白细胞参与新生鼠窒息后肾损伤的作用及机制研究
董文斌 冉隆瑞 冯志强 赵春玲 龙汉安 张春来
摘 要：目的：探讨白细胞在新生大白鼠窒息后肾损伤中的作用及机制。方法：将20只7～10日龄Wistar大白鼠随机分为窒息组和对照组，每组10只，制成常压窒息模型。在窒息30分钟复氧120分钟时，取左肾称重求出左肾系数(LRC)，并分别采用硫代巴比妥酸法、酶联免疫吸附法(ELISA)检测肾组织过氧化脂质(LPO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素8(IL8)的含量，同时在光镜下对肾小管损伤程度进行评分，并计数肾微血管床的白细胞滞留数。结果：窒息后复氧120分钟时，白细胞滞留数、左肾系数、肾小管评分及组织中LPO、TNF-α、IL-8的含量均较对照组显著升高(P均<0.05)，且白细胞滞留数与左肾系数、肾小管评分、LPO、TNF-α和IL-8含量之间呈显著正相关关系(r分别为0.49、0.55、0.51、0.48、0.70，P均<0.05)。结论：窒息后肾组织炎性细胞因子的产生和白细胞滞留相互作用是造成窒息后肾损伤的重要环节，对临床上采用抗炎或抗白细胞措施防治窒息后肾损伤有重要价值。
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关键词：窒息 肾损伤 白细胞 细胞因子
新生儿窒息及窒息解除恢复供氧时所致的一系列病理生理变化可导致多器官功能损伤，其中以肾损伤的发生率最高〔1〕。肾损伤的机制尚不清楚，可能与窒息后复氧再灌注损伤有关〔2〕。我们已证实白细胞作为一种致伤因子参与了肾缺血再灌注性损伤及窒息后脑损伤的发生〔3，4〕，其是否与新生儿窒息后肾损伤的发生有关，尚未见报道。本研究采用自制的新生鼠常压窒息模型〔4，5〕，探讨窒息后肾组织白细胞反应参与肾损伤的作用及机制，为临床防治窒息后肾损伤提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物：7～10日龄Wistar新生大白鼠共20只，雌雄不拘，体重(13.23±5.25)g，由泸州医学院标准动物科提供。每次按同窝随机分成2组：对照组10只，窒息组10只，2组间体重差异无显著性。
, 百拇医药
1.2 实验过程：2组动物分别置于容积为55 ml的缺氧瓶中(内装0.005 kg钠石灰)〔4，5〕，待动物安静后，窒息组塞紧瓶塞(对照组模拟该过程不塞瓶塞)密闭30分钟，立刻复氧120分钟，即断颈放血后取左肾，游离肾包膜和肾蒂，吸干表面血迹，精确称取左肾湿重，根据左肾湿重(g)与体重(kg)比求出左肾系数(left renal coefficient,LRC)，同时纵剖左肾，取一定量肾皮质块，加入0.9%的冰盐水，在冰浴下制成1%匀浆液，离心收集上清液，-20 ℃保存待检。另取5 mm厚皮质块做组织学检测。
1.3 指标检测：上清液蛋白含量(双缩脲法)及过氧化脂质(LPO，硫代巴比妥酸法)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-8(IL-8)测定均采用酶联免疫吸附法，由第四军医大学微生物学教研室提供试剂盒。
1.4 组织学观察：切片用HE染色，在病变严重处采用Paller法对肾小管损伤程度评分〔3〕：即每个高倍视野(HP)随机选择10个有病变的肾小管，按100个肾小管记分。标准：肾小管明显扩张、细胞扁平1分；刷状缘损伤或脱落1分或2分；管型2分；肾小管管腔内有脱落的、坏死的细胞，未成管型或细胞碎片1分。同时选择10根直径在50～150 μm间的小静脉，计数其横断面内的白细胞数用以代表肾微血管床的白细胞滞留数〔3〕。
, 百拇医药
1.5 统计学方法：数据用均数±标准差(X±s)表示，组间比较用t检验，相关关系用直线相关分析。
2 结 果
2.1 窒息新生鼠肾微血管床白细胞滞留、左肾系数及肾小管评分的情况见表1。
表1 窒息新生鼠肾微血管床白细胞滞留、左肾系数及肾小管评分的情况(X±s)
组别
动物数
(只)
白细胞
(个/10 HP)
左肾系数
, 百拇医药
(g/kg)
肾小管评分
(分/10 HP)
对照组
10
21.25±14.58
3.00±0.89
8.29±4.47
窒息组
10
41.43±13.45
6.06±0.26
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14.20±5.35
t值
4.24
4.67
3.78
P值
<0.05
<0.05
<0.05
2.2 窒息新生鼠肾组织LPO、TNFα、IL8的水平见表2。表2 窒息新生鼠肾组织LPO、TNFα和IL8含量的比较(X±s)
组别
, http://www.100md.com 动物数(只)
LPO(nmol/g)
TNFα(ng/g)
IL8(ng/g)
对照组
10
62.17±18.95
0.25±0.17
0.31±0.06
