一种筛选自身免疫性疾病患者抗内耳抗体的新方法
邹静 毕爱芳 吴兴辰 杨伟炎 李振彬
摘 要 目的 探讨用一种新建立的外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析 (rapid electric field immobilizing liquid phase molecule dot blot，REILMD) 法检测自身免疫性疾病患者抗内耳抗体的临床意义。方法 收集11种确诊的自身免疫性疾病患者共71例，突发性聋21例，非免疫性疾病患者48例(对照组)。检测内容包括一般免疫指标及自身抗体如抗smooth muscle (Sm)、抗ribonucleoprotein (RNP)、抗Sjgren's syndrome A (SSA)、抗Sjgren's syndrome B (SSB)、抗DNA topoisomerase I (Scl)70、抗histidyl-tRNA synthetase (Jo-1)、抗核糖体、抗双链DNA、抗组织和抗内耳抗体。抗内耳抗体检测先用REILMD筛选,再用免疫转印方法确定相对分子质量。结果 类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis，RA)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)主要表现为血沉加快, 类风湿因子阳性, C-反应蛋白、IgG、循环免疫复合物升高,少数IgA、IgM及C4升高。在RA中2/16抗双链DNA和抗线粒体及4/16抗核抗体阳性。在SLE中11/16抗核抗体、7/13抗RNP抗体、抗SSA抗体和抗双链DNA抗体,3/13抗Sm抗体、1/13抗ScL70抗体、抗横纹肌和抗胃壁细胞抗体阳性。强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS) 均为阴性。经REILMD法筛选共在9例自身免疫性疾病患者(占13%)、2例突发性耳聋患者(占10%)及1例对照(冠状动脉硬化心脏病占2%)中检出强阳性抗内耳抗体, 其中SLE抗体阳性率为31%(5/16),RA、AS、白塞病和链球菌感染后综合症各1例阳性。在所有抗内耳抗体阳性患者中,抗核抗体阳性率高达67%,抗RNP和抗dsDNA抗体阳性率为50%。用免疫转印法分析发现该抗体识别抗原分子的相对分子质量主要为52 000、36 000、31 000和15 000。结论 用REILMD法筛选抗内耳抗体为一种临床实用的简便方法,数种自身免疫性疾病有内耳损害的可能,以SLE为主。
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关键词：免疫测定 自身免疫疾病 自身抗体 迷路
检索Medline得知1967年以来全球共在有影响的杂志上发表有关内耳免疫的论文 554篇。因此,内耳免疫研究历史悠久,已经受到全世界广泛关注。虽然已经有许多免疫检测方法用于内耳免疫研究,但是,由于特异性、灵敏度以及操作难等诸多因素的影响,大多数方法或者已经被淘汰,或者不能作为一种常规检查而广泛应用。临床上急需一种特异性较好、操作简便、快捷、经济的检测方法。我们经过不断探索,逐步完善,寻找出一种内耳抗原抗体检测方法,将该方法命名为外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析(rapid electric field immobilizing liquid phase molecule dot blot，REILMD)法(详细资料已另文总结，投中华微生物免疫学杂志)。现将用该方法检测临床确诊的自身免疫性疾病和突发性聋患者抗内耳抗体的结果报告如下。
材料与方法
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一、材料
1.临床资料：11种确诊的自身免疫性疾病患者来自我院中医科、肾病科和皮肤科，共71例，男33例，女38例；年龄10～70岁，平均36岁。其中类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)19例，男3例，女16例；幼年类风湿性关节炎2例，男女各1例；强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)19例，男18例，女1例；系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)16例，男4例，女12例；白塞病2例，男女各1例；干燥综合症2例，均为女性；成人斯替尔病2例，男女各1例；多发性肌炎1例，女性；链球菌感染后综合症1例，女性；多发性大动脉炎1例，女性；肾病综合症6例，男5例，女1例。各病诊断依据国际标准及全国标准。突发性聋患者来自我院耳鼻咽喉科，共21例，男15例，女6例，年龄20～56岁，平均32岁。对照组48例，为我院各科明确非自身免疫性疾病的其它疾病患者。
