靶向转录研究新进展
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国外医学分子生物学分册 2000年第22卷第1期
苗红 郭葆玉
摘 要 靶向转录(transcriptional targeting)是指在转录水平将目的基因界定于靶位点进行有效表达的过程，有许多因子参与这一复杂调控，包括许多顺式作用元件如组织牧民性启动子/增强子、可被内、外源刺激诱导的启动了以及绝缘子、静息子等，它们与靶组织内的转录因子相互作用实现基因的定位表达，而结合基因开关、二步转录激活系统及Cre/LoxP系统又可控制表达产物的消长。
关键词：靶向转录 基因治疗 组织特异性表达
目前制约基因治疗发展的一个主要问题是其安全性和有效性难以保证，即不能达到治疗基因表达的空间、时序和表达水平的精确定位，特别是治疗基因表达的选择性不高，在非靶组织/细胞表达易产生毒副作用，并降低疗效。靶向转录就是通过组织/细胞特异性转录调控元件使外源基因准确、在效地表达于特定组织细胞，从而提高基因治疗的有效性和安全性，它已成为基因治疗领域的研究热点。本文就近两年靶向转录的研究新进展做一综述。
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1 靶向转录的作用元件
1.1 组织特异性启动子/增强子
基因表达的组织特异性与其表达调控元件密切相关，基因编码区的5´侧翼调控序列与细胞中的反式作用元件相互作用，决定了某些基因只在特定组织细胞内表达。靶向转录的基本策略就是将外源基因置于这些组织特异性启动子/增强子的下游，只有特定组织/细胞中的转录因子才能与这些启动子作用并激活转录，从而实现目的的基因的选择性表达。表1列出近年来研究的一些组织/细胞特异性调控元件，这里所指的启动子有的不仅包括RNA聚合酶结合位点(核心启动子)，还包括增强子、静息子序列。
对于肿瘤的基因治疗，由于严格的肿瘤细胞特异性的启动子很少，所以在很多情况下只能采用组织特异性启动子，这样治疗基因不仅表达于该组织中的肿瘤细胞，而且在非肿瘤细胞中也有表达，因而可能对正常细胞产生毒性。利用双特异性嵌合转录因子(dual-specificity chimeric tanscription factor,DCTF)系统[1]，可克服这一缺陷。DCTF系统是根据肿瘤的高增殖的特点而构建的：将GAL4DNA结合域与p56kkN端的融合cDNA置于组织特异性启动子的下游，表达转录因子的DNA结合亚单位；另将单纯疱疹病毒VP16的转录激活域与CD4脃质区的融合cDNA置于细胞周期蛋白A(cyclinA)启动子的下游，表达转录因子的转录激活亚单位。只有在特定组织的高增殖细胞中两个亚单位才同时表达，通过CD4胞质区与p56kkN端结合，形成异源二聚体转录因子，与启动子上相应的GAL4结合位点结合，然后通过VP16的强激活作用，使目的基因高表达于特定组织中的肿瘤细胞。
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表1 近年来研究的一些组织/细胞特异性顺式作用元件
顺式作用序列
组织细胞特异性
PSA(前列腺特异性抗原)启动子
前列腺上皮细胞
酪氨酸激酶启动子
黑色素瘤细胞
AFP(甲胎蛋白)增强子/白蛋白(albumin)启动子
肝癌细胞
CEA(癌胚抗原)启动子
CEA阳性肿瘤细胞
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粘蛋白-1(Mucin-1)
乳房肿瘤
flt-1启动子
内皮细胞内皮细胞
已糖激酶Ⅱ(hexokinase typeII) 启动子
肿瘤组织
髓鞘质碱性蛋白(Myelin basic protien )启动子
髓鞘质形成细胞
淀粉酶启动子
胰腺
MCK(肌苷激酶)启动子
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骨骼肌细胞
SM22a启动子
平滑肌细胞
肌球蛋白重链(myosin heavy chain2)启动子
肌肉组织
转铁蛋白启动子
大脑
胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)启动子
神经胶质细胞
Tn1(快肌钙蛋白)启动子
骨骼肌细胞
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CCR2启动子
