肠源性内毒素移位后的体内分布
刘竞 崔乃强 赵琪 吴咸中
摘 要 目的：探讨肠源性内毒素移位后在腹膜炎大鼠各脏器中分布。方法：以125I-LPS对大鼠灌胃后，检测各脏器单位组织重量中内毒素含量。结果：腹膜炎组各主要脏器单位重量中的内毒素含量增加(P<0.05)，由高至低为肾、肺、肝、胰、肠系膜淋巴结、心脏(P<0.05)。先锋Ⅵ号及多粘菌素B可降低腹膜炎大鼠脏器中内毒素含量。结论：急性感染性腹膜炎可致肠源性内毒素移位增加。腹膜炎时易发生肾衰、呼衰与其单位组织中内毒素含量有关。先锋Ⅵ号、多粘菌素B对肠源性内毒素移位有一定的抑制作用。
关键词：肠源性内毒素 体内分布 腹膜炎
腹膜炎是外科临床中常见的病症之一。它可造成肠屏障的破坏，使肠道中的细菌和内毒素移位入血，形成肠源性内毒素血症[1]。移位的内毒素可导致多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)[2]。本研究观察了腹膜炎大鼠模型在125I-LPS灌胃后，内毒素的脏器分布变化，并对某些抗生素抑制肠源性内毒素移位的作用进行观察。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物模型的建立
腹膜炎形成液的制备 用2.5%琼脂肉汤和1%硫酸钡溶液经高压灭菌后，作为佐剂备用。取临床急性化脓性阑尾炎手术标本中分离出的致病大肠杆菌(E.coli)经VITEK-AMSXT系统鉴定，证实为大肠杆菌(生物号：3001721264)，培养18小时，以生理盐水调细菌数为1×109 cfu/ml，加入等量佐剂，即为腹膜炎形成液。
动物Wistar大鼠，雌雄各半，体重190±10 g(购于军事医学科学院)，将上述大肠杆菌悬液注入大鼠腹腔，1.0 ml/100 g，引发腹膜炎，于模型制备后做相应处理。
乳糜液的收集 3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧固定于操作板上。上腹部去毛消毒，做正中切口约1.5厘米。进腹后，将左肝、胃推向上，小肠及左肾翻向右侧。于脊柱左侧约1厘米处打开后腹膜，找到腹主动脉。在其左后方乳白色半透明薄壁管道，即为乳糜管腹段。将消毒去热源一次性5号半头皮针前部弯成鱼钩形，尖端刺入乳糜管，即可引流出乳糜液。为收集方便头皮针后端连接一次性注射器，略加负压，可加速收集过程。操作完成后，将左肝、胃、小肠、左肾复位。缝合切口，敷以无菌纱布。引流管自切口下方引出腹腔。
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1.2 药物与试剂 大肠肝菌内毒素(E.Coli.O111∶B4.LPS)购自SIGMA公司。 125I-LPS由中国医学科学院核医学技术中心标记。标记率为92.1%。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及治疗方法 Wistar大鼠，雌雄各半，共24只。随机分组后立即造模，并给予相应处理。健康对照组(6只)：生理盐水灌胃，2 ml/次，2次/日；腹膜炎组(6只)：生理盐水灌胃并给予以下处理，2 ml/次，2次/日；腹膜炎+头孢拉定组(6只)：头孢拉定溶液(0.12 g/ml，施贵宝制药有限公司，批号：960318)灌胃，2 ml/次，2次/日；腹膜炎+多粘菌素B组(6只)：多粘菌素B(1万单位/ml，日本光和制药厂，批号：961227)0.5 ml/次，2次/日，肌注。
1.3.2 观测指标
, 百拇医药
125I放射活性观察 制备后48小时，每只大鼠给予125I-LPS 1 ml灌胃。5小时后以3%戊巴比妥钠麻醉后，解剖。引流胸导管内淋巴液，并抽取门静脉血、股静脉血、尿(膀胱内)各1 ml，留取肺左叶、肝左叶、肠系膜集合淋巴结(MLN)、肾、胰腺、脾、心、粪便(横结肠内)，分别称重，于r-晶闪测定仪测定放射活性，结果以dpm/mg表示。
