电损伤后局部应用bFGF促进周围神经再生
李学拥 陈 璧
摘要 目的：通过bFGF局部应用，观察其对神经电损伤后再生的促进作用. 方法：随机分为实验组和对照组，每组根据观察时间的长短再分为2 wk组、1 mo组和3 mo组，用 60 Hz 125 V交流电在梨状肌下缘以远损伤3 cm神经，持续时间3 s. 伤后第2日起实验组每日注射bFGF 500 AU. 对照组注射生理盐水. 结果：实验组神经的传导速度、肌张力均较对照组有明显的增加. 超微结构改变在各时间点上亦较对照组轻微，再生纤维结构较对照组成熟. 结论：局部应用bFGF后能够明显促进电损伤后神经损伤的再生.
关键词：碱性成纤维细胞生长因子 电损伤 周围神经
引言
bFGF广泛存在于生物体内,对起源于中胚层、神经外胚层组织和细胞具有显著促分裂作用. 其对神经再生的促进作用已有许多报道，对损伤神经局部应用能否促进神经再生尚未见相关报道. 我们通过bFGF局部应用，观察其对神经电损伤后的再生促进作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物实验 中国本兔24只由本校实验动物研究中心提供，雌雄不拘，体重2 kg～2.5 kg，随机分为实验组和对照组，每组根据观察时间的长短再分为2 wk组、1 mo组和3 mo组，每小组4只，3只进行实验观察，另1只备用. 由兔耳缘iv 20 g/L 戊巴比妥钠(30 mg/kg )麻醉，俯卧位四肢固定，剪除臀部和下肢的毛发，在下肢后侧正中线由月 国窝至臀大肌剪开皮肤,在月 国窝处分离皮下组织寻找月 国神经, 然后延神经走行分离肌肉充分暴露神经,使其与周围组织分离,在月 国窝至骶骨区域内实验组埋置硅胶管用以术后注射bFGF(珠海东大公司)之用. 解剖出坐骨神经后，用60 Hz 125 V交流电在梨状肌下缘以远损伤3 cm神经，持续时间3 s. 伤后2 d起在观察期内实验组每日注射bFGF 500 AU. 对照组注射生理盐水.
1.2 观察指标
1.2.1 大体检测 肉眼观察坐骨神经电损伤后大体形态的动态变化
, 百拇医药
1.2.2 电生理检查 动物观察到期后用记忆示波器检测神经传导速度，并与正常健侧对比求出其恢复率.
1.2.3 肌张力测定 采用SMUP-PC型生物信号处理系统(上海医科大学生理教研室)测定小腿三头肌的单收缩力和强直收缩力. 两者均与自身健侧小腿三头肌的肌力对照，并求出其恢复率.
1.2.4 电镜观察 ①半薄切片制作方法：将新鲜组织制成1 mm×1 mm×1 mm的小块，置于30 mL/L戊二醛磷酸缓冲液中，固定12 h，10 g/L锇酸固定1 h，梯度乙醇脱水和丙酮泡5 min，Epon812包埋，常规切片染色，镜下观察定位. ②定位后包埋块制作超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸钠双染色，在透射电镜下观察.
2 结果
2.1 大体观察 埋置的硅胶管被薄层纤维组织覆盖，颜色红润质地较脆. 两组即时损伤的神经纤维发现与电极接触区域颜色发黄，1 wk后解剖观察神经轻度水肿，颜色发红，2 wk后观察神经水肿减轻，质脆，颜色恢复正常，下肢功能受限，受损下肢足根部的毛部分脱落. 1 mo后神经颜色恢复正常，未见与周围组织粘连. bFGF组动物下肢功能明显改善，后跟毛缺失区逐渐缩小，而对照组毛缺失区加大. 3 mo时，两组动物下肢功能改善程度加大，神经外观正常，受伤下肢后跟毛缺失区范围逐渐缩小.
, 百拇医药
2.2 神经传导速度 实验组1 mo和3 mo时的传导速度明显大于对照组，但实验组3 mo时的恢复幅度没有对照组大. 2 wk时两组均没有神经冲动引出(Tab 1).