2.主要试剂：HRP-羊抗人IgG为卫生部北京生物制品研究所产品。用于体外检测抗核抗原抗体的自身免疫检查试剂盒-6(AUTO6)为美国GenBio公司产品。羊抗人IgG荧光抗体为卫生部上海生物制品研究所产品。
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3.主要仪器：77000X Easy-TiterTM ELIFA System为美国Pierce公司生产,改造后用于REILMD分析。Eagle Eye TM Ⅱ 型电泳图像分析系统为美国Cold Spring Harbor公司产品。7150型全自动生化分析仪为日立公司生产。其它各种电泳仪器为北京六一仪器厂产品。
二、方法
一般项目检测包括血沉、类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、循环免疫复合物(circulating immune complex，CIC)、抗链球菌溶血素“O”等。检测免疫球蛋白和补体用免疫比浊法,检测CRP用琼脂单扩散法,检测CIC用 PEG沉淀法,检测RF和抗链球菌溶血素“O”用胶乳凝集法。
自身抗体检测采用以下几种方式：
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1.抗多肽抗体检测：按试剂盒说明书分别检测抗smooth muscle (Sm)抗体、抗ribonucleoprotein (RNP)抗体、抗Sjgren syndrome A (SSA)抗体、抗Sjgren syndrome B (SSB)抗体、抗DNA topoisomerase I (Scl)-70抗体、抗histidyl-tRNA synthetase (Jo-1)抗体和抗核糖体抗体。
2.抗双链DNA和抗组织抗体：用鼠各种组织切片作底抗原片,采用间接免疫荧光法检测抗双链DNA和抗各种组织抗体。
3.抗内耳抗体检测：用 REILMD方法筛选，首先使用外加电场快速吸附膜迷路蛋白：先将一铂丝经ELIFA System排液孔插入缓冲液池,并弯曲成蛇形,其表面盖上滤纸,池内倒满转移电泳缓冲液(0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸,20%甲醇,pH 8.35),再按原说明书安装样品池底板,继续向缓冲液池注入缓冲液,直至其经96孔溢出,彻底驱赶96孔内气泡(该步骤非常重要),小心将预先浸泡该缓冲液的硝酸纤维素膜(nitrocellulose，NC膜)放于底板硅胶片表面,勿使其下面留任何气泡。盖好样品池顶板并拧紧螺栓固定(另一硅胶片盖于NC膜表面)。将样品池96孔内注满缓冲液,勿留气泡。用样品缓冲液(0.063 mol/L Tris-HCl，pH6.8,2%十二烷基磺酸钠,0.1%溴酚蓝,5%2-巯基已醇,10%蔗糖)将膜迷路蛋白稀释为0.9 mg/ml,每孔加入50 μL样品,小心将多层滤纸盖在上盖顶板96孔表面，滤纸间夹入蛇形弯曲的铂丝。上方铂丝接负极，缓冲液池铂丝接正极,200 mA电泳10 min。取下滤纸，丢弃缓冲液，然后筛选抗体：用蒸馏水冲洗微孔,每孔加200 μL PBS-T并在37℃摇浴5 min,再用含1%BSA的1∶40正常羊血清摇浴5 min。将待测血清进行1∶10稀释,每孔加入50 μL,同上摇浴10 min,拆卸装置,用塑料膜密封NC膜,用phosphoric acid buffer saline-tween (PBS-T)高速摇洗3 min,2次。加入1∶1 000 horse-radish peroxidase (HRP)羊抗人IgG 20 ml,同上摇浴10 min,并洗涤2次。加入用0.05 mol/L Tris(pH7.6)溶解的DAB20 ml,同上摇浴10 min,用PBS-T短暂漂洗。用Eagle Eye TM Ⅱ型电泳图像分析系统分析结果。
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免疫转印分析：用改良免疫转印法分析上述阳性血清，识别膜迷路蛋白的分子量[1]。
4.统计分析：用SPSS软件将所有数据进行统计分析。
结果
RA和SLE患者主要异常表现为血沉加快,RF阳性,CRP、IgG、CIC升高,少数IgA、IgM及C4升高。少部分RA患者抗dsDNA抗体、抗线粒体抗体及抗核抗体阳性。SLE患者自身抗体普较广,以抗核抗体、抗RNP抗体、SSA抗体和dsDNA抗体为主,少部分患者可出现抗Sm抗体、抗ScL-70抗体、抗横纹肌抗体和抗胃壁细胞抗体。AS患者主要表现为血沉加快,CRP、IgG、IgA、IgM、C4、CIC升高,无1例出现抗多肽抗体及各种组织细胞抗体(表1,2)。