窒息组
10
95.46±48.00
, 百拇医药
0.44±0.09
0.47±0.13
t值
2.04
3.12
3.53
P值
<0.05
<0.05
<0.05
2.3 窒息组白细胞滞留与肾损伤及LPO、TNF-α、 IL-8的关系：直线相关分析显示，窒息组白细胞计数与左肾系数、肾小管评分及LPO、TNF-α、IL-8水平呈显著的正相关关系(r分别为0.49、0.55、0.51、0.48、0.70，P均<0.05)。
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3 讨 论
3.1 白细胞与新生鼠窒息后肾损伤的关系：窒息导致机体严重缺氧，机体为保证心、脑等生命器官的供血供氧，反射性地交感神经兴奋及肾上腺素作用导致肾动脉收缩，使肾脏发生缺血性损伤，而窒息解除恢复供氧时，肾动脉反射性地扩张，使肾脏出现再灌注损伤，这可能是窒息后肾损伤的关键病理环节〔2〕。白细胞作为一种致伤因子，与缺氧缺血性再灌注损伤的关系已广泛受到重视〔3-6〕。目前国内外缺乏有关白细胞与窒息后肾损伤关系的报道。我们已观察到新生儿窒息后外周血白细胞计数显著升高，与窒息程度和肾功能损害程度密切相关，推测窒息可激发血循环中白细胞数升高并可能在复氧时随再灌血流进入肾组织参与肾损伤的发生。本研究观察到新生鼠窒息后恢复供氧120分钟时肾微血管床白细胞滞留数明显增加，且与反映肾损伤的指标左肾系数和肾小管损伤评分呈显著正相关，从而证实白细胞在窒息后肾损伤中的作用。这与前期有关缺血再灌注性肾损伤及窒息后脑损伤的研究结果相一致〔3，4〕。
, 百拇医药
3.2 白细胞参与新生鼠窒息后肾损伤的机制：肾组织缺氧缺血时，局部可出现一系列的“损伤反应(injury response)”，首先是大量活性介质的产生，包括氧自由基和细胞因子〔6，7〕，如TNF-α、IL-8。其中TNF-α可以增强中性粒细胞上CD11b/CD18的表达，诱导血管内皮细胞P-选择素、E-选择素的表达，进而增强缺血、缺氧时白细胞与内皮细胞的粘附，促进白细胞激活、外渗与浸润。IL-8和氧自由基作为白细胞的趋化因子，可趋化白细胞进入肾组织，出现“白细胞反应(leukocyte response)”〔6〕，这可能是本研究肾组织自由基、TNF-α和IL-8含量升高，且与白细胞滞留数呈正相关的主要原因。
升高的白细胞可提高灌注液粘滞度并聚集在微血管床形成血栓，阻塞微循环，导致肾血管阻力增加，肾小球滤过率下降〔3，7〕，出现少尿，甚至出现再灌注后的“无再灌流现象(no-reflow phenomenon)”，即使在供氧后，肾组织的缺氧缺血状态并未得到改善，甚至进一步加重〔3，6〕；此外，在缺氧条件下，聚集的白细胞还可以被激活，进一步释放TNF-α、IL-8等炎性细胞因子〔8，9〕，可趋化更多的白细胞进入肾组织，形成恶性循环；另外白细胞反应发生“呼吸爆发”，产生大量的氧自由基、NADPH酶、蛋白水解酶和髓过氧化酶，直接对肾细胞和血管内皮细胞造成毒性损伤〔3，5〕，白细胞产生的细胞因子也可能直接或通过其它途径加重肾细胞的损伤〔10〕。
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3.3 白细胞参与新生鼠窒息后肾损伤的意义：本研究结果显示窒息后肾组织损伤反应首先产生炎性介质，进而激发白细胞反应，二者相互作用、恶性循环是造成窒息后肾损伤的重要环节，这为临床采用抗炎或抗白细胞措施防治窒息后肾损伤有重要价值。
基金项目：四川省卫生厅科研基金资助项目(98017)
作者简介：董文斌(1967-)，男(汉族)，四川中江人，硕士，讲师。主要研究方向为小儿缺氧缺血性疾病的机制及防治，已主持和参加6项科研课题，获市级以上科技成果奖3项，参加编写专著5部，发表学术论文40余篇。
董文斌(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
冉隆瑞(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
, 百拇医药
冯志强(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
赵春玲(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
龙汉安(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
张春来(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
参考文献：
〔1〕Perlamn J M,Tack E D,Martin T,et al.Acute systemic organ injury in term infants after asphyxia.Am J Dis Child,1989,143 :617-620.
