优势。乳杆菌自身具有较高耐氟水平，可达1000 ppmF以上。作者认为，变链菌耐氟菌株的出现是由于乳杆菌胞内耐氟质粒转移至变链菌体内，使其获得高水平耐氟能力。
3.2 染色体DNA改变
Chansley等[1]在体外成功地将变链菌GS-5耐氟突变株的染色体DNA转化给亲代株，使亲代株获得高达2000 μg/ml NaF的耐氟水平，说明耐氟菌株的基因型发生改变。Brussock等[8]在体外诱导产生耐氟菌株的过程中发现，耐氟菌株出现频率为每10 CFU出现5个耐氟菌落，这与基因点突变频率一致。它们认为，稳定耐氟性的获得是基因型而非表型改变，是由于基因产物所调节。低水平耐氟性的获得是单个基因产物所调节。低水平耐氟性的获得是单个基因产物调控结果，高水平耐氟性的获得可能与两个或两个以上基因产物共同作用有关。
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3.3 糖酵解途径改变
变链菌主要依靠(PEP)：磷酸转移酶系统(phosphotransferase,PTS)转运单糖和双糖，进行糖酵解。该系统在糖供过剩，低pH时被抑制，且对氟化物敏感[11]。通过对PTS缺乏的变链菌株研究发现，除PTS外，变链菌还存在另一糖转运系统，即依赖质子原动力(proton motive force,PMF)的透性酶转移系统(permease)[14,17]。该系统在低pH(5.5以下)，糖供过剩时发挥作用。变链菌C180-2耐氟突变株在pH6.0以下产酸速度较亲代菌株快，并具较强耐酸性，推测耐氟菌株可能诱导产生了既耐氟又耐酸的透性酶糖转运系统，使耐氟菌株在低pH下保持哟有力的产酸速度[14]。
质子原动力(PMF)的产生与菌体内H+/ATPase活性有关。H+/ATPase为细菌胞膜结合蛋白酶，可通过消耗胞内ATP将质子H+移出胞外，以维持胞内相对中性pH及产生PMF。所以，H+/ATPase与细菌耐酸性密切相关，耐酸性强的细菌，其胞内H+/ATPase活性高。变链菌H+/ATPase对氟化物非常敏感，IC50为1mmol/L[18]。变链菌氟菌株在低pH条件下产酸速度较亲代菌株快，且不易被氟化物所抑制，表明耐氟菌株体内拥有高活性H+/AT-Pase[14]。Hoelscher等发现耐氟变链菌株的胞膜H+/ATPase活性不受氟化物影响[2]，推测耐氟菌株的H+/ATPase结构可能发生改变，而这种改变可能源于其酶基因突变。
总之，氟化物的广泛应用，可能导致变形链球菌耐氟菌株的产生。早期观点认为，耐氟菌株的粘附能力，产酸及脱矿能力皆降低，且无法在体内致龋。近期研究发现，耐氟变链菌株依菌株不同，pH条件不同耐致龋性各异，在很多情况下，其致龋力大于亲代野生株。但关于耐氟菌株产生机制，纵有许多推测，仍未予肯定。为了氟化物合理应用及深入了解氟化物防龋机制，对耐氟菌株的研究有待进一步深入。, http://www.100md.com
上海第二医科大学口腔医学院 盛江筠(综述) 刘正(审校)
摘 要 氟化物的广泛应用可能导致变形链球菌耐氟菌株的产生。为了解变形链球菌耐氟菌株的致龋毒力变化，国外学者对耐氟变形链球菌的粘附、产酸、及脱矿等致龋特性进行了研究，并对耐氟菌株产生机制予以探讨。本文就目前研究现状作一综述。
关键词：氟化物 变形链球菌 耐氟菌株
氟化物为行之有效并广为采用的防龋药物。而多种氟化物制剂经常广泛使用很可能有耐氟菌株选择性生长[1]。已有学者在体内及体外获得耐氟变链菌株，并对其致龋毒力进行了系列研究[2，3]。本文就其研究现状作一综述。
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1 耐氟菌株的诱导
耐氟菌株(fluoride-resistant strains,FRS)具有比野生菌株更强的耐氟性，即可以在高于自身氟耐受水平的氟化物中生存。氟耐受可分为表型与基因型两种。前者当细菌离开高氟环境后，耐氟性消失；而后者在无氟培养基中传代多次，仍保持其原有耐氟水平[3]。至今没有关于基因型氟耐爱的确切定义。van Loveren将其定义为在无氟培养基中连续传代20次，细菌耐氟性不消失[4]。
