移植性大鼠恶性垂体腺瘤模型的建立及其生物学特性
王之敏 惠国桢 胡锦 康苏娅 邱信芳
摘 要 目的 建立一种符合临床垂体腺瘤生物学特征的动物模型。方法 体外培养大鼠恶性垂体腺瘤细胞(mGH3)，通过立体定向将mGH3细胞1×109个/L移植至大鼠1侧侧脑室，病理检查移植瘤生长情况，放射免疫法监测循环中大鼠生长激素(rGH)水平。结果 体外培养的mGH3细胞具有分泌rGH的能力，大鼠脑室内接种mGH3细胞后3周，出现肢端肥大、尾巴增粗、毛发增多、结膜水肿等改变，荷瘤鼠平均生存(44.2±5.6) d，肿瘤向周围脑组织浸润性生长，肿瘤细胞异形性明显，肿瘤新生血管丰富；从第3周起大鼠循环中rGH水平逐渐升高直至死亡。结论 同种移植性大鼠恶性垂体腺瘤具有浸润性、高血运性和释放生长激素的能力，是一种较理想的垂体腺瘤动物模型。
关键词：垂体腺瘤 动物模型 大鼠
, 百拇医药
尽管大多数垂体腺瘤组织学常为良性表现，但生物学特性往往呈恶性侵袭生长。本研究旨在建立一种大鼠脑内移植性恶性垂体腺瘤模型，并对其生物学特性进行研究，现报道如下。材料和方法
1.材料：恶性大鼠垂体腺瘤细胞株(mGH3)由日本长崎大学秋野公造博士惠赠；F12细胞培养(Gibco公司)；胎牛血清，马血清(华东理工大学)；大鼠生长激素单抗(美国NIDDK Rat-RIA Kit)；雌性Wistar-Furth大鼠体重200～250 g(由日本引进，复旦大学实验动物房饲养)；实验动物立体定向仪(江湾Ⅱ型)。
2.方法：(1)肿瘤细胞培养：mGH3细胞用F12培养液+15.0%马血清+2.5%胎牛血清，常规加入青霉素、链霉素各100 U/ml，采用全封闭或半封闭37 ℃、体积分数为5%CO2培养。(2)体外培养mGH3细胞及生长激素分泌量测定：参照文献[1]略加改进。计数5×105个细胞接种于10 ml培养瓶中，24 h后移去培养液，用无血清的F12培养基洗细胞4次，最后1次洗液中无生长激素(GH)。换以同样血清的10 ml F12培养基再培养3 d，分别在24、48、72 h取0.3 ml用放射免疫法(RIA)作激素测定。(3)大鼠脑室内恶性垂体腺瘤模型的建立：取对数生长的mGH3细胞，经消化、磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤2次，制成细胞悬液，待接种。实验动物为雌性Wistar-Furth大鼠，体重200～250 g。按50 mg/kg体重戊巴比妥腹腔内注射麻醉，固定于大鼠脑立体定向架，碘伏消毒，正中切开头皮，剥离骨膜，钻颅按坐标靶向定位(冠状缝后1 mm、中线旁1.5 mm、硬膜下4.5 mm，将肝素化的导管插入脑室，接种细胞量为1×109 个/L。注射时间为10～15 min，注射完毕继续留针5 min后缓慢退出，骨蜡封闭导管开口及骨窗，缝合头皮。(4)大鼠血样本抽取及移植瘤病理观察：大鼠脑内接种mGH3细胞后分笼饲养，观察生长状态，每隔1周随机抽取3只大鼠，麻醉后心脏穿刺抽血，立即离心分离血清，-70 ℃保存，采用RIA法整批待测大鼠生长激素(rGH)。大鼠断头处死，完整剥离脑组织，3 mm层厚冠状面切片，肉眼观察肿瘤生长情况，再作病理切片，HE染色镜下观察。
, 百拇医药
结 果