巨噬细胞
烯醇化酶启动子
神经元
蔗糖-异麦芽糖酶(sucrase-isomaltase)启动子
胃肠道
激素敏感的脂肪酶(hormone-sensitive lipase)启动子
睾丸
附睾视黄酸结合蛋白(epididymal retinoic acid binding protein) 启动子
附睾
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aⅡb启动子
巨核细胞
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase)启动子
神经组织
1.2 可诱导的启动子
某些基因在疾病状态下优先表达，利用这些基因中在疾病状态下激活的转录调控元件，可指导目的基因表达于疾病组织。例如，低氧可诱导VEGF、磷酸甘汕激酶PGK-1(phosphoglycerate kinase)、EPO、内皮细胞一氧化氮合成酶等的表达增加，研究发现，其氧化氮合成酶等的表达增加，研究发现，其5´侧翼序列中存在低氧效应元件(hypoxia responsive element,HRE),HRE与低氧诱导的转录因子HIF(hypoxia-inducible factor)作用促进转录。将PGK-1基因的HRE分别与不同的启动子融合，在低氧状态下，均能诱导报告基因的表达[2]。实验显示，HRE/HIF-1转录调控系统可有效调控外源基因表达于牌低氧环境中的肿瘤细胞，对实体瘤的治水具有潜在的价值。还有人发现，E2F-1启动子可被细胞周期诱导活化，它在肿瘤组织较正常组织更为活跃，但机制尚未明确，可能与存在于启动子上的E2F效应无件有关，此外，许多急性相蛋白能在不同的刺激下表达，如炎症能诱导补体成分CF3和血清淀粉样A成分SAA3，这些基因的启动子能被炎症刺激诱导激活。
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早期生长因子(early growth factor,ger-1)启动子能被辐射诱导激活，进行不连续的表达(照射后3 h恢复至基线水平)。通过辐射的精确定位，可使egr-1启动子控制的目的基因在空间和时序上定位表达，在较低的照射剂量下，治疗基因的表达水平即可达到抑制肿瘤生长的要求[7]，该法尤其适于脑部肿瘤的基因治疗。虽然c-Fos、c-Jun、TNF、NF-kB、PDGF、IL-1等启动子也能被辐射诱导，但调控严密性均不如egr-1启动子。
1.3 静息子
静息子可以关闭或抑制基因在非靶细胞中的表达，因而在许多基因的选择性表达中起了重要作用。如谷氨酰胺合成酶可被糖皮质激素诱导表达于神经组织，而在其它组织中虽存在糖皮质激素，但谷氨酰胺合成酶不表达。研究发现，谷氨酰胺合成酶基因的调控序列中不仅有糖皮质激素效应元件(glucorti-coid-responsive element,GRE),还存在一个静息子，它与神经限制性静息子元件(neural restrictive silencer element,NRSE)高度同源，能抑制谷氨酰胺合成酶在非神化组织的表达。将该静息子与异源GRE启动子融合，可抑制下游基因在非神经组织的表达[4]。在许多特异性表达于神经组织的基因，如SCG10、II型钠通道、synapsin 1、毒蕈碱M4受体、神经-胶质细胞粘附分子等基因的调控区都存在NRSE，并对这些基因的选择性表达起决定作用。
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1.4 边界元件
组织特异性启动子虽可指导靶向转录，但外源基因的表达与拷贝数无关，且易出现位置效应，有的甚至不表达，这显示还有一些重要的远端调控元件也参与了基因的表达调控，这类元件即边界无件，包括绝缘子、LCR及基质附着位点(matrix attachment region,MAR)。
绝缘子是无启动子/增强子活性的DNA序列，能阻止邻近序列，包括启动子、增强子和静息子对其所界定的基因的启动子的影响[5，6]。随机整合的外源基因由于受周围染色体序列的影响，表达可能受到抑制(转录静息)或表达水平随整合位点而变化；此外，病毒基因组也会影响载体中外源基因的表达，而绝缘子可保护外源基因不受这些因素的影响，确保靶向转录的顺利进行。目前已确定的绝缘子有果蝇热休克基因的scs/scs´(special-ized chromatin structures)、人和鸡β-珠蛋白基因座的5´HS4和su(HW)蛋白结合序列。有些MAR也具有绝缘子的作用，例如人载脂蛋白B和al抗胰蛋白酶基因座的MAR均可抑制白眼转基因表达的位置效应[7]。