表 1 术后各时间组神经传导速度的恢复率 (n=3,x±s)
Postoperation time/mo
Group
0.5
1
3
Experiment
0
65±5a
, 百拇医药
90±3a
Control
0
46±4
61±6
aP<0.05 vs control group.2.3 肌张力 实验组各时间组肌肉单收缩力和强直收缩力除2 wk组外的恢复率与对照组相比，有显著性差异(P<0.05, Tab 2,3).
表 2 术后各时间组单收缩力恢复率的变化 (n=3,x±s)
Postoperation time/mo
Group
, http://www.100md.com
0.5
1
3
Experiment
0
34±4a
65±5a
Control
0
19±4
50±6
aP<0.05 vs control group.2.4 电镜观察 实验组：2 wk时，受损的神经纤维数目较多，损伤程度较重. 表现为无髓神经纤维轴膜破裂，轴浆外溢. 有髓神经纤维髓板层开始解体. 但微血管结构无明显变化. 仍可见到形态结构正常的神经纤维,雪旺氏细胞形态无明显变化. 1 mo时，可见到新生的神经纤维，主要以两种形式存在. ①新生的神经纤维沿原有的溃变的神经膜管生长. 镜下可见到溃变解体的髓鞘内存有结构清晰的有髓神经纤维. ②新生轴突由雪旺氏细胞形成髓鞘逐渐包裹而成. 未得到神经再支配的神经纤维结构开始解体，无髓神经纤维轴膜破裂相互融合. 有髓神经纤维髓鞘厚薄不均，并溶解形成滴状结构. 可以见到部分雪旺氏细胞内结构发生变化,线粒体肿胀、空泡增多、胞核变圆. 3 mo时，再生的神经纤维结构进一步成熟. 可见新生髓鞘较薄，但外层光滑，亦可见到尚未完全形成包裹的板层髓鞘. 无髓神经纤维数目减少，但直径增大，雪旺氏细胞包裹的无髓神经纤维数目减少，并处于细胞的外层. 胶原纤维无明显增加.
, 百拇医药
表 3 术后各时间组强直收缩力恢复率的变化 n=3,x±s)
Postoperation time/mo
Group
0.5
1
3
Experiment
0
48±5a
61±9a
Control
, 百拇医药
0
32±4
47±4
aP<0.05 vs control group. bFGF组：2 wk时，镜下观无髓神经纤维有部分的空泡形成, 表现为轴突内微丝、微管等细胞器消失，呈低密度均质状态 . 微血管内壁光滑，管腔无闭塞及栓塞，雪旺氏细胞轴突复合体无明显改变. 1 mo时，无髓神经结构开始恢复正常，空泡现象消失. 有髓神经纤维形成的髓鞘厚度较对照组大，数量较对照组多. 雪旺氏细胞轴突细胞复合体形态接近成熟. 3 mo时，溃变的神经纤维数目较对照组少，形态结构较对照组成熟.
3 讨论
成纤维细胞生长因子是一类具有广泛生物学活性的肽类物质，按其等电点(PI)的不同，分为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF). 资料表明bFGF对起源于中胚层和神经外胚层的细胞具有有效的促有丝分裂活性，对其它外胚层细胞及内胚层衍生物也具有促进有丝分裂活性. bFGF在体外的生物学活性除引起细胞的增殖反应外，还包括调节细胞的能动性、细胞分化、轴突的延伸和成活等[1～3]. 由于bFGF广泛的生物学活性，引起人们的广泛关注. 以往有关bFGF的研究多集中在中枢神经系统，对于其对外周神经损伤后作用的报道较少. 本实验通过局部长时间间断性给药观察其对电损伤后坐骨神经功能的恢复情况.