1.体外mGH3细胞形态观察及其rGH分泌功能：mGH3细胞在2.5%胎牛血清培养基中生长良好，细胞倍增时间约为24 h；在相差显微镜下见肿瘤细胞呈圆形或椭圆形，胞浆突出较少，核较大呈圆形位于中央。在消除培养基中血清本底影响后，5×105个mGH3细胞在10 ml培养液中培养24、48、72 h 后rGH分泌量分别为(52.1±4.2) μg/L、(121.4±7.6) μg/L、(157.8±10.5) μg/L。
2.大鼠脑内移植性恶性垂体腺瘤模型的生物学特征：1×106个 mGH3细胞脑室内接种后3周内大鼠无明显改变，3周后出现肢端肥大症，包括软组织水肿、四肢末端粗大、毛发增多、结膜水肿等改变，5周后大鼠出现厌食，消瘦、恶液质改变，6周左右出现死亡，平均生存(44.2±5.6) d。第4周时可见肿瘤生长于1侧侧脑室，已向第3脑室和周围脑组织浸润性生长。第6周时见肿瘤充满脑室，并向周围脑组织浸润生长，中线移位，压迫对侧。死亡原因主要为占位效应引起颅内高压，但死亡时肿瘤体积较C6脑胶质瘤小，可能循环中高生长激素水平也是引起死亡的原因之一。病理切片镜下见肿瘤细胞圆形丰富、大小一致，核大、核染色凝聚，核仁明显，核分裂相多见、5～8个/10 HP，胞浆丰富，粉红色，间质内血管丰富，有血窦。细胞具有垂体腺瘤的病理学特征，但异形变更明显。监测循环中生长激素的水平，接种后1～2周，未见rGH水平明显上升，从第3周起，rGH水平开始上升，以后上升趋势加快，至死亡前rGH水平达到最高(图1)。
, 百拇医药
图1 荷瘤鼠体内生长激素水平变化
讨 论
由于垂体腺瘤生理和解剖位置的特殊性，建立一种既符合临床特点又达到实验要求的垂体腺瘤模型较困难。通过雌激素可诱发垂体腺瘤，但有较大的随机性，诱发瘤种类不一，性质不稳定。采用转基因方法可以建立性质稳定的垂体腺瘤。目前研究最多的是可移植性垂体腺瘤动物模型。人脑垂体腺瘤细胞由于多种原因，尚未见有建株报道。我们在Akino等[2]研究的基础上加以改良，成功地将mGH3细胞植入Wistar-Furth大鼠脑室内，肿瘤能沿脑室壁生长，移植后第4周，可见肿瘤充满侧脑室，并向第3脑室、脑室周围脑实质内浸润性生长，肿瘤新生血管极丰富，肿瘤细胞圆形，核分裂相多见，异形性明显，并能向循环中释放生长激素。荷瘤鼠表现出与临床肢端肥大症病人相似的症状。该肿瘤生物学特征同临床上常见的侵袭性垂体腺瘤和垂体癌相近，是一种较为理想的恶性垂体腺瘤动物模型。
, 百拇医药
志谢 秋野公造博士提供mGH3细胞株；Dr.Ratti提供NIDDK Rat-RIA Kit
作者单位：王之敏(215006苏州医学院附属第一医院脑外科)
惠国桢(215006苏州医学院附属第一医院脑外科)
胡锦(215006苏州医学院附属第一医院脑外科)
康苏娅(215006苏州医学院附属第一医院脑外科 病理科)
邱信芳(复旦大学遗传所)
参考文献
[1]Seo H, Refetoff S, Fang V. Induction of hypothroidism and hypoprolactinemia by growth horomone producing rat pitutary tumors. Endocrinology,1977,100:216-217.