急性感染性腹膜炎大鼠死亡率的观察 Wistar大鼠，分组条件及处理方法同前(每组30只)，观察48小时死亡率。
1.4 数据统计处理 两组死亡率比较，以χ2检验处理。其余结果行方差分析及q检验。
2 结果
2.1 内毒素的体内分布
脏器组织及粪便中LPS的分布情况 健康对照组及腹膜炎组，两组的脏器组织中LPS的分布规律基本一致。其中肾脏和肺单位组织中内毒素含量较高，其次是肝、脾、胰腺、MLN、心脏(P<0.05)，见表1，表2。
, 百拇医药
表1 大鼠各脏器组织中125I-LPS的放射活性值(1 000 dpm/g)
健康对照
腹膜炎
炎+先锋Ⅵ
炎+多粘菌素
肺
2.36±0.33*▲
2.98±0.42▲
4.29±1.33
2.07±0.43**
, http://www.100md.com 肝
1.48±0.22**
2.34±0.56
1.74±0.64*
1.39±0.42**
肾
3.24±0.46*▲
4.48±1.01▲
3.17±0.45*
3.30±1.07
, http://www.100md.com 淋巴结
1.26±0.35**
2.26±0.63
1.44±0.64**
1.60±0.39*
胰腺
1.58±0.35
2.20±1.02
2.11±1.04
1.45±0.35
脾
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1.56±0.22
2.29±1.41
1.45±0.56
1.58±0.47
心
1.11±0.24
1.29±0.40
1.12±0.52
1.12±0.27
各组均与腹膜炎组比较*P<0.05，**P<0.01
纵向各脏器之间两两比较▲P<0.05表2 大鼠体液及粪便中125I-LPS的放射活性值(1 000 dpm/g)
, http://www.100md.com
健康对照
腹膜炎
炎+先锋Ⅵ
炎+多粘菌素
股静脉
2.70±0.26*▲▲
3.67±0.93▲▲
3.29±0.29
2.78±0.40*
门静脉
2.85±0.60**▲▲
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3.99±0.85▲▲
2.45±0.48**
2.90±0.49*
TDL
20.73±10.02**
41.29±8.03
25.46±5.68**
29.24±5.91**
尿
44.44±19.90▲▲
, http://www.100md.com
64.27±14.21▲▲
50.74±18.47
18.33±5.66**
粪
50.95±13.76**
38.21±11.31
33.76±8.41
34.77±10.65
各组均与腹膜炎组比较*P<0.05，**P<0.01
纵向各组尿、血液与TDL比较▲P<0.05，▲▲P<0.01
, http://www.100md.com
体内液体成分中LPS的含量变化 尿中单位体积的LPS含量最高，其次是胸导管淋巴液(TDL)，两者均明显高于股静脉和门静脉血中的内毒素含量(P<0.01)。
2.2 各种治疗方法对脏器组织中内毒素的清除作用
腹膜炎可促进内毒素移位 从各组之间比较可发现，腹膜炎与健康对照比较，大部分组织脏器及体液中内毒素含量显著增加(P<0.05)或有增加趋势。
清除作用的比较 头孢拉定及多粘菌素对大部分组织及体液中的内毒素均有较好的减毒作用。但头孢拉定却使肺脏中的内毒毒含量增加，而多粘菌素B效果较好，见表3。
表3 药物对腹膜炎大鼠死亡率的影响
健康对照组
腹膜炎组
, 百拇医药
N.S.
N.S.