经REILMD法筛选共在9例自身免疫性疾病患者、2例突发性耳聋患者(10%)及1例对照者(2%)中检出强阳性抗内耳抗体,在内耳抗体阳性的自身免疫疾病中,SLE 5例,阳性率为31%(5/16),RA、AS、白塞病和链球菌感染后综合症各1例。对照组48例中1例阳性者为冠状动脉硬化心脏病患者(2%，图1)。用免疫转印法分析发现该抗体识别抗原分子的相对分子质量主要为52 000、36 000、31 000和15 000(图2)。抗内耳抗体阳性组的其它自身抗体阳性率均高于内耳抗体阴性组,但统计学检验差异无显著性,可能是样本量不够所致(表3)。抗内耳抗体阳性组抗核抗体阳性率高达67%,抗RNP和抗dsDNA抗体阳性率为50%。
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图1用REILMD检测自身免疫性疾病患者抗内耳抗体B、D、F、H分别为A.C.E.G的重复,在其阳性反应结果中,A1,B1为强直性脊柱炎;A3,B3及A5,B5为SLE;C8,D8为白塞病
图2 自身免疫病患者抗内耳抗体阳性血清的免疫转印分析.1为白塞病;2,3,5,6为SLE;4相对分子质量42 700,为强直性脊柱;7为冠状动脉硬化心脏病
表1 自身免疫性疾病患者各项免疫指标异常例次
诊断
检测例数
血沉
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RF
CRP
IgG
IgA
IgM
C3
C4
CIC
类风湿性关节炎
19
17
12
15
, 百拇医药
15
1
1
0
1
19
幼年类风湿性关节炎
2
2
1
1
0
0
1
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1
1
1
强直性脊柱炎
19
11
0
6
8
4
5
0
6
7
, 百拇医药
系统红斑狼疮
16
9
7
5
10
2
3
0
3
6
干燥综合症
2
1
, 百拇医药
2
0
2
2
2
0
0
0
白塞病
2
2
1
2
1
, 百拇医药
0
1
0
2
0
成人斯替尔病
2
2
2
2
2
1
2
0
, 百拇医药
2
2
链球菌感染后综合征
1
2
0
2
2
0
2
0
0
0
多发性肌炎
, 百拇医药
1
2
0
2
2
0
2
0
0
2
注：每位患者仅接受部分项目检测，多发性大动脉炎和肾病综合症均未接受该检测，下表同表2 自身免疫性疾病患者抗多肽抗体及各种组织自身抗体阳性例次
诊断
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检测例数
Sm
RNP
SSA
SSB
ScL70
Jo-1
dsDNA
核糖体
M
心肌
SM
核
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SA
类风湿性关节炎
19
0
0
0
0
0
0
2
0
2
0
0
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4
0
幼年类风湿性关节炎
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
, 百拇医药
0
0
0
强直性脊柱炎
19
0
0
0
0
0
0
0
0
0
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0
0
0
0
系统红斑狼疮
16
3
7
7
0
1
0
7
0
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0
0
1
11
1
干燥综合症
2
0
0
2
0
0
0
0
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0
0
2
0
0
0
白塞病
2
2
2
0
0
0
0
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0
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0
0
0
0
0
成人斯替尔病
2
0
0
0
0
0
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0
0
0
0
0
0
0
0
链球菌感染后综合征
1
0
0
0
0
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
多发性肌炎
1
0
0
0