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LCR是调控一群相关基因表达的边界序列，其调控作用可使基因表达对整合位点不敏感，而仅仅取决于拷贝数。研究较为深入的是人β-珠蛋白基因簇的LCR，它是由位于基因簇5´端的5个DNA酶高敏位点(DNase hypersensitive sites,5´HSI-5)组成。在转基因实验中，LCR可以使基因高水平表达于细细胞，并对整合位点不敏感。部分甚至单个HS核心片段(HS2)都可指导β-珠蛋白基因在红细胞选择性表达[8]，但都出现不同程度的位置效应，似乎只发挥了红细胞特异性的增强子作用，而完整LCR的功能有所丧失。研究表明，LCR是与多种转录因子协同作用而发挥作用的，其中序列的任意缺失都易产生位置效应[9]，因此最好采用完整的LCR，或引往上绝缘子以克服位置效应。
2 病毒性转录调控元件
有些细胞性转录调控元件在病毒载体内仍能保留其组织特异性，但有的由于受病毒序列的影响，其组织特异性部分或完全丧失。例如，心室/慢肌球蛋白轻链 1(ventricular/slow muscle myosin light chain,1 MLC1)启动子插入腺病毒载体后，组织特异性丧失，活性也有所改变，显示腺病毒基因组上存在负调控元件[10]，逆转录病毒的和末端重复序列(LTR)对细胞性调控元件也有影响，虽然使外源基因的转录与病毒mRNA的转录方向相反，或去除病毒增强子序列使其在逆转录时自我失活，可以部分避免这种影响，但病毒的滴度大大降低。在这种情况下，可以利用病毒本身的特异性转录调控元件或对病毒的启动子/增强子进行改造来实现靶向转录。
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某些病毒基因只在疾病组织中复制、表达，可以利用病毒的特导师性调控序列使治疗基因表达于病毒染组织。例如，EB病毒核心抗原(EBNA-1)表达于EB病毒相关的B淋巴细胞癌和鼻咽瘿细胞中，EBNA-1与EB病毒阳性细胞中复制、表达，OriP可以指导目的基因高表达于EB病毒感染细胞[11]。微小病毒B19启动子可以启动目的基因特异性地表达于红细胞。
对于宿主范围较广的逆转录病毒载体，通过改造其长末端重复序列(LTR)可以获得靶向转录载体，常用的方法是以细胞性或异源病毒的特异性序列代替或插入LTR。Diaz等[12]用SV40基本启动子代替鼠白血病病毒(MOMLV)启动子，并将串联的3个拷贝的酪氨酸激酶远羰增强子代替MOMLV增强子，或插入增强子，结果目的的基因选择性表达于黑色素瘤细胞，滴度接近野生型病毒。Fassati等[13]用人嗜T-淋巴细胞病毒1的Tax效应元件(Tax-responsive element,TRE)与肌苷激酶启动子/增强子构成的转录单元，代替MOMLV的启动子/增强子，目的基因表达于病毒感染的T-淋巴细胞。
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3 靶向转录的调控
多数组织特异性启动子为组成型启动子，且转录活性较低，这在很大程度上限制了组织特异性启动子的实际应用。如何对其进行调控已成靶向转录研究的热点，这方面的工作主要有利用基因开关或转录增强系统对靶向转录进行调控。
Gossen等提出的tet调控系统是目前靶向转录中应用较多的基因开关。tet抑制系统(tet-off)是将tet阻遏蛋白与VP16的激活域融合表达转录激活蛋白tTA,tTA与含tetO的启动子(tetOp)作用启动下游基因的表达，四环素关闭基因的转录。tet激活系统(tet-on)是突变的tet阻遏蛋白与VP16的激活域融合表达rtTA,在强力霉素存在时，rtTA与tetOp结合启动子/增强子，可以激活或抑制靶向转录。Cher等[14]首次报道了一个神经胶质细胞特异性的可抑制的腺病毒表达系统：将3个串联的300bp的GFAP增强子序列与巨细胞病毒最小启动子相连，指导tTA选择性表达于神经胶质瘤细胞，tTA激活tetOp启动子报告基因高水平地表达于胶质细胞中，0.1ug/ml四环素可抑制表达。