头孢拉定
多粘菌素B
死亡数
0
22
9
14
死亡率%
0**
73.3
30.0**
, http://www.100md.com
46.6*
各组与腹膜炎+N.S.组比较*P<0.05，**P<0.01
2.3 死亡率及大鼠一般状况的观察 头孢拉定、多粘菌素B两个治疗组，均能显著降低腹膜炎的死亡率，但组间无明显差别。对濒死的大鼠观察发现，除反应差、懒动、竖毛等现象外，还有呼吸急促、血尿等特点。
3 讨论
内毒素在各组织脏器中的分布不同 各种组织细胞结合或携带内毒素的能力不同。本实验发现肾脏单位组织中内毒素含量最多，其次是肺脏，它们是受内毒素攻击较重的靶器官。这可能是腹内感染患者易发生肾衰和呼吸衰竭的原因之一。因内毒素移位入脏器后，不能直接造成组织损伤，但可通过激活免疫功能细胞产生大量的致损细胞因子，如TNF、TXA2、PAF、内皮素及超氧化阴离子等，使组织细胞进一步受损，导致MODS，甚至多脏器衰竭(MOF)[3]。
, 百拇医药
腹膜炎可使各组织脏器中的内毒素含量增加 由于腹膜炎可造成肠粘膜低灌流状态，使粘膜缺血、缺氧、坏死、脱落，肠粘膜屏障功能障碍，肠粘膜机械屏障的破坏为内毒素移位创造了适宜途径[4]。感染性腹膜炎造成肠道微生态平衡紊乱致使部分菌群优势繁殖。一般是革兰氏阴性菌，则内毒素随之大量生成。内毒素池增加是肠源性内毒素增加移位的原因之一。另外，弥漫性腹膜炎发病时系统免疫功能亢进产生过度免疫反应(superior immune reaction ,SIR)及组织细胞的过度炎性损伤(superior inflammting injury ,SII)进一步加重肠屏障的破坏。移位入肠组织及血液中的内毒素不能被及时清除，而侵入脏器[5]。
头孢拉定(cefesulodin)是目前临床应用较广泛的一种广谱抗生素，对已入血的内毒素无破坏作用，而且它可以使细菌死亡，菌体细胞壁破碎，释放出更多的内毒素[6]。本实验中发现，头孢拉定使感染性腹膜炎大鼠肺中内毒素升高。但由于其可降低肠道内细菌的绝对数，减少内毒素的产生，使TDL及门静脉对内毒素的吸收减少，进而使肝、肾、肠系膜淋巴结的内毒素含量下降，明显的降低了腹膜炎大鼠的死亡率。
, 百拇医药
多粘菌素B(polymyxin B)是一种多肽类抗生素，进年来发现它有抗内毒素的作用。体外试验也证实其可降解内毒素[7]。本实验结果表明，它对体内大多数组织脏器都有较好的减毒作用，且亦能显著降低腹膜炎大鼠的死亡率。尿中的内毒素含量减少，可能是由于其直接降解尿中内毒素或影响肾的滤过功能，而使排出减少引起。故临床应用多粘菌素B时，只要注意剂量适当或采用其它给药方法，对治疗肠源性内毒素血症应取得良好的效果，该方面尚需进一步探讨。
作者单位：刘 竞(北京解放军263医院，101149)
崔乃强(天津市中西医结合急腹症研究所)
赵 琪(天津市中西医结合急腹症研究所)
吴咸中(天津市中西医结合急腹症研究所)
参考文献
, 百拇医药
[1]Lemaire L，Lanschot JV ,Stoutenbeek C,et al .Thoracic duct in patients with multiple organ[J].Am Surg ,1999,229:128-136.
[2]Yang-Ming Yao .Pathogemesis of hemorrhage induced bacteria endotoxin translocation in rat[J].Ann Surg,1995,22:398-403.
[3]Kimura F,Miyazaki M,Suwa T,et al .Plasmz concentration of cytokine antagonists in patients with infection following liver resection[J].Brit J Surg,1998,85:1631-1635.
, http://www.100md.com
[4]Cullen JJ,Ephgrave KS,Hemann LL,et al .Metabolism of superoxide dismutase during the adynamic lleus of endotoxemia[J].Eur Surg Res ,1998,30:326-333.
[5]Grzelak I,Olszewski L,Zaloska M, et al .Surgical trauma evokes a rise in the frequency of hematopoietic progenitor cell and cytokine levels in blood circulation[J].Eur Surg Res,1998,30:198-204.
[6]Lshikawa M,Miyauch T,Yagi K.Clinical relevance of antibiotic-induced endotoxin release in patients undergoing hepatic[J].World J Surg,1999,23:85-92.