, 百拇医药
由实验结果可以看出，应用bFGF后神经功能早期恢复不太明显，2 wk时神经传导速度、肌张力及超微结构无明显的差异. 1 mo时神经传导速度及肌张力应用bFGF动物明显好于注射生理盐水的动物. 这与碱性成纤维细胞生长因子促进损伤后雪旺氏细胞增生，维持神经元功能正常，促进轴突再生的特性有关. 同时，我们注意到3 mo时应用bFGF的动物神经再生的幅度在与对照组相比减慢. 其内在的机理目前尚不清楚. 神经电损伤情况下，bFGF促进神经再生的机制可能是局部应用bFGF后使局部碱性成纤维细胞生长因子浓度升高，通过促进雪旺氏细胞的增生来完成的. 因为在电场作用下雪旺氏细胞发生溶解性坏死，细胞数量减少这与外伤性神经损伤不同，其在损伤后即开始增生，数量显著增多，形成细胞脊. 而电损伤情况下，雪旺氏细胞结构遭到破坏部分发生溶解，使其数量早期降低而不是增多，无法起到对神经再生的支持作用，使轴突生长受到延迟. 应用外源性bFGF后由于其促细胞分裂作用，而使雪旺氏细胞增加加快，细胞数量增加. 有人指出bFGF可以促进新生血管的生长，这在病变早期可以明显的改善受损局部的微循环，改善局部的血流和营养供给，促进神经再生. 晚期由于增生的雪旺氏细胞具有分泌碱性成纤维细胞生长因子的能力，所以外源性bFGF的作用显著降低[4,5]. 给药时限问题，有关外周应用bFGF的报道较少，研究主要集中于创面修复上. 但尚未发现应用后引起不良的报道. 另外，由我们的实验结果看及早应用bFGF对促进神经再生作用较大.
, http://www.100md.com
作者简介：李学拥，男，1965-05-11生，北京人，汉族，1987年第四军医大学军医系毕业，主治医生，讲师，博士研究生. 导师陈 璧教授. Tel：(029)3375297
作者单位：第四军医大学西京医院全军整形外科中心烧伤外科, 陕西 西安 710033
参考文献
1 Esch F,Ueno N,Baird A et al. Primary structure of bovine brain bFGF. Biochem Biophys Res Commun, 1985; 133(5): 554-561
2 Gospodarowicz D,Greenburg G,Bialecki H. Factors involved in the modulation of cell proliferation in vivo and in vitro: The role of fibroblast and epidermal growth factors in the proliferation response of mammalian cells. In Vitro, 1978; 14(4): 85-96
, http://www.100md.com
3 Baird A, Walicde Pa. Fgfs. Med Bull, 1989; 45(2): 438-445
4 Battler A, Scheinowitz M, Bor A et al. Interacoronary injection of bfgf enhances angiogenesis in infarcted swine myocardium. Am J Coll Cardiol, 1993; 22(7): 2001-2012
5 Harada K, Grossman W, Friedman M et al. bFGF improves myocardial function in chronically ischemic porcine hearts. J Clin Invest, 1994; 94(38): 623-635, 百拇医药
摘要 目的：通过bFGF局部应用，观察其对神经电损伤后再生的促进作用. 方法：随机分为实验组和对照组，每组根据观察时间的长短再分为2 wk组、1 mo组和3 mo组，用 60 Hz 125 V交流电在梨状肌下缘以远损伤3 cm神经，持续时间3 s. 伤后第2日起实验组每日注射bFGF 500 AU. 对照组注射生理盐水. 结果：实验组神经的传导速度、肌张力均较对照组有明显的增加. 超微结构改变在各时间点上亦较对照组轻微，再生纤维结构较对照组成熟. 结论：局部应用bFGF后能够明显促进电损伤后神经损伤的再生.
关键词：碱性成纤维细胞生长因子 电损伤 周围神经
引言
bFGF广泛存在于生物体内,对起源于中胚层、神经外胚层组织和细胞具有显著促分裂作用. 其对神经再生的促进作用已有许多报道，对损伤神经局部应用能否促进神经再生尚未见相关报道. 我们通过bFGF局部应用，观察其对神经电损伤后的再生促进作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物实验 中国本兔24只由本校实验动物研究中心提供，雌雄不拘，体重2 kg～2.5 kg，随机分为实验组和对照组，每组根据观察时间的长短再分为2 wk组、1 mo组和3 mo组，每小组4只，3只进行实验观察，另1只备用. 由兔耳缘iv 20 g/L 戊巴比妥钠(30 mg/kg )麻醉，俯卧位四肢固定，剪除臀部和下肢的毛发，在下肢后侧正中线由月 国窝至臀大肌剪开皮肤,在月 国窝处分离皮下组织寻找月 国神经, 然后延神经走行分离肌肉充分暴露神经,使其与周围组织分离,在月 国窝至骶骨区域内实验组埋置硅胶管用以术后注射bFGF(珠海东大公司)之用. 解剖出坐骨神经后，用60 Hz 125 V交流电在梨状肌下缘以远损伤3 cm神经，持续时间3 s. 伤后2 d起在观察期内实验组每日注射bFGF 500 AU. 对照组注射生理盐水.