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提高基因选择性表达水平的策略主要是通过以VP16为基础的转录激活系统来放大组织特异性启动子的作用，方法是以组织特异性启动子指导一嵌合转录因子的表达，该异性启动子指导一嵌合转录因子的表达，该嵌合转录因子是由HSV VP16的激活域与一些DNA结合蛋白的结合域融合而成的，它与启动子上相应的DNA结合位点结合，然后通过VP16激活启动子进进目的基因的转录，而VP16是已知作用最强的转录激活蛋白之一，因此该系统具有很高的转录效率。目前构建的嵌合转录因子有两种：GAL4-VP16和LexA-VP16结合域与HSV VP16激活域融合而成，相应的DNA结合序列分别为GAL4效应元件(GAL4-responsive ele-ment,GRE)和LexA效应元件(LexA-re-sponsive elementl,LRE),通常是数个GRE或LRE串联置于启动子的上游。Segawa等[15]在该系统应用PSA启动表达促调亡蛋白ex-PolyQ，表达水平提高了两个数量级，且仅PSA阳性前列腺癌细胞发生凋亡。Nettel-beck[16]等成功将该系统构建于一个逆转录病毒载体中，并将组织特异性启动子的活性提高了数十倍。
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此外，Stao等[17]巧妙地将Cre/loxP系统应用于靶向转录，也获得了组织特异性高水平表达。他们构建了两个载体：一个为调控载体，以AFP启动子指导重组酶Cre的表达；另一个为载载体，用强启动子CAG启动目的基因之间插入一个终止转录的阻遏单元，阻遏单元两侧各有一个loxP位点(34nt)。这两个载体同时感染细胞后，Cre只在AFP阳性细胞表达，识别loxP位点切除阻遏单元，CAG启动子顺利启动下少游基因的表达。体外实验中，表达水平比对照高50倍，且严格表达于AFP阳性细胞，肿瘤模型的体内实验也显示了相同的结果。
靶向转录已成为提高基因治疗安全性的重要手段，但还存在一些问题。首先，单靠5´侧翼序列还不能保证靶向转录的侧得进行胃些基因的顺利表达还需要内含子和远端调控序列的参与，因此LCR及绝缘子将成为新一代靶向转录载体的重要元素。但现有载体的包装容量有限，无法容纳较大片段的调控元件，因此一方面要确定能满足载体容量限制的最小LCR及绝缘子序列，另一方面需要研究和开发大容量载体以容纳更多、更大的转录调控元件。令人鼓舞的是，现在已出现了一种新的大容量AdV载体，它不含病毒结构基因，包装容量可达36kb,同时毒性和免疫原性大大降低，利用这种载体进行基因组基因的组织特异性表达已经取得成功[18]。其次，现有的靶向转录调控系统还存在着调控的精确性、外源诱导剂的毒性和转录因子的免疫原性等问题，有待于进一步完善。从这个角度来说，能在疾病状态下诱导活化的启动子具有很大的潜力，它不仅能使目的基因选择性表达于疾病组织，而且表达水平能随疾病发展的不同程度自动调节，并在病理状态消失后自动停止表达。随着对基因表达调控机制的深入了解，将来有可能实现外源基因在表达空间、时间和水平上更为精确的调控。
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作者单位：第二军医大学药学院生化药学教研室(上海，200433)
参考文献
1 Jerome V et al.Hum Gene Ther,1998;9:26533
2 Dachs GU et al.Nature Med,1997;3:515
3 Manome Y et al.Hum Gene Ther,1998;9:1409
4 Avisa N et al.J Biol Chem,1999;274:11399
5 Jay H et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94:575
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6 Sigrist CJ et al.Genetics,1997;147:209
7 Namciu SJ et al.Mol Cell Biol,1998;18:2382
8 Ellis J et al.Nucleic Acids Res, 1997;25(6):1296