[7]Yao -Ym,Tian,Sheng-ZY,et al .Inhibitory effects of low dese polymyxinB on hemorrhage induce endotoxin/bacterial translocation and cytobine formation in rats[J].J Trauma ,1995,38(6):924-931., 百拇医药
摘 要 目的：探讨肠源性内毒素移位后在腹膜炎大鼠各脏器中分布。方法：以125I-LPS对大鼠灌胃后，检测各脏器单位组织重量中内毒素含量。结果：腹膜炎组各主要脏器单位重量中的内毒素含量增加(P<0.05)，由高至低为肾、肺、肝、胰、肠系膜淋巴结、心脏(P<0.05)。先锋Ⅵ号及多粘菌素B可降低腹膜炎大鼠脏器中内毒素含量。结论：急性感染性腹膜炎可致肠源性内毒素移位增加。腹膜炎时易发生肾衰、呼衰与其单位组织中内毒素含量有关。先锋Ⅵ号、多粘菌素B对肠源性内毒素移位有一定的抑制作用。
关键词：肠源性内毒素 体内分布 腹膜炎
腹膜炎是外科临床中常见的病症之一。它可造成肠屏障的破坏，使肠道中的细菌和内毒素移位入血，形成肠源性内毒素血症[1]。移位的内毒素可导致多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)[2]。本研究观察了腹膜炎大鼠模型在125I-LPS灌胃后，内毒素的脏器分布变化，并对某些抗生素抑制肠源性内毒素移位的作用进行观察。
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1 材料与方法
1.1 动物模型的建立
腹膜炎形成液的制备 用2.5%琼脂肉汤和1%硫酸钡溶液经高压灭菌后，作为佐剂备用。取临床急性化脓性阑尾炎手术标本中分离出的致病大肠杆菌(E.coli)经VITEK-AMSXT系统鉴定，证实为大肠杆菌(生物号：3001721264)，培养18小时，以生理盐水调细菌数为1×109 cfu/ml，加入等量佐剂，即为腹膜炎形成液。
动物Wistar大鼠，雌雄各半，体重190±10 g(购于军事医学科学院)，将上述大肠杆菌悬液注入大鼠腹腔，1.0 ml/100 g，引发腹膜炎，于模型制备后做相应处理。
乳糜液的收集 3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧固定于操作板上。上腹部去毛消毒，做正中切口约1.5厘米。进腹后，将左肝、胃推向上，小肠及左肾翻向右侧。于脊柱左侧约1厘米处打开后腹膜，找到腹主动脉。在其左后方乳白色半透明薄壁管道，即为乳糜管腹段。将消毒去热源一次性5号半头皮针前部弯成鱼钩形，尖端刺入乳糜管，即可引流出乳糜液。为收集方便头皮针后端连接一次性注射器，略加负压，可加速收集过程。操作完成后，将左肝、胃、小肠、左肾复位。缝合切口，敷以无菌纱布。引流管自切口下方引出腹腔。
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1.2 药物与试剂 大肠肝菌内毒素(E.Coli.O111∶B4.LPS)购自SIGMA公司。 125I-LPS由中国医学科学院核医学技术中心标记。标记率为92.1%。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及治疗方法 Wistar大鼠，雌雄各半，共24只。随机分组后立即造模，并给予相应处理。健康对照组(6只)：生理盐水灌胃，2 ml/次，2次/日；腹膜炎组(6只)：生理盐水灌胃并给予以下处理，2 ml/次，2次/日；腹膜炎+头孢拉定组(6只)：头孢拉定溶液(0.12 g/ml，施贵宝制药有限公司，批号：960318)灌胃，2 ml/次，2次/日；腹膜炎+多粘菌素B组(6只)：多粘菌素B(1万单位/ml，日本光和制药厂，批号：961227)0.5 ml/次，2次/日，肌注。
1.3.2 观测指标