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
注：M为抗线粒体抗体,SM为抗横纹肌抗体,SA为抗胃壁细胞抗体，dsDNA为抗双链DNA抗体表3 抗内耳抗体阳性组与阴性组的自身抗体阳性例次
组别
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检测
例数
抗
Sm
抗
RNP
抗
SSA
抗
dsDNA
抗核
SA
内耳抗体阳性组
, http://www.100md.com 6
2
3
2
3
4
1
内耳抗体阴性组
24
2
5
6
5
8
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0
注：在抗内耳抗体阳性组中，仅6例患者接受上述全套检测，内耳抗体阴性组中仅24例接受上述全套检测。讨论
所有RF患者CIC均显著升高,绝大多数患者血沉、类风湿因子及CRP升高，免疫球蛋白升高以IgG为主,说明Ⅲ型变态反应在其发病过程中起重要作用。而SLE情况较复杂,血沉、RF、CRP及CIC约半数显著升高,免疫球蛋白升高以IgG为主(63%),但IgM和IgA也不同程度升高；内耳抗体阳性者及其它自身抗体阳性主要出现于SLE患者。说明除了Ⅲ型变态反应之外,Ⅱ型变态反应在其病理过程中同样起着重要的作用,这就可以解释该病的多部位、多脏器损伤,如肾脏损害、心脏损害、中枢神经系统损害及听觉系统损害[2-4]。Sperling等[4]通过问卷调查65例SLE患者,了解其耳鸣、听力减退和听力波动情况。将有耳部症状和无耳部症状的患者进行比较,对有耳部主诉者行纯音测听,结果31%(26/84)SLE患者有耳部症状。10例进行纯音测听者7例听阈异常,7例听阈异常者中6例有平衡障碍。我们的检测发现31%(5/16)SLE患者内耳抗体阳性,与上述临床听力调查结果一致，虽然该数据不排除某种巧合，但从本观察结果可以推测,SLE对听觉系统确实存在潜在免疫损伤,因为患者体内可产生强阳性的抗内耳抗体。至少检测SLE患者抗内耳抗体可以作为判断其多系统损伤的指标之一。
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突发性聋的原因不明,近年来有文献报道为自身免疫损伤所致[5],但是,据本观察可知自身免疫损伤至少不是其主要原因。
对照组中1例冠状动脉硬化心脏病患者抗内耳抗体强阳性说明本病具有损害听觉系统的潜在可能, 据文献报道, 衣原体感染诱导的免疫反应可能是冠状动脉硬化心脏病的病理基础[6], 在急性冠状动脉综合征的局灶白介素2受体阳性T淋巴细胞百分率显著升高, 表明其免疫反应被激活并放大[7], 抗-氧化的低密度脂蛋白抗体可预报Ⅰ型糖尿病的冠状动脉病变[8] 。因此，冠状动脉硬化心脏病的发生与免疫反应关系密切。
从检测结果可以看出,REILMD作为一种临床上筛选抗体的方法具有快速、简便、灵敏等特点,结果容易判断。用免疫转印方法对阳性抗体进一步鉴定，可以获得更多信息。虽然单独发生的自身免疫性内耳病的发生率尚无确切统计数字，但是，免疫损伤导致的听力减退确实存在，在临床上对可疑患者进行内耳抗体筛选具有重要意义。REILMD法将该抗体的批量测试变得极为简单，有望将其发展为诊断系统以便在临床上推广应用。
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作者单位：邹静(050082 石家庄 白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科)
毕爱芳(050082 石家庄 白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科)
吴兴辰(神经内科)
李振彬(中医科)
杨伟炎(解放军总医院耳鼻咽喉科)
通信作者：邹静(Email：zouj@126.com)
参考文献
1，邹静,翟所强,姜泗长,等. 豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析. 中华耳鼻咽喉科杂志,1995,30:13-16.
2，黄次波,朱楚汉. 系统性红斑狼疮. 见:孔海云. 现代自身免疫病学.北京:人民军医出版社,1996.151-182.
, 百拇医药
3，袁国华,魏琴,刘湘源, 等. 系统性红斑狼疮并发中枢神经系统病变的危险因素. 中华风湿病杂志,1999,3:33-35.
4，Sperling NM, Tehrani K, Liebling A, et al.Aural symptoms and hearing loss in patients with lupus.Otolaryngol Head Neck Surg,1998,118:762-765.