, 百拇医药
〔2〕Fellman V,Raivio K L.Reperfusion injury as the mechanism of brain damage after perinatal asphyxia.Pediatr Res,1997,41:599-606.
〔3〕董文斌，冯志强，李莉华，等.白细胞在急性缺血再灌流性肾损伤中的作用研究.泸州医学院学报，1995，18：87-90.
〔4〕董文斌，冉隆瑞，冯志强，等.白细胞在新生大白鼠窒息后脑损伤中的作用.实用儿科临床杂志，1997，32：323-324.
〔5〕董文斌，冉隆瑞，冯志强，等.生脉注射液对窒息后脑损伤保护作用的研究.中华儿童保健杂志，1998，6：32-34.
〔6〕Scannell G.Leukocyte responses to hypoxic/ischemic conditions.New Horiz,1996,4:179-183.
, 百拇医药
〔7〕Braid M.Leukocyte effects on the vascular resistance and glomerular filtration of the isolate rat kidney at normal and low flow state.Cir Shock,1986,20:71-77.
〔8〕Goes N,Urmson J,Vincent D,et al.Effect of recombinant human insulinlike growth factor1 on the inflammatory response to acute renal injury.J Am Soc Nephrol,1996,7:710-720.
〔9〕Seino Y,Ikeda U,Minezaki K K,et al.Expression of cytokineinduced neutrophil chemoattractant in rat cardiac myocytes.J Mol Cell Cardiol,1995,27:2043-2051.
〔10〕王东.肾缺血再灌注中性粒细胞与内皮细胞粘附分子变化及其作用.国外医学泌尿系统分册，1998，18：222-224., 百拇医药
摘 要：目的：探讨白细胞在新生大白鼠窒息后肾损伤中的作用及机制。方法：将20只7～10日龄Wistar大白鼠随机分为窒息组和对照组，每组10只，制成常压窒息模型。在窒息30分钟复氧120分钟时，取左肾称重求出左肾系数(LRC)，并分别采用硫代巴比妥酸法、酶联免疫吸附法(ELISA)检测肾组织过氧化脂质(LPO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素8(IL8)的含量，同时在光镜下对肾小管损伤程度进行评分，并计数肾微血管床的白细胞滞留数。结果：窒息后复氧120分钟时，白细胞滞留数、左肾系数、肾小管评分及组织中LPO、TNF-α、IL-8的含量均较对照组显著升高(P均<0.05)，且白细胞滞留数与左肾系数、肾小管评分、LPO、TNF-α和IL-8含量之间呈显著正相关关系(r分别为0.49、0.55、0.51、0.48、0.70，P均<0.05)。结论：窒息后肾组织炎性细胞因子的产生和白细胞滞留相互作用是造成窒息后肾损伤的重要环节，对临床上采用抗炎或抗白细胞措施防治窒息后肾损伤有重要价值。
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关键词：窒息 肾损伤 白细胞 细胞因子
新生儿窒息及窒息解除恢复供氧时所致的一系列病理生理变化可导致多器官功能损伤，其中以肾损伤的发生率最高〔1〕。肾损伤的机制尚不清楚，可能与窒息后复氧再灌注损伤有关〔2〕。我们已证实白细胞作为一种致伤因子参与了肾缺血再灌注性损伤及窒息后脑损伤的发生〔3，4〕，其是否与新生儿窒息后肾损伤的发生有关，尚未见报道。本研究采用自制的新生鼠常压窒息模型〔4，5〕，探讨窒息后肾组织白细胞反应参与肾损伤的作用及机制，为临床防治窒息后肾损伤提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物：7～10日龄Wistar新生大白鼠共20只，雌雄不拘，体重(13.23±5.25)g，由泸州医学院标准动物科提供。每次按同窝随机分成2组：对照组10只，窒息组10只，2组间体重差异无显著性。
, 百拇医药
1.2 实验过程：2组动物分别置于容积为55 ml的缺氧瓶中(内装0.005 kg钠石灰)〔4，5〕，待动物安静后，窒息组塞紧瓶塞(对照组模拟该过程不塞瓶塞)密闭30分钟，立刻复氧120分钟，即断颈放血后取左肾，游离肾包膜和肾蒂，吸干表面血迹，精确称取左肾湿重，根据左肾湿重(g)与体重(kg)比求出左肾系数(left renal coefficient,LRC)，同时纵剖左肾，取一定量肾皮质块，加入0.9%的冰盐水，在冰浴下制成1%匀浆液，离心收集上清液，-20 ℃保存待检。另取5 mm厚皮质块做组织学检测。