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125I放射活性观察 制备后48小时，每只大鼠给予125I-LPS 1 ml灌胃。5小时后以3%戊巴比妥钠麻醉后，解剖。引流胸导管内淋巴液，并抽取门静脉血、股静脉血、尿(膀胱内)各1 ml，留取肺左叶、肝左叶、肠系膜集合淋巴结(MLN)、肾、胰腺、脾、心、粪便(横结肠内)，分别称重，于r-晶闪测定仪测定放射活性，结果以dpm/mg表示。
急性感染性腹膜炎大鼠死亡率的观察 Wistar大鼠，分组条件及处理方法同前(每组30只)，观察48小时死亡率。
1.4 数据统计处理 两组死亡率比较，以χ2检验处理。其余结果行方差分析及q检验。
2 结果
2.1 内毒素的体内分布
脏器组织及粪便中LPS的分布情况 健康对照组及腹膜炎组，两组的脏器组织中LPS的分布规律基本一致。其中肾脏和肺单位组织中内毒素含量较高，其次是肝、脾、胰腺、MLN、心脏(P<0.05)，见表1，表2。
, 百拇医药
表1 大鼠各脏器组织中125I-LPS的放射活性值(1 000 dpm/g)
健康对照
腹膜炎
炎+先锋Ⅵ
炎+多粘菌素
肺
2.36±0.33*▲
2.98±0.42▲
4.29±1.33
2.07±0.43**
, http://www.100md.com 肝
1.48±0.22**
2.34±0.56
1.74±0.64*
1.39±0.42**
肾
3.24±0.46*▲
4.48±1.01▲
3.17±0.45*
3.30±1.07
, http://www.100md.com 淋巴结
1.26±0.35**
2.26±0.63
1.44±0.64**
1.60±0.39*
胰腺
1.58±0.35
2.20±1.02
2.11±1.04
1.45±0.35
脾
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1.56±0.22
2.29±1.41
1.45±0.56
1.58±0.47
心
1.11±0.24
1.29±0.40
1.12±0.52
1.12±0.27
各组均与腹膜炎组比较*P<0.05，**P<0.01
纵向各脏器之间两两比较▲P<0.05表2 大鼠体液及粪便中125I-LPS的放射活性值(1 000 dpm/g)
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健康对照
腹膜炎
炎+先锋Ⅵ
炎+多粘菌素
股静脉
2.70±0.26*▲▲
3.67±0.93▲▲
3.29±0.29
2.78±0.40*
门静脉
2.85±0.60**▲▲
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3.99±0.85▲▲
2.45±0.48**
2.90±0.49*
TDL
20.73±10.02**
41.29±8.03
25.46±5.68**
29.24±5.91**
尿
44.44±19.90▲▲
, http://www.100md.com
64.27±14.21▲▲
50.74±18.47
18.33±5.66**
粪
50.95±13.76**
38.21±11.31
33.76±8.41
34.77±10.65
各组均与腹膜炎组比较*P<0.05，**P<0.01
纵向各组尿、血液与TDL比较▲P<0.05，▲▲P<0.01
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体内液体成分中LPS的含量变化 尿中单位体积的LPS含量最高，其次是胸导管淋巴液(TDL)，两者均明显高于股静脉和门静脉血中的内毒素含量(P<0.01)。
2.2 各种治疗方法对脏器组织中内毒素的清除作用
腹膜炎可促进内毒素移位 从各组之间比较可发现，腹膜炎与健康对照比较，大部分组织脏器及体液中内毒素含量显著增加(P<0.05)或有增加趋势。
清除作用的比较 头孢拉定及多粘菌素对大部分组织及体液中的内毒素均有较好的减毒作用。但头孢拉定却使肺脏中的内毒毒含量增加，而多粘菌素B效果较好，见表3。
表3 药物对腹膜炎大鼠死亡率的影响
健康对照组
腹膜炎组
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N.S.
N.S.