9 Hardison R et al. Gene ,1997;205:73
10 Shi Q et al.Hum Gene Ther,1997;8:403
11 Kenney S et al.Hum Gene Ther,1998,9:1131
12 Diaz R M et al.J Virol,1998;72:789
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13 Fassati A et al.Hum Gene Ther,1998;9:2459
14 Chen J et al.Cancer Res,1998;58(16):3504
15 Segawa T et al.Cancer Res ,1998;58:2282
16 Nettelbeck DM et al.Gene Ther,1998;5:1656
17 Stao Y et al.Biochem Biophys Res Commun,1998;244:455
18 Schiedner P et al. Nat Genet ,1998;18:180, 百拇医药
摘 要 靶向转录(transcriptional targeting)是指在转录水平将目的基因界定于靶位点进行有效表达的过程，有许多因子参与这一复杂调控，包括许多顺式作用元件如组织牧民性启动子/增强子、可被内、外源刺激诱导的启动了以及绝缘子、静息子等，它们与靶组织内的转录因子相互作用实现基因的定位表达，而结合基因开关、二步转录激活系统及Cre/LoxP系统又可控制表达产物的消长。
关键词：靶向转录 基因治疗 组织特异性表达
目前制约基因治疗发展的一个主要问题是其安全性和有效性难以保证，即不能达到治疗基因表达的空间、时序和表达水平的精确定位，特别是治疗基因表达的选择性不高，在非靶组织/细胞表达易产生毒副作用，并降低疗效。靶向转录就是通过组织/细胞特异性转录调控元件使外源基因准确、在效地表达于特定组织细胞，从而提高基因治疗的有效性和安全性，它已成为基因治疗领域的研究热点。本文就近两年靶向转录的研究新进展做一综述。
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1 靶向转录的作用元件
1.1 组织特异性启动子/增强子
基因表达的组织特异性与其表达调控元件密切相关，基因编码区的5´侧翼调控序列与细胞中的反式作用元件相互作用，决定了某些基因只在特定组织细胞内表达。靶向转录的基本策略就是将外源基因置于这些组织特异性启动子/增强子的下游，只有特定组织/细胞中的转录因子才能与这些启动子作用并激活转录，从而实现目的的基因的选择性表达。表1列出近年来研究的一些组织/细胞特异性调控元件，这里所指的启动子有的不仅包括RNA聚合酶结合位点(核心启动子)，还包括增强子、静息子序列。
对于肿瘤的基因治疗，由于严格的肿瘤细胞特异性的启动子很少，所以在很多情况下只能采用组织特异性启动子，这样治疗基因不仅表达于该组织中的肿瘤细胞，而且在非肿瘤细胞中也有表达，因而可能对正常细胞产生毒性。利用双特异性嵌合转录因子(dual-specificity chimeric tanscription factor,DCTF)系统[1]，可克服这一缺陷。DCTF系统是根据肿瘤的高增殖的特点而构建的：将GAL4DNA结合域与p56kkN端的融合cDNA置于组织特异性启动子的下游，表达转录因子的DNA结合亚单位；另将单纯疱疹病毒VP16的转录激活域与CD4脃质区的融合cDNA置于细胞周期蛋白A(cyclinA)启动子的下游，表达转录因子的转录激活亚单位。只有在特定组织的高增殖细胞中两个亚单位才同时表达，通过CD4胞质区与p56kkN端结合，形成异源二聚体转录因子，与启动子上相应的GAL4结合位点结合，然后通过VP16的强激活作用，使目的基因高表达于特定组织中的肿瘤细胞。
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表1 近年来研究的一些组织/细胞特异性顺式作用元件
顺式作用序列
组织细胞特异性
PSA(前列腺特异性抗原)启动子
前列腺上皮细胞
酪氨酸激酶启动子
黑色素瘤细胞
AFP(甲胎蛋白)增强子/白蛋白(albumin)启动子
肝癌细胞
CEA(癌胚抗原)启动子
CEA阳性肿瘤细胞
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粘蛋白-1(Mucin-1)