1.3 指标检测：上清液蛋白含量(双缩脲法)及过氧化脂质(LPO，硫代巴比妥酸法)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-8(IL-8)测定均采用酶联免疫吸附法，由第四军医大学微生物学教研室提供试剂盒。
1.4 组织学观察：切片用HE染色，在病变严重处采用Paller法对肾小管损伤程度评分〔3〕：即每个高倍视野(HP)随机选择10个有病变的肾小管，按100个肾小管记分。标准：肾小管明显扩张、细胞扁平1分；刷状缘损伤或脱落1分或2分；管型2分；肾小管管腔内有脱落的、坏死的细胞，未成管型或细胞碎片1分。同时选择10根直径在50～150 μm间的小静脉，计数其横断面内的白细胞数用以代表肾微血管床的白细胞滞留数〔3〕。
, 百拇医药
1.5 统计学方法：数据用均数±标准差(X±s)表示，组间比较用t检验，相关关系用直线相关分析。
2 结 果
2.1 窒息新生鼠肾微血管床白细胞滞留、左肾系数及肾小管评分的情况见表1。
表1 窒息新生鼠肾微血管床白细胞滞留、左肾系数及肾小管评分的情况(X±s)
组别
动物数
(只)
白细胞
(个/10 HP)
左肾系数
, 百拇医药
(g/kg)
肾小管评分
(分/10 HP)
对照组
10
21.25±14.58
3.00±0.89
8.29±4.47
窒息组
10
41.43±13.45
6.06±0.26
, http://www.100md.com
14.20±5.35
t值
4.24
4.67
3.78
P值
<0.05
<0.05
<0.05
2.2 窒息新生鼠肾组织LPO、TNFα、IL8的水平见表2。表2 窒息新生鼠肾组织LPO、TNFα和IL8含量的比较(X±s)
组别
, http://www.100md.com 动物数(只)
LPO(nmol/g)
TNFα(ng/g)
IL8(ng/g)
对照组
10
62.17±18.95
0.25±0.17
0.31±0.06
窒息组
10
95.46±48.00
, 百拇医药
0.44±0.09
0.47±0.13
t值
2.04
3.12
3.53
P值
<0.05
<0.05
<0.05
2.3 窒息组白细胞滞留与肾损伤及LPO、TNF-α、 IL-8的关系：直线相关分析显示，窒息组白细胞计数与左肾系数、肾小管评分及LPO、TNF-α、IL-8水平呈显著的正相关关系(r分别为0.49、0.55、0.51、0.48、0.70，P均<0.05)。
, http://www.100md.com
3 讨 论
3.1 白细胞与新生鼠窒息后肾损伤的关系：窒息导致机体严重缺氧，机体为保证心、脑等生命器官的供血供氧，反射性地交感神经兴奋及肾上腺素作用导致肾动脉收缩，使肾脏发生缺血性损伤，而窒息解除恢复供氧时，肾动脉反射性地扩张，使肾脏出现再灌注损伤，这可能是窒息后肾损伤的关键病理环节〔2〕。白细胞作为一种致伤因子，与缺氧缺血性再灌注损伤的关系已广泛受到重视〔3-6〕。目前国内外缺乏有关白细胞与窒息后肾损伤关系的报道。我们已观察到新生儿窒息后外周血白细胞计数显著升高，与窒息程度和肾功能损害程度密切相关，推测窒息可激发血循环中白细胞数升高并可能在复氧时随再灌血流进入肾组织参与肾损伤的发生。本研究观察到新生鼠窒息后恢复供氧120分钟时肾微血管床白细胞滞留数明显增加，且与反映肾损伤的指标左肾系数和肾小管损伤评分呈显著正相关，从而证实白细胞在窒息后肾损伤中的作用。这与前期有关缺血再灌注性肾损伤及窒息后脑损伤的研究结果相一致〔3，4〕。
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3.2 白细胞参与新生鼠窒息后肾损伤的机制：肾组织缺氧缺血时，局部可出现一系列的“损伤反应(injury response)”，首先是大量活性介质的产生，包括氧自由基和细胞因子〔6，7〕，如TNF-α、IL-8。其中TNF-α可以增强中性粒细胞上CD11b/CD18的表达，诱导血管内皮细胞P-选择素、E-选择素的表达，进而增强缺血、缺氧时白细胞与内皮细胞的粘附，促进白细胞激活、外渗与浸润。IL-8和氧自由基作为白细胞的趋化因子，可趋化白细胞进入肾组织，出现“白细胞反应(leukocyte response)”〔6〕，这可能是本研究肾组织自由基、TNF-α和IL-8含量升高，且与白细胞滞留数呈正相关的主要原因。