头孢拉定
多粘菌素B
死亡数
0
22
9
14
死亡率%
0**
73.3
30.0**
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46.6*
各组与腹膜炎+N.S.组比较*P<0.05，**P<0.01
2.3 死亡率及大鼠一般状况的观察 头孢拉定、多粘菌素B两个治疗组，均能显著降低腹膜炎的死亡率，但组间无明显差别。对濒死的大鼠观察发现，除反应差、懒动、竖毛等现象外，还有呼吸急促、血尿等特点。
3 讨论
内毒素在各组织脏器中的分布不同 各种组织细胞结合或携带内毒素的能力不同。本实验发现肾脏单位组织中内毒素含量最多，其次是肺脏，它们是受内毒素攻击较重的靶器官。这可能是腹内感染患者易发生肾衰和呼吸衰竭的原因之一。因内毒素移位入脏器后，不能直接造成组织损伤，但可通过激活免疫功能细胞产生大量的致损细胞因子，如TNF、TXA2、PAF、内皮素及超氧化阴离子等，使组织细胞进一步受损，导致MODS，甚至多脏器衰竭(MOF)[3]。
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腹膜炎可使各组织脏器中的内毒素含量增加 由于腹膜炎可造成肠粘膜低灌流状态，使粘膜缺血、缺氧、坏死、脱落，肠粘膜屏障功能障碍，肠粘膜机械屏障的破坏为内毒素移位创造了适宜途径[4]。感染性腹膜炎造成肠道微生态平衡紊乱致使部分菌群优势繁殖。一般是革兰氏阴性菌，则内毒素随之大量生成。内毒素池增加是肠源性内毒素增加移位的原因之一。另外，弥漫性腹膜炎发病时系统免疫功能亢进产生过度免疫反应(superior immune reaction ,SIR)及组织细胞的过度炎性损伤(superior inflammting injury ,SII)进一步加重肠屏障的破坏。移位入肠组织及血液中的内毒素不能被及时清除，而侵入脏器[5]。
头孢拉定(cefesulodin)是目前临床应用较广泛的一种广谱抗生素，对已入血的内毒素无破坏作用，而且它可以使细菌死亡，菌体细胞壁破碎，释放出更多的内毒素[6]。本实验中发现，头孢拉定使感染性腹膜炎大鼠肺中内毒素升高。但由于其可降低肠道内细菌的绝对数，减少内毒素的产生，使TDL及门静脉对内毒素的吸收减少，进而使肝、肾、肠系膜淋巴结的内毒素含量下降，明显的降低了腹膜炎大鼠的死亡率。
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多粘菌素B(polymyxin B)是一种多肽类抗生素，进年来发现它有抗内毒素的作用。体外试验也证实其可降解内毒素[7]。本实验结果表明，它对体内大多数组织脏器都有较好的减毒作用，且亦能显著降低腹膜炎大鼠的死亡率。尿中的内毒素含量减少，可能是由于其直接降解尿中内毒素或影响肾的滤过功能，而使排出减少引起。故临床应用多粘菌素B时，只要注意剂量适当或采用其它给药方法，对治疗肠源性内毒素血症应取得良好的效果，该方面尚需进一步探讨。
作者单位：刘 竞(北京解放军263医院，101149)
崔乃强(天津市中西医结合急腹症研究所)
赵 琪(天津市中西医结合急腹症研究所)
吴咸中(天津市中西医结合急腹症研究所)
参考文献
, 百拇医药
[1]Lemaire L，Lanschot JV ,Stoutenbeek C,et al .Thoracic duct in patients with multiple organ[J].Am Surg ,1999,229:128-136.
[2]Yang-Ming Yao .Pathogemesis of hemorrhage induced bacteria endotoxin translocation in rat[J].Ann Surg,1995,22:398-403.
[3]Kimura F,Miyazaki M,Suwa T,et al .Plasmz concentration of cytokine antagonists in patients with infection following liver resection[J].Brit J Surg,1998,85:1631-1635.
, http://www.100md.com
[4]Cullen JJ,Ephgrave KS,Hemann LL,et al .Metabolism of superoxide dismutase during the adynamic lleus of endotoxemia[J].Eur Surg Res ,1998,30:326-333.
[5]Grzelak I,Olszewski L,Zaloska M, et al .Surgical trauma evokes a rise in the frequency of hematopoietic progenitor cell and cytokine levels in blood circulation[J].Eur Surg Res,1998,30:198-204.
[6]Lshikawa M,Miyauch T,Yagi K.Clinical relevance of antibiotic-induced endotoxin release in patients undergoing hepatic[J].World J Surg,1999,23:85-92.
[7]Yao -Ym,Tian,Sheng-ZY,et al .Inhibitory effects of low dese polymyxinB on hemorrhage induce endotoxin/bacterial translocation and cytobine formation in rats[J].J Trauma ,1995,38(6):924-931., 百拇医药