1.2 观察指标
1.2.1 大体检测 肉眼观察坐骨神经电损伤后大体形态的动态变化
, 百拇医药
1.2.2 电生理检查 动物观察到期后用记忆示波器检测神经传导速度，并与正常健侧对比求出其恢复率.
1.2.3 肌张力测定 采用SMUP-PC型生物信号处理系统(上海医科大学生理教研室)测定小腿三头肌的单收缩力和强直收缩力. 两者均与自身健侧小腿三头肌的肌力对照，并求出其恢复率.
1.2.4 电镜观察 ①半薄切片制作方法：将新鲜组织制成1 mm×1 mm×1 mm的小块，置于30 mL/L戊二醛磷酸缓冲液中，固定12 h，10 g/L锇酸固定1 h，梯度乙醇脱水和丙酮泡5 min，Epon812包埋，常规切片染色，镜下观察定位. ②定位后包埋块制作超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸钠双染色，在透射电镜下观察.
2 结果
2.1 大体观察 埋置的硅胶管被薄层纤维组织覆盖，颜色红润质地较脆. 两组即时损伤的神经纤维发现与电极接触区域颜色发黄，1 wk后解剖观察神经轻度水肿，颜色发红，2 wk后观察神经水肿减轻，质脆，颜色恢复正常，下肢功能受限，受损下肢足根部的毛部分脱落. 1 mo后神经颜色恢复正常，未见与周围组织粘连. bFGF组动物下肢功能明显改善，后跟毛缺失区逐渐缩小，而对照组毛缺失区加大. 3 mo时，两组动物下肢功能改善程度加大，神经外观正常，受伤下肢后跟毛缺失区范围逐渐缩小.
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2.2 神经传导速度 实验组1 mo和3 mo时的传导速度明显大于对照组，但实验组3 mo时的恢复幅度没有对照组大. 2 wk时两组均没有神经冲动引出(Tab 1).
表 1 术后各时间组神经传导速度的恢复率 (n=3,x±s)
Postoperation time/mo
Group
0.5
1
3
Experiment
0
65±5a
, 百拇医药
90±3a
Control
0
46±4
61±6
aP<0.05 vs control group.2.3 肌张力 实验组各时间组肌肉单收缩力和强直收缩力除2 wk组外的恢复率与对照组相比，有显著性差异(P<0.05, Tab 2,3).
表 2 术后各时间组单收缩力恢复率的变化 (n=3,x±s)
Postoperation time/mo
Group
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0.5
1
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19±4
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aP<0.05 vs control group.2.4 电镜观察 实验组：2 wk时，受损的神经纤维数目较多，损伤程度较重. 表现为无髓神经纤维轴膜破裂，轴浆外溢. 有髓神经纤维髓板层开始解体. 但微血管结构无明显变化. 仍可见到形态结构正常的神经纤维,雪旺氏细胞形态无明显变化. 1 mo时，可见到新生的神经纤维，主要以两种形式存在. ①新生的神经纤维沿原有的溃变的神经膜管生长. 镜下可见到溃变解体的髓鞘内存有结构清晰的有髓神经纤维. ②新生轴突由雪旺氏细胞形成髓鞘逐渐包裹而成. 未得到神经再支配的神经纤维结构开始解体，无髓神经纤维轴膜破裂相互融合. 有髓神经纤维髓鞘厚薄不均，并溶解形成滴状结构. 可以见到部分雪旺氏细胞内结构发生变化,线粒体肿胀、空泡增多、胞核变圆. 3 mo时，再生的神经纤维结构进一步成熟. 可见新生髓鞘较薄，但外层光滑，亦可见到尚未完全形成包裹的板层髓鞘. 无髓神经纤维数目减少，但直径增大，雪旺氏细胞包裹的无髓神经纤维数目减少，并处于细胞的外层. 胶原纤维无明显增加.