乳房肿瘤
flt-1启动子
内皮细胞内皮细胞
已糖激酶Ⅱ(hexokinase typeII) 启动子
肿瘤组织
髓鞘质碱性蛋白(Myelin basic protien )启动子
髓鞘质形成细胞
淀粉酶启动子
胰腺
MCK(肌苷激酶)启动子
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骨骼肌细胞
SM22a启动子
平滑肌细胞
肌球蛋白重链(myosin heavy chain2)启动子
肌肉组织
转铁蛋白启动子
大脑
胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)启动子
神经胶质细胞
Tn1(快肌钙蛋白)启动子
骨骼肌细胞
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CCR2启动子
巨噬细胞
烯醇化酶启动子
神经元
蔗糖-异麦芽糖酶(sucrase-isomaltase)启动子
胃肠道
激素敏感的脂肪酶(hormone-sensitive lipase)启动子
睾丸
附睾视黄酸结合蛋白(epididymal retinoic acid binding protein) 启动子
附睾
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aⅡb启动子
巨核细胞
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase)启动子
神经组织
1.2 可诱导的启动子
某些基因在疾病状态下优先表达，利用这些基因中在疾病状态下激活的转录调控元件，可指导目的基因表达于疾病组织。例如，低氧可诱导VEGF、磷酸甘汕激酶PGK-1(phosphoglycerate kinase)、EPO、内皮细胞一氧化氮合成酶等的表达增加，研究发现，其氧化氮合成酶等的表达增加，研究发现，其5´侧翼序列中存在低氧效应元件(hypoxia responsive element,HRE),HRE与低氧诱导的转录因子HIF(hypoxia-inducible factor)作用促进转录。将PGK-1基因的HRE分别与不同的启动子融合，在低氧状态下，均能诱导报告基因的表达[2]。实验显示，HRE/HIF-1转录调控系统可有效调控外源基因表达于牌低氧环境中的肿瘤细胞，对实体瘤的治水具有潜在的价值。还有人发现，E2F-1启动子可被细胞周期诱导活化，它在肿瘤组织较正常组织更为活跃，但机制尚未明确，可能与存在于启动子上的E2F效应无件有关，此外，许多急性相蛋白能在不同的刺激下表达，如炎症能诱导补体成分CF3和血清淀粉样A成分SAA3，这些基因的启动子能被炎症刺激诱导激活。
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早期生长因子(early growth factor,ger-1)启动子能被辐射诱导激活，进行不连续的表达(照射后3 h恢复至基线水平)。通过辐射的精确定位，可使egr-1启动子控制的目的基因在空间和时序上定位表达，在较低的照射剂量下，治疗基因的表达水平即可达到抑制肿瘤生长的要求[7]，该法尤其适于脑部肿瘤的基因治疗。虽然c-Fos、c-Jun、TNF、NF-kB、PDGF、IL-1等启动子也能被辐射诱导，但调控严密性均不如egr-1启动子。
1.3 静息子
静息子可以关闭或抑制基因在非靶细胞中的表达，因而在许多基因的选择性表达中起了重要作用。如谷氨酰胺合成酶可被糖皮质激素诱导表达于神经组织，而在其它组织中虽存在糖皮质激素，但谷氨酰胺合成酶不表达。研究发现，谷氨酰胺合成酶基因的调控序列中不仅有糖皮质激素效应元件(glucorti-coid-responsive element,GRE),还存在一个静息子，它与神经限制性静息子元件(neural restrictive silencer element,NRSE)高度同源，能抑制谷氨酰胺合成酶在非神化组织的表达。将该静息子与异源GRE启动子融合，可抑制下游基因在非神经组织的表达[4]。在许多特异性表达于神经组织的基因，如SCG10、II型钠通道、synapsin 1、毒蕈碱M4受体、神经-胶质细胞粘附分子等基因的调控区都存在NRSE，并对这些基因的选择性表达起决定作用。