5，Veldman JE, Hanada T, Meeuwsen F.Diagnostic and therapeutic dilemmas in rapidly progressive sensorineural hearing loss and sudden deafness. A reappraisal of immune reactivity in inner ear disorders.Acta Otolaryngol ,1993,113:303-306.
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6，Halme S,Syrjala H,Bloigu A,et al.Lymphocyte responses to Chlamydia antigens in patients with coronary heart disease.Eur Heart J,1997,18:1095-1101.
7，van der Wal AC, Piek JJ, de Boer OJ,et al.Recent activation of the plaque immune response in coronary lesions underlying acute coronary syndromes. Heart,1998,80:14-18.
8，Orchard TJ,Virella G,Forrest KY,et al.Antibodies to oxidized LDL predict coronary artery disease in type 1 diabetes:a nested case-control study from the Pittsburgh Epidemiology of Diabetes Complications Study.Diabetes,1999,48:1454-1458., 百拇医药
摘 要 目的 探讨用一种新建立的外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析 (rapid electric field immobilizing liquid phase molecule dot blot，REILMD) 法检测自身免疫性疾病患者抗内耳抗体的临床意义。方法 收集11种确诊的自身免疫性疾病患者共71例，突发性聋21例，非免疫性疾病患者48例(对照组)。检测内容包括一般免疫指标及自身抗体如抗smooth muscle (Sm)、抗ribonucleoprotein (RNP)、抗Sjgren's syndrome A (SSA)、抗Sjgren's syndrome B (SSB)、抗DNA topoisomerase I (Scl)70、抗histidyl-tRNA synthetase (Jo-1)、抗核糖体、抗双链DNA、抗组织和抗内耳抗体。抗内耳抗体检测先用REILMD筛选,再用免疫转印方法确定相对分子质量。结果 类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis，RA)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)主要表现为血沉加快, 类风湿因子阳性, C-反应蛋白、IgG、循环免疫复合物升高,少数IgA、IgM及C4升高。在RA中2/16抗双链DNA和抗线粒体及4/16抗核抗体阳性。在SLE中11/16抗核抗体、7/13抗RNP抗体、抗SSA抗体和抗双链DNA抗体,3/13抗Sm抗体、1/13抗ScL70抗体、抗横纹肌和抗胃壁细胞抗体阳性。强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS) 均为阴性。经REILMD法筛选共在9例自身免疫性疾病患者(占13%)、2例突发性耳聋患者(占10%)及1例对照(冠状动脉硬化心脏病占2%)中检出强阳性抗内耳抗体, 其中SLE抗体阳性率为31%(5/16),RA、AS、白塞病和链球菌感染后综合症各1例阳性。在所有抗内耳抗体阳性患者中,抗核抗体阳性率高达67%,抗RNP和抗dsDNA抗体阳性率为50%。用免疫转印法分析发现该抗体识别抗原分子的相对分子质量主要为52 000、36 000、31 000和15 000。结论 用REILMD法筛选抗内耳抗体为一种临床实用的简便方法,数种自身免疫性疾病有内耳损害的可能,以SLE为主。