[2]Akino K,Ohtsuru A,Yano H,et al.Anisense inhibition of parathyro-
id hormone-related peptide gene expression reduces malignant pituitary tumor progression and metastases in the rat.Cancer Res,1996,56:77-79., 百拇医药
摘 要 目的 建立一种符合临床垂体腺瘤生物学特征的动物模型。方法 体外培养大鼠恶性垂体腺瘤细胞(mGH3)，通过立体定向将mGH3细胞1×109个/L移植至大鼠1侧侧脑室，病理检查移植瘤生长情况，放射免疫法监测循环中大鼠生长激素(rGH)水平。结果 体外培养的mGH3细胞具有分泌rGH的能力，大鼠脑室内接种mGH3细胞后3周，出现肢端肥大、尾巴增粗、毛发增多、结膜水肿等改变，荷瘤鼠平均生存(44.2±5.6) d，肿瘤向周围脑组织浸润性生长，肿瘤细胞异形性明显，肿瘤新生血管丰富；从第3周起大鼠循环中rGH水平逐渐升高直至死亡。结论 同种移植性大鼠恶性垂体腺瘤具有浸润性、高血运性和释放生长激素的能力，是一种较理想的垂体腺瘤动物模型。
关键词：垂体腺瘤 动物模型 大鼠
, 百拇医药
尽管大多数垂体腺瘤组织学常为良性表现，但生物学特性往往呈恶性侵袭生长。本研究旨在建立一种大鼠脑内移植性恶性垂体腺瘤模型，并对其生物学特性进行研究，现报道如下。材料和方法
1.材料：恶性大鼠垂体腺瘤细胞株(mGH3)由日本长崎大学秋野公造博士惠赠；F12细胞培养(Gibco公司)；胎牛血清，马血清(华东理工大学)；大鼠生长激素单抗(美国NIDDK Rat-RIA Kit)；雌性Wistar-Furth大鼠体重200～250 g(由日本引进，复旦大学实验动物房饲养)；实验动物立体定向仪(江湾Ⅱ型)。
2.方法：(1)肿瘤细胞培养：mGH3细胞用F12培养液+15.0%马血清+2.5%胎牛血清，常规加入青霉素、链霉素各100 U/ml，采用全封闭或半封闭37 ℃、体积分数为5%CO2培养。(2)体外培养mGH3细胞及生长激素分泌量测定：参照文献[1]略加改进。计数5×105个细胞接种于10 ml培养瓶中，24 h后移去培养液，用无血清的F12培养基洗细胞4次，最后1次洗液中无生长激素(GH)。换以同样血清的10 ml F12培养基再培养3 d，分别在24、48、72 h取0.3 ml用放射免疫法(RIA)作激素测定。(3)大鼠脑室内恶性垂体腺瘤模型的建立：取对数生长的mGH3细胞，经消化、磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤2次，制成细胞悬液，待接种。实验动物为雌性Wistar-Furth大鼠，体重200～250 g。按50 mg/kg体重戊巴比妥腹腔内注射麻醉，固定于大鼠脑立体定向架，碘伏消毒，正中切开头皮，剥离骨膜，钻颅按坐标靶向定位(冠状缝后1 mm、中线旁1.5 mm、硬膜下4.5 mm，将肝素化的导管插入脑室，接种细胞量为1×109 个/L。注射时间为10～15 min，注射完毕继续留针5 min后缓慢退出，骨蜡封闭导管开口及骨窗，缝合头皮。(4)大鼠血样本抽取及移植瘤病理观察：大鼠脑内接种mGH3细胞后分笼饲养，观察生长状态，每隔1周随机抽取3只大鼠，麻醉后心脏穿刺抽血，立即离心分离血清，-70 ℃保存，采用RIA法整批待测大鼠生长激素(rGH)。大鼠断头处死，完整剥离脑组织，3 mm层厚冠状面切片，肉眼观察肿瘤生长情况，再作病理切片，HE染色镜下观察。
, 百拇医药
结 果