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1.4 边界元件
组织特异性启动子虽可指导靶向转录，但外源基因的表达与拷贝数无关，且易出现位置效应，有的甚至不表达，这显示还有一些重要的远端调控元件也参与了基因的表达调控，这类元件即边界无件，包括绝缘子、LCR及基质附着位点(matrix attachment region,MAR)。
绝缘子是无启动子/增强子活性的DNA序列，能阻止邻近序列，包括启动子、增强子和静息子对其所界定的基因的启动子的影响[5，6]。随机整合的外源基因由于受周围染色体序列的影响，表达可能受到抑制(转录静息)或表达水平随整合位点而变化；此外，病毒基因组也会影响载体中外源基因的表达，而绝缘子可保护外源基因不受这些因素的影响，确保靶向转录的顺利进行。目前已确定的绝缘子有果蝇热休克基因的scs/scs´(special-ized chromatin structures)、人和鸡β-珠蛋白基因座的5´HS4和su(HW)蛋白结合序列。有些MAR也具有绝缘子的作用，例如人载脂蛋白B和al抗胰蛋白酶基因座的MAR均可抑制白眼转基因表达的位置效应[7]。
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LCR是调控一群相关基因表达的边界序列，其调控作用可使基因表达对整合位点不敏感，而仅仅取决于拷贝数。研究较为深入的是人β-珠蛋白基因簇的LCR，它是由位于基因簇5´端的5个DNA酶高敏位点(DNase hypersensitive sites,5´HSI-5)组成。在转基因实验中，LCR可以使基因高水平表达于细细胞，并对整合位点不敏感。部分甚至单个HS核心片段(HS2)都可指导β-珠蛋白基因在红细胞选择性表达[8]，但都出现不同程度的位置效应，似乎只发挥了红细胞特异性的增强子作用，而完整LCR的功能有所丧失。研究表明，LCR是与多种转录因子协同作用而发挥作用的，其中序列的任意缺失都易产生位置效应[9]，因此最好采用完整的LCR，或引往上绝缘子以克服位置效应。
2 病毒性转录调控元件
有些细胞性转录调控元件在病毒载体内仍能保留其组织特异性，但有的由于受病毒序列的影响，其组织特异性部分或完全丧失。例如，心室/慢肌球蛋白轻链 1(ventricular/slow muscle myosin light chain,1 MLC1)启动子插入腺病毒载体后，组织特异性丧失，活性也有所改变，显示腺病毒基因组上存在负调控元件[10]，逆转录病毒的和末端重复序列(LTR)对细胞性调控元件也有影响，虽然使外源基因的转录与病毒mRNA的转录方向相反，或去除病毒增强子序列使其在逆转录时自我失活，可以部分避免这种影响，但病毒的滴度大大降低。在这种情况下，可以利用病毒本身的特异性转录调控元件或对病毒的启动子/增强子进行改造来实现靶向转录。
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某些病毒基因只在疾病组织中复制、表达，可以利用病毒的特导师性调控序列使治疗基因表达于病毒染组织。例如，EB病毒核心抗原(EBNA-1)表达于EB病毒相关的B淋巴细胞癌和鼻咽瘿细胞中，EBNA-1与EB病毒阳性细胞中复制、表达，OriP可以指导目的基因高表达于EB病毒感染细胞[11]。微小病毒B19启动子可以启动目的基因特异性地表达于红细胞。
对于宿主范围较广的逆转录病毒载体，通过改造其长末端重复序列(LTR)可以获得靶向转录载体，常用的方法是以细胞性或异源病毒的特异性序列代替或插入LTR。Diaz等[12]用SV40基本启动子代替鼠白血病病毒(MOMLV)启动子，并将串联的3个拷贝的酪氨酸激酶远羰增强子代替MOMLV增强子，或插入增强子，结果目的的基因选择性表达于黑色素瘤细胞，滴度接近野生型病毒。Fassati等[13]用人嗜T-淋巴细胞病毒1的Tax效应元件(Tax-responsive element,TRE)与肌苷激酶启动子/增强子构成的转录单元，代替MOMLV的启动子/增强子，目的基因表达于病毒感染的T-淋巴细胞。
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3 靶向转录的调控
多数组织特异性启动子为组成型启动子，且转录活性较低，这在很大程度上限制了组织特异性启动子的实际应用。如何对其进行调控已成靶向转录研究的热点，这方面的工作主要有利用基因开关或转录增强系统对靶向转录进行调控。