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关键词：免疫测定 自身免疫疾病 自身抗体 迷路
检索Medline得知1967年以来全球共在有影响的杂志上发表有关内耳免疫的论文 554篇。因此,内耳免疫研究历史悠久,已经受到全世界广泛关注。虽然已经有许多免疫检测方法用于内耳免疫研究,但是,由于特异性、灵敏度以及操作难等诸多因素的影响,大多数方法或者已经被淘汰,或者不能作为一种常规检查而广泛应用。临床上急需一种特异性较好、操作简便、快捷、经济的检测方法。我们经过不断探索,逐步完善,寻找出一种内耳抗原抗体检测方法,将该方法命名为外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析(rapid electric field immobilizing liquid phase molecule dot blot，REILMD)法(详细资料已另文总结，投中华微生物免疫学杂志)。现将用该方法检测临床确诊的自身免疫性疾病和突发性聋患者抗内耳抗体的结果报告如下。
材料与方法
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一、材料
1.临床资料：11种确诊的自身免疫性疾病患者来自我院中医科、肾病科和皮肤科，共71例，男33例，女38例；年龄10～70岁，平均36岁。其中类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)19例，男3例，女16例；幼年类风湿性关节炎2例，男女各1例；强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)19例，男18例，女1例；系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)16例，男4例，女12例；白塞病2例，男女各1例；干燥综合症2例，均为女性；成人斯替尔病2例，男女各1例；多发性肌炎1例，女性；链球菌感染后综合症1例，女性；多发性大动脉炎1例，女性；肾病综合症6例，男5例，女1例。各病诊断依据国际标准及全国标准。突发性聋患者来自我院耳鼻咽喉科，共21例，男15例，女6例，年龄20～56岁，平均32岁。对照组48例，为我院各科明确非自身免疫性疾病的其它疾病患者。
2.主要试剂：HRP-羊抗人IgG为卫生部北京生物制品研究所产品。用于体外检测抗核抗原抗体的自身免疫检查试剂盒-6(AUTO6)为美国GenBio公司产品。羊抗人IgG荧光抗体为卫生部上海生物制品研究所产品。
, 百拇医药
3.主要仪器：77000X Easy-TiterTM ELIFA System为美国Pierce公司生产,改造后用于REILMD分析。Eagle Eye TM Ⅱ 型电泳图像分析系统为美国Cold Spring Harbor公司产品。7150型全自动生化分析仪为日立公司生产。其它各种电泳仪器为北京六一仪器厂产品。
二、方法
一般项目检测包括血沉、类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、循环免疫复合物(circulating immune complex，CIC)、抗链球菌溶血素“O”等。检测免疫球蛋白和补体用免疫比浊法,检测CRP用琼脂单扩散法,检测CIC用 PEG沉淀法,检测RF和抗链球菌溶血素“O”用胶乳凝集法。
自身抗体检测采用以下几种方式：
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1.抗多肽抗体检测：按试剂盒说明书分别检测抗smooth muscle (Sm)抗体、抗ribonucleoprotein (RNP)抗体、抗Sjgren syndrome A (SSA)抗体、抗Sjgren syndrome B (SSB)抗体、抗DNA topoisomerase I (Scl)-70抗体、抗histidyl-tRNA synthetase (Jo-1)抗体和抗核糖体抗体。
2.抗双链DNA和抗组织抗体：用鼠各种组织切片作底抗原片,采用间接免疫荧光法检测抗双链DNA和抗各种组织抗体。