1.体外mGH3细胞形态观察及其rGH分泌功能：mGH3细胞在2.5%胎牛血清培养基中生长良好，细胞倍增时间约为24 h；在相差显微镜下见肿瘤细胞呈圆形或椭圆形，胞浆突出较少，核较大呈圆形位于中央。在消除培养基中血清本底影响后，5×105个mGH3细胞在10 ml培养液中培养24、48、72 h 后rGH分泌量分别为(52.1±4.2) μg/L、(121.4±7.6) μg/L、(157.8±10.5) μg/L。
2.大鼠脑内移植性恶性垂体腺瘤模型的生物学特征：1×106个 mGH3细胞脑室内接种后3周内大鼠无明显改变，3周后出现肢端肥大症，包括软组织水肿、四肢末端粗大、毛发增多、结膜水肿等改变，5周后大鼠出现厌食，消瘦、恶液质改变，6周左右出现死亡，平均生存(44.2±5.6) d。第4周时可见肿瘤生长于1侧侧脑室，已向第3脑室和周围脑组织浸润性生长。第6周时见肿瘤充满脑室，并向周围脑组织浸润生长，中线移位，压迫对侧。死亡原因主要为占位效应引起颅内高压，但死亡时肿瘤体积较C6脑胶质瘤小，可能循环中高生长激素水平也是引起死亡的原因之一。病理切片镜下见肿瘤细胞圆形丰富、大小一致，核大、核染色凝聚，核仁明显，核分裂相多见、5～8个/10 HP，胞浆丰富，粉红色，间质内血管丰富，有血窦。细胞具有垂体腺瘤的病理学特征，但异形变更明显。监测循环中生长激素的水平，接种后1～2周，未见rGH水平明显上升，从第3周起，rGH水平开始上升，以后上升趋势加快，至死亡前rGH水平达到最高(图1)。
, 百拇医药
图1 荷瘤鼠体内生长激素水平变化
讨 论
由于垂体腺瘤生理和解剖位置的特殊性，建立一种既符合临床特点又达到实验要求的垂体腺瘤模型较困难。通过雌激素可诱发垂体腺瘤，但有较大的随机性，诱发瘤种类不一，性质不稳定。采用转基因方法可以建立性质稳定的垂体腺瘤。目前研究最多的是可移植性垂体腺瘤动物模型。人脑垂体腺瘤细胞由于多种原因，尚未见有建株报道。我们在Akino等[2]研究的基础上加以改良，成功地将mGH3细胞植入Wistar-Furth大鼠脑室内，肿瘤能沿脑室壁生长，移植后第4周，可见肿瘤充满侧脑室，并向第3脑室、脑室周围脑实质内浸润性生长，肿瘤新生血管极丰富，肿瘤细胞圆形，核分裂相多见，异形性明显，并能向循环中释放生长激素。荷瘤鼠表现出与临床肢端肥大症病人相似的症状。该肿瘤生物学特征同临床上常见的侵袭性垂体腺瘤和垂体癌相近，是一种较为理想的恶性垂体腺瘤动物模型。
, 百拇医药
志谢 秋野公造博士提供mGH3细胞株；Dr.Ratti提供NIDDK Rat-RIA Kit
作者单位：王之敏(215006苏州医学院附属第一医院脑外科)
惠国桢(215006苏州医学院附属第一医院脑外科)
胡锦(215006苏州医学院附属第一医院脑外科)
康苏娅(215006苏州医学院附属第一医院脑外科 病理科)
邱信芳(复旦大学遗传所)
参考文献
[1]Seo H, Refetoff S, Fang V. Induction of hypothroidism and hypoprolactinemia by growth horomone producing rat pitutary tumors. Endocrinology,1977,100:216-217.
[2]Akino K,Ohtsuru A,Yano H,et al.Anisense inhibition of parathyro-
id hormone-related peptide gene expression reduces malignant pituitary tumor progression and metastases in the rat.Cancer Res,1996,56:77-79., 百拇医药