Gossen等提出的tet调控系统是目前靶向转录中应用较多的基因开关。tet抑制系统(tet-off)是将tet阻遏蛋白与VP16的激活域融合表达转录激活蛋白tTA,tTA与含tetO的启动子(tetOp)作用启动下游基因的表达，四环素关闭基因的转录。tet激活系统(tet-on)是突变的tet阻遏蛋白与VP16的激活域融合表达rtTA,在强力霉素存在时，rtTA与tetOp结合启动子/增强子，可以激活或抑制靶向转录。Cher等[14]首次报道了一个神经胶质细胞特异性的可抑制的腺病毒表达系统：将3个串联的300bp的GFAP增强子序列与巨细胞病毒最小启动子相连，指导tTA选择性表达于神经胶质瘤细胞，tTA激活tetOp启动子报告基因高水平地表达于胶质细胞中，0.1ug/ml四环素可抑制表达。
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提高基因选择性表达水平的策略主要是通过以VP16为基础的转录激活系统来放大组织特异性启动子的作用，方法是以组织特异性启动子指导一嵌合转录因子的表达，该异性启动子指导一嵌合转录因子的表达，该嵌合转录因子是由HSV VP16的激活域与一些DNA结合蛋白的结合域融合而成的，它与启动子上相应的DNA结合位点结合，然后通过VP16激活启动子进进目的基因的转录，而VP16是已知作用最强的转录激活蛋白之一，因此该系统具有很高的转录效率。目前构建的嵌合转录因子有两种：GAL4-VP16和LexA-VP16结合域与HSV VP16激活域融合而成，相应的DNA结合序列分别为GAL4效应元件(GAL4-responsive ele-ment,GRE)和LexA效应元件(LexA-re-sponsive elementl,LRE),通常是数个GRE或LRE串联置于启动子的上游。Segawa等[15]在该系统应用PSA启动表达促调亡蛋白ex-PolyQ，表达水平提高了两个数量级，且仅PSA阳性前列腺癌细胞发生凋亡。Nettel-beck[16]等成功将该系统构建于一个逆转录病毒载体中，并将组织特异性启动子的活性提高了数十倍。
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此外，Stao等[17]巧妙地将Cre/loxP系统应用于靶向转录，也获得了组织特异性高水平表达。他们构建了两个载体：一个为调控载体，以AFP启动子指导重组酶Cre的表达；另一个为载载体，用强启动子CAG启动目的基因之间插入一个终止转录的阻遏单元，阻遏单元两侧各有一个loxP位点(34nt)。这两个载体同时感染细胞后，Cre只在AFP阳性细胞表达，识别loxP位点切除阻遏单元，CAG启动子顺利启动下少游基因的表达。体外实验中，表达水平比对照高50倍，且严格表达于AFP阳性细胞，肿瘤模型的体内实验也显示了相同的结果。
靶向转录已成为提高基因治疗安全性的重要手段，但还存在一些问题。首先，单靠5´侧翼序列还不能保证靶向转录的侧得进行胃些基因的顺利表达还需要内含子和远端调控序列的参与，因此LCR及绝缘子将成为新一代靶向转录载体的重要元素。但现有载体的包装容量有限，无法容纳较大片段的调控元件，因此一方面要确定能满足载体容量限制的最小LCR及绝缘子序列，另一方面需要研究和开发大容量载体以容纳更多、更大的转录调控元件。令人鼓舞的是，现在已出现了一种新的大容量AdV载体，它不含病毒结构基因，包装容量可达36kb,同时毒性和免疫原性大大降低，利用这种载体进行基因组基因的组织特异性表达已经取得成功[18]。其次，现有的靶向转录调控系统还存在着调控的精确性、外源诱导剂的毒性和转录因子的免疫原性等问题，有待于进一步完善。从这个角度来说，能在疾病状态下诱导活化的启动子具有很大的潜力，它不仅能使目的基因选择性表达于疾病组织，而且表达水平能随疾病发展的不同程度自动调节，并在病理状态消失后自动停止表达。随着对基因表达调控机制的深入了解，将来有可能实现外源基因在表达空间、时间和水平上更为精确的调控。
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作者单位：第二军医大学药学院生化药学教研室(上海，200433)
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