3.抗内耳抗体检测：用 REILMD方法筛选，首先使用外加电场快速吸附膜迷路蛋白：先将一铂丝经ELIFA System排液孔插入缓冲液池,并弯曲成蛇形,其表面盖上滤纸,池内倒满转移电泳缓冲液(0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸,20%甲醇,pH 8.35),再按原说明书安装样品池底板,继续向缓冲液池注入缓冲液,直至其经96孔溢出,彻底驱赶96孔内气泡(该步骤非常重要),小心将预先浸泡该缓冲液的硝酸纤维素膜(nitrocellulose，NC膜)放于底板硅胶片表面,勿使其下面留任何气泡。盖好样品池顶板并拧紧螺栓固定(另一硅胶片盖于NC膜表面)。将样品池96孔内注满缓冲液,勿留气泡。用样品缓冲液(0.063 mol/L Tris-HCl，pH6.8,2%十二烷基磺酸钠,0.1%溴酚蓝,5%2-巯基已醇,10%蔗糖)将膜迷路蛋白稀释为0.9 mg/ml,每孔加入50 μL样品,小心将多层滤纸盖在上盖顶板96孔表面，滤纸间夹入蛇形弯曲的铂丝。上方铂丝接负极，缓冲液池铂丝接正极,200 mA电泳10 min。取下滤纸，丢弃缓冲液，然后筛选抗体：用蒸馏水冲洗微孔,每孔加200 μL PBS-T并在37℃摇浴5 min,再用含1%BSA的1∶40正常羊血清摇浴5 min。将待测血清进行1∶10稀释,每孔加入50 μL,同上摇浴10 min,拆卸装置,用塑料膜密封NC膜,用phosphoric acid buffer saline-tween (PBS-T)高速摇洗3 min,2次。加入1∶1 000 horse-radish peroxidase (HRP)羊抗人IgG 20 ml,同上摇浴10 min,并洗涤2次。加入用0.05 mol/L Tris(pH7.6)溶解的DAB20 ml,同上摇浴10 min,用PBS-T短暂漂洗。用Eagle Eye TM Ⅱ型电泳图像分析系统分析结果。
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免疫转印分析：用改良免疫转印法分析上述阳性血清，识别膜迷路蛋白的分子量[1]。
4.统计分析：用SPSS软件将所有数据进行统计分析。
结果
RA和SLE患者主要异常表现为血沉加快,RF阳性,CRP、IgG、CIC升高,少数IgA、IgM及C4升高。少部分RA患者抗dsDNA抗体、抗线粒体抗体及抗核抗体阳性。SLE患者自身抗体普较广,以抗核抗体、抗RNP抗体、SSA抗体和dsDNA抗体为主,少部分患者可出现抗Sm抗体、抗ScL-70抗体、抗横纹肌抗体和抗胃壁细胞抗体。AS患者主要表现为血沉加快,CRP、IgG、IgA、IgM、C4、CIC升高,无1例出现抗多肽抗体及各种组织细胞抗体(表1,2)。
经REILMD法筛选共在9例自身免疫性疾病患者、2例突发性耳聋患者(10%)及1例对照者(2%)中检出强阳性抗内耳抗体,在内耳抗体阳性的自身免疫疾病中,SLE 5例,阳性率为31%(5/16),RA、AS、白塞病和链球菌感染后综合症各1例。对照组48例中1例阳性者为冠状动脉硬化心脏病患者(2%，图1)。用免疫转印法分析发现该抗体识别抗原分子的相对分子质量主要为52 000、36 000、31 000和15 000(图2)。抗内耳抗体阳性组的其它自身抗体阳性率均高于内耳抗体阴性组,但统计学检验差异无显著性,可能是样本量不够所致(表3)。抗内耳抗体阳性组抗核抗体阳性率高达67%,抗RNP和抗dsDNA抗体阳性率为50%。
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图1用REILMD检测自身免疫性疾病患者抗内耳抗体B、D、F、H分别为A.C.E.G的重复,在其阳性反应结果中,A1,B1为强直性脊柱炎;A3,B3及A5,B5为SLE;C8,D8为白塞病
图2 自身免疫病患者抗内耳抗体阳性血清的免疫转印分析.1为白塞病;2,3,5,6为SLE;4相对分子质量42 700,为强直性脊柱;7为冠状动脉硬化心脏病
表1 自身免疫性疾病患者各项免疫指标异常例次
诊断
检测例数
血沉
, 百拇医药
RF
CRP
IgG
IgA
IgM
C3
C4
CIC
类风湿性关节炎
19
17
12
15
, 百拇医药
15
1
1
0
1
19
幼年类风湿性关节炎
2
2
1
1
0
0
1
, http://www.100md.com
1
1
1
强直性脊柱炎
19
11
0
6
8
4
5
0
6
7
, 百拇医药
系统红斑狼疮
16
9
7
5
10
2
3
0
3
6
干燥综合症
2
1
, 百拇医药
2
0
2
2
2
0
0
0
白塞病
2
2
1
2
1
, 百拇医药
0
1
0
2
0
成人斯替尔病
2
2
2
2
2
1
2
0
, 百拇医药
2
2
链球菌感染后综合征
1
2
0
2
2
0
2
0
0
0
多发性肌炎
, 百拇医药
1
2
0
2
2
0
2
0
0
2
注：每位患者仅接受部分项目检测，多发性大动脉炎和肾病综合症均未接受该检测，下表同表2 自身免疫性疾病患者抗多肽抗体及各种组织自身抗体阳性例次