耐氟菌株可从体内及体外两种途径获得。Brown等最初从肿瘤放疗后，每天使用1%NaF凝胶预防猛性龋的患者口腔中分离出可耐受300 ppm和600 ppm的耐氟变菌株(变链菌自身氟耐受水平为100～150 ppm)，并发现随氟化钠凝胶使用时间的延长，菌斑中耐氟变链菌株的比例上升，菌斑产酸能力下降[5]。此后，又有多数人从干燥症患者口腔中分离出耐氟变链菌株[6]。虽然活体内预防水平氟化物的应用并未检测出耐氟菌株的存在[7]，但高浓度氟化物导致干燥症患者口腔中耐氟株产生的事实，提示正常人群中耐氟菌株产生的可能性。
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为研究耐氟菌株致龋特征，并与亲代野生菌株进行横向比较，多采用体外诱导方法获得稳定传代的耐氟突变株。最初有学者利用紫外线照射获得耐氟菌株，但这种方法与体内突变株自然产生过程相差甚远。随后，有人采用培养基中增加氟化物浓度的方法诱导变链菌自发产生耐氟突变株[2，8]。Brussock等[8]在THA固体培养基中加入不同浓度氟化钠(0～1000 μg/ml,以50 μg/ml递增)，将变链菌GS-5由含有低浓度氟化钠的THA中逐步转种至含有高浓度氟化钠的THA中，遂得到稳定耐氟菌株。而van Loveren等[4]则将变逻菌C180-2直接由无氟培养基转种至含有1000 μg/ml NaF的蔗糖琼脂平板，获得单个耐氟菌落，并能稳定传代培养。
2 耐氟菌株的致龋特征
2.1 耐氟菌株的粘附能力
, 百拇医药 氟化物可通过改变釉质表面吸附性，作用于唾液获得性膜上某些基团及减少细菌胞外多糖合成而影响变逻菌蔗糖非依赖性粘附及蔗糖依赖性粘附[9]。变链菌耐氟突变后，其粘附特性发生改变。Streckfuss等[10]研究发现，远缘链球菌6715耐氟突变株的蔗糖依赖性粘附力较亲代菌株下降。动物实验中，变链菌C180-2而氟菌株C180-2FR在与亲代菌株共同定居至大鼠牙齿表面时，其竞争力减弱，且无法在已有亲代菌株定居的牙面上生长[4]。但最近研究有不同发现，Hoelscher等[2]在对变链菌UA130及其耐氟突变株的体外研究中发现，耐氟菌株具有与亲代菌株相同的竞争粘附至唾液包被羟磷灰石珠上的能力。
2.2 耐氟菌株的产酸能力
已证实氟化物可通过多种机制抑制变链菌产酸[11]。许多学者在对变链菌耐氟菌株产酸力的研究中发现，耐氟菌株的产酸速度较亲代野生菌株减慢，无论有无氟化物存在，耐氟菌株皆无法将牙面pH值降至临界pH5.5以下[12，13]。由此推论，变链菌耐氟菌株不可能单独导致牙齿龋坏。这可以很好地解释干燥症患者口腔中，虽然变链菌及乳杆菌数目占有优势，但龋齿的进展却受到控制。
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近年，Van Loveren等[14]在体外通过连续培养技术，对不同pH条件下细菌产酸速度进行比较，发现变链菌耐氟菌株在pH≥6.0时，产酸速度小于亲代株，而当pH6.0～4.5时，产酸速度却大于亲代株。因活体内变链菌自发耐氟突变发生在部分菌株，耐氟菌株所占比例不超过变链菌总量的35%[5]。由此推测，含有混合变链菌群体的牙菌斑中，野生菌株可能开始导致菌斑pH下降，当pH降至6.0以下时，耐氟菌株依其较强的产酸力，继续产酸并脱矿，致使菌斑致龋力增强。Hoelscher等也发现[2]，在无氟条件下，耐氟变链菌株与亲代菌株的产酸量无明显差异。在氟化物存在下，野生变链菌株无法使培养基pH降至5.5以下，而耐氟菌株依其较多的产酸量，可将培养基终末pH降至5.5左右.全身及局部氟化物的常规使用,使正常人牙菌斑中含有低浓度氟化物。可以认为，有氟化物存在的菌斑中，由于变链菌耐氟菌株产酸力大于亲代野生株，从而使菌斑更具致龋力。
2.3 耐氟菌株的脱矿能力及致龋性
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在细菌致釉质脱矿体外实验中发现，不同变链菌株的耐氟突变株，其脱矿能力存在差异[6]。远缘链球菌S·sobrinus6715，其产酸力和脱矿力皆低于亲代菌株；而变链菌S.mutans C180-2和CS-5，无论有无氟化物存在，它们的耐氟菌株的产酸力及脱矿力皆大于亲代菌株。所以，耐氟菌株的产生并不一味地降低变链菌的致龋性。