升高的白细胞可提高灌注液粘滞度并聚集在微血管床形成血栓，阻塞微循环，导致肾血管阻力增加，肾小球滤过率下降〔3，7〕，出现少尿，甚至出现再灌注后的“无再灌流现象(no-reflow phenomenon)”，即使在供氧后，肾组织的缺氧缺血状态并未得到改善，甚至进一步加重〔3，6〕；此外，在缺氧条件下，聚集的白细胞还可以被激活，进一步释放TNF-α、IL-8等炎性细胞因子〔8，9〕，可趋化更多的白细胞进入肾组织，形成恶性循环；另外白细胞反应发生“呼吸爆发”，产生大量的氧自由基、NADPH酶、蛋白水解酶和髓过氧化酶，直接对肾细胞和血管内皮细胞造成毒性损伤〔3，5〕，白细胞产生的细胞因子也可能直接或通过其它途径加重肾细胞的损伤〔10〕。
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3.3 白细胞参与新生鼠窒息后肾损伤的意义：本研究结果显示窒息后肾组织损伤反应首先产生炎性介质，进而激发白细胞反应，二者相互作用、恶性循环是造成窒息后肾损伤的重要环节，这为临床采用抗炎或抗白细胞措施防治窒息后肾损伤有重要价值。
基金项目：四川省卫生厅科研基金资助项目(98017)
作者简介：董文斌(1967-)，男(汉族)，四川中江人，硕士，讲师。主要研究方向为小儿缺氧缺血性疾病的机制及防治，已主持和参加6项科研课题，获市级以上科技成果奖3项，参加编写专著5部，发表学术论文40余篇。
董文斌(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
冉隆瑞(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
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冯志强(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
赵春玲(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
龙汉安(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
张春来(四川泸州医学院附属医院儿科、泸州医学院肾功能保护研究室，四川 泸州 646000)
参考文献：
〔1〕Perlamn J M,Tack E D,Martin T,et al.Acute systemic organ injury in term infants after asphyxia.Am J Dis Child,1989,143 :617-620.
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〔2〕Fellman V,Raivio K L.Reperfusion injury as the mechanism of brain damage after perinatal asphyxia.Pediatr Res,1997,41:599-606.
〔3〕董文斌，冯志强，李莉华，等.白细胞在急性缺血再灌流性肾损伤中的作用研究.泸州医学院学报，1995，18：87-90.
〔4〕董文斌，冉隆瑞，冯志强，等.白细胞在新生大白鼠窒息后脑损伤中的作用.实用儿科临床杂志，1997，32：323-324.
〔5〕董文斌，冉隆瑞，冯志强，等.生脉注射液对窒息后脑损伤保护作用的研究.中华儿童保健杂志，1998，6：32-34.
〔6〕Scannell G.Leukocyte responses to hypoxic/ischemic conditions.New Horiz,1996,4:179-183.
, 百拇医药
〔7〕Braid M.Leukocyte effects on the vascular resistance and glomerular filtration of the isolate rat kidney at normal and low flow state.Cir Shock,1986,20:71-77.
〔8〕Goes N,Urmson J,Vincent D,et al.Effect of recombinant human insulinlike growth factor1 on the inflammatory response to acute renal injury.J Am Soc Nephrol,1996,7:710-720.
〔9〕Seino Y,Ikeda U,Minezaki K K,et al.Expression of cytokineinduced neutrophil chemoattractant in rat cardiac myocytes.J Mol Cell Cardiol,1995,27:2043-2051.
〔10〕王东.肾缺血再灌注中性粒细胞与内皮细胞粘附分子变化及其作用.国外医学泌尿系统分册，1998，18：222-224., 百拇医药