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表 3 术后各时间组强直收缩力恢复率的变化 n=3,x±s)
Postoperation time/mo
Group
0.5
1
3
Experiment
0
48±5a
61±9a
Control
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0
32±4
47±4
aP<0.05 vs control group. bFGF组：2 wk时，镜下观无髓神经纤维有部分的空泡形成, 表现为轴突内微丝、微管等细胞器消失，呈低密度均质状态 . 微血管内壁光滑，管腔无闭塞及栓塞，雪旺氏细胞轴突复合体无明显改变. 1 mo时，无髓神经结构开始恢复正常，空泡现象消失. 有髓神经纤维形成的髓鞘厚度较对照组大，数量较对照组多. 雪旺氏细胞轴突细胞复合体形态接近成熟. 3 mo时，溃变的神经纤维数目较对照组少，形态结构较对照组成熟.
3 讨论
成纤维细胞生长因子是一类具有广泛生物学活性的肽类物质，按其等电点(PI)的不同，分为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF). 资料表明bFGF对起源于中胚层和神经外胚层的细胞具有有效的促有丝分裂活性，对其它外胚层细胞及内胚层衍生物也具有促进有丝分裂活性. bFGF在体外的生物学活性除引起细胞的增殖反应外，还包括调节细胞的能动性、细胞分化、轴突的延伸和成活等[1～3]. 由于bFGF广泛的生物学活性，引起人们的广泛关注. 以往有关bFGF的研究多集中在中枢神经系统，对于其对外周神经损伤后作用的报道较少. 本实验通过局部长时间间断性给药观察其对电损伤后坐骨神经功能的恢复情况.
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由实验结果可以看出，应用bFGF后神经功能早期恢复不太明显，2 wk时神经传导速度、肌张力及超微结构无明显的差异. 1 mo时神经传导速度及肌张力应用bFGF动物明显好于注射生理盐水的动物. 这与碱性成纤维细胞生长因子促进损伤后雪旺氏细胞增生，维持神经元功能正常，促进轴突再生的特性有关. 同时，我们注意到3 mo时应用bFGF的动物神经再生的幅度在与对照组相比减慢. 其内在的机理目前尚不清楚. 神经电损伤情况下，bFGF促进神经再生的机制可能是局部应用bFGF后使局部碱性成纤维细胞生长因子浓度升高，通过促进雪旺氏细胞的增生来完成的. 因为在电场作用下雪旺氏细胞发生溶解性坏死，细胞数量减少这与外伤性神经损伤不同，其在损伤后即开始增生，数量显著增多，形成细胞脊. 而电损伤情况下，雪旺氏细胞结构遭到破坏部分发生溶解，使其数量早期降低而不是增多，无法起到对神经再生的支持作用，使轴突生长受到延迟. 应用外源性bFGF后由于其促细胞分裂作用，而使雪旺氏细胞增加加快，细胞数量增加. 有人指出bFGF可以促进新生血管的生长，这在病变早期可以明显的改善受损局部的微循环，改善局部的血流和营养供给，促进神经再生. 晚期由于增生的雪旺氏细胞具有分泌碱性成纤维细胞生长因子的能力，所以外源性bFGF的作用显著降低[4,5]. 给药时限问题，有关外周应用bFGF的报道较少，研究主要集中于创面修复上. 但尚未发现应用后引起不良的报道. 另外，由我们的实验结果看及早应用bFGF对促进神经再生作用较大.
, http://www.100md.com
作者简介：李学拥，男，1965-05-11生，北京人，汉族，1987年第四军医大学军医系毕业，主治医生，讲师，博士研究生. 导师陈 璧教授. Tel：(029)3375297
作者单位：第四军医大学西京医院全军整形外科中心烧伤外科, 陕西 西安 710033
参考文献
1 Esch F,Ueno N,Baird A et al. Primary structure of bovine brain bFGF. Biochem Biophys Res Commun, 1985; 133(5): 554-561
2 Gospodarowicz D,Greenburg G,Bialecki H. Factors involved in the modulation of cell proliferation in vivo and in vitro: The role of fibroblast and epidermal growth factors in the proliferation response of mammalian cells. In Vitro, 1978; 14(4): 85-96
, http://www.100md.com
3 Baird A, Walicde Pa. Fgfs. Med Bull, 1989; 45(2): 438-445
4 Battler A, Scheinowitz M, Bor A et al. Interacoronary injection of bfgf enhances angiogenesis in infarcted swine myocardium. Am J Coll Cardiol, 1993; 22(7): 2001-2012
5 Harada K, Grossman W, Friedman M et al. bFGF improves myocardial function in chronically ischemic porcine hearts. J Clin Invest, 1994; 94(38): 623-635, 百拇医药