在动物实验中，Eisenberg等[12]将刚出生大鼠口腔中分别接种S.sobrinus6715及其耐氟突变株，发现无论给大鼠无氟饮食或有氟饮食，耐氟菌株致动物光滑面龋数目皆较亲代菌株少。类似结果也见于变链蓖C180-2和其耐氟菌株C180-2 FR。Loveren等[15]发现，接种有C180-2 FR的大鼠，牙齿龋患率低于接种C180-2的大鼠。当菌斑pH为5.5～4.5时,C180-2 FR产酸速度大于亲代株，Loveren认为，C180-2 FR致动物龋患率低的原因是动物菌斑pH值未降至可以发挥耐氟菌株较强产酸力和致龋力的水平。最近，Yang等[6]动物实验结果表明，耐氟变链菌株与亲代菌株在致动物继发龋方面无明显差异。总之，不同耐氟菌株其致龋毒力不同，这可能是由于不同耐氟菌株产生耐氟突变的机制不同所造成。
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3 耐氟菌株产生机制
对于耐氟菌株产生原因至今没有明确解释，很多学者根据耐氟菌株的表型特征及研究结果，对耐氟菌株产生机制予以推测。
3.1 质粒转移
Brown等[5]从干燥症患者口腔中分离出耐氟变链菌株，并发现分离出耐氟菌株的菌斑中乳杆菌占优势。乳杆菌自身具有较高耐氟水平，可达1000 ppmF以上。作者认为，变链菌耐氟菌株的出现是由于乳杆菌胞内耐氟质粒转移至变链菌体内，使其获得高水平耐氟能力。
3.2 染色体DNA改变
Chansley等[1]在体外成功地将变链菌GS-5耐氟突变株的染色体DNA转化给亲代株，使亲代株获得高达2000 μg/ml NaF的耐氟水平，说明耐氟菌株的基因型发生改变。Brussock等[8]在体外诱导产生耐氟菌株的过程中发现，耐氟菌株出现频率为每10 CFU出现5个耐氟菌落，这与基因点突变频率一致。它们认为，稳定耐氟性的获得是基因型而非表型改变，是由于基因产物所调节。低水平耐氟性的获得是单个基因产物所调节。低水平耐氟性的获得是单个基因产物调控结果，高水平耐氟性的获得可能与两个或两个以上基因产物共同作用有关。
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3.3 糖酵解途径改变
变链菌主要依靠(PEP)：磷酸转移酶系统(phosphotransferase,PTS)转运单糖和双糖，进行糖酵解。该系统在糖供过剩，低pH时被抑制，且对氟化物敏感[11]。通过对PTS缺乏的变链菌株研究发现，除PTS外，变链菌还存在另一糖转运系统，即依赖质子原动力(proton motive force,PMF)的透性酶转移系统(permease)[14,17]。该系统在低pH(5.5以下)，糖供过剩时发挥作用。变链菌C180-2耐氟突变株在pH6.0以下产酸速度较亲代菌株快，并具较强耐酸性，推测耐氟菌株可能诱导产生了既耐氟又耐酸的透性酶糖转运系统，使耐氟菌株在低pH下保持哟有力的产酸速度[14]。
质子原动力(PMF)的产生与菌体内H+/ATPase活性有关。H+/ATPase为细菌胞膜结合蛋白酶，可通过消耗胞内ATP将质子H+移出胞外，以维持胞内相对中性pH及产生PMF。所以，H+/ATPase与细菌耐酸性密切相关，耐酸性强的细菌，其胞内H+/ATPase活性高。变链菌H+/ATPase对氟化物非常敏感，IC50为1mmol/L[18]。变链菌氟菌株在低pH条件下产酸速度较亲代菌株快，且不易被氟化物所抑制，表明耐氟菌株体内拥有高活性H+/AT-Pase[14]。Hoelscher等发现耐氟变链菌株的胞膜H+/ATPase活性不受氟化物影响[2]，推测耐氟菌株的H+/ATPase结构可能发生改变，而这种改变可能源于其酶基因突变。
总之，氟化物的广泛应用，可能导致变形链球菌耐氟菌株的产生。早期观点认为，耐氟菌株的粘附能力，产酸及脱矿能力皆降低，且无法在体内致龋。近期研究发现，耐氟变链菌株依菌株不同，pH条件不同耐致龋性各异，在很多情况下，其致龋力大于亲代野生株。但关于耐氟菌株产生机制，纵有许多推测，仍未予肯定。为了氟化物合理应用及深入了解氟化物防龋机制，对耐氟菌株的研究有待进一步深入。, http://www.100md.com