诊断
, http://www.100md.com
检测例数
Sm
RNP
SSA
SSB
ScL70
Jo-1
dsDNA
核糖体
M
心肌
SM
核
, http://www.100md.com
SA
类风湿性关节炎
19
0
0
0
0
0
0
2
0
2
0
0
, http://www.100md.com
4
0
幼年类风湿性关节炎
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
, 百拇医药
0
0
0
强直性脊柱炎
19
0
0
0
0
0
0
0
0
0
, http://www.100md.com
0
0
0
0
系统红斑狼疮
16
3
7
7
0
1
0
7
0
, 百拇医药
0
0
1
11
1
干燥综合症
2
0
0
2
0
0
0
0
, http://www.100md.com
0
0
2
0
0
0
白塞病
2
2
2
0
0
0
0
, 百拇医药
0
0
0
0
0
0
0
成人斯替尔病
2
0
0
0
0
0
, http://www.100md.com
0
0
0
0
0
0
0
0
链球菌感染后综合征
1
0
0
0
0
, 百拇医药
0
0
0
0
0
0
0
0
0
多发性肌炎
1
0
0
0
, 百拇医药
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
注：M为抗线粒体抗体,SM为抗横纹肌抗体,SA为抗胃壁细胞抗体，dsDNA为抗双链DNA抗体表3 抗内耳抗体阳性组与阴性组的自身抗体阳性例次
组别
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检测
例数
抗
Sm
抗
RNP
抗
SSA
抗
dsDNA
抗核
SA
内耳抗体阳性组
, http://www.100md.com 6
2
3
2
3
4
1
内耳抗体阴性组
24
2
5
6
5
8
, http://www.100md.com
0
注：在抗内耳抗体阳性组中，仅6例患者接受上述全套检测，内耳抗体阴性组中仅24例接受上述全套检测。讨论
所有RF患者CIC均显著升高,绝大多数患者血沉、类风湿因子及CRP升高，免疫球蛋白升高以IgG为主,说明Ⅲ型变态反应在其发病过程中起重要作用。而SLE情况较复杂,血沉、RF、CRP及CIC约半数显著升高,免疫球蛋白升高以IgG为主(63%),但IgM和IgA也不同程度升高；内耳抗体阳性者及其它自身抗体阳性主要出现于SLE患者。说明除了Ⅲ型变态反应之外,Ⅱ型变态反应在其病理过程中同样起着重要的作用,这就可以解释该病的多部位、多脏器损伤,如肾脏损害、心脏损害、中枢神经系统损害及听觉系统损害[2-4]。Sperling等[4]通过问卷调查65例SLE患者,了解其耳鸣、听力减退和听力波动情况。将有耳部症状和无耳部症状的患者进行比较,对有耳部主诉者行纯音测听,结果31%(26/84)SLE患者有耳部症状。10例进行纯音测听者7例听阈异常,7例听阈异常者中6例有平衡障碍。我们的检测发现31%(5/16)SLE患者内耳抗体阳性,与上述临床听力调查结果一致，虽然该数据不排除某种巧合，但从本观察结果可以推测,SLE对听觉系统确实存在潜在免疫损伤,因为患者体内可产生强阳性的抗内耳抗体。至少检测SLE患者抗内耳抗体可以作为判断其多系统损伤的指标之一。
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突发性聋的原因不明,近年来有文献报道为自身免疫损伤所致[5],但是,据本观察可知自身免疫损伤至少不是其主要原因。
对照组中1例冠状动脉硬化心脏病患者抗内耳抗体强阳性说明本病具有损害听觉系统的潜在可能, 据文献报道, 衣原体感染诱导的免疫反应可能是冠状动脉硬化心脏病的病理基础[6], 在急性冠状动脉综合征的局灶白介素2受体阳性T淋巴细胞百分率显著升高, 表明其免疫反应被激活并放大[7], 抗-氧化的低密度脂蛋白抗体可预报Ⅰ型糖尿病的冠状动脉病变[8] 。因此，冠状动脉硬化心脏病的发生与免疫反应关系密切。
从检测结果可以看出,REILMD作为一种临床上筛选抗体的方法具有快速、简便、灵敏等特点,结果容易判断。用免疫转印方法对阳性抗体进一步鉴定，可以获得更多信息。虽然单独发生的自身免疫性内耳病的发生率尚无确切统计数字，但是，免疫损伤导致的听力减退确实存在，在临床上对可疑患者进行内耳抗体筛选具有重要意义。REILMD法将该抗体的批量测试变得极为简单，有望将其发展为诊断系统以便在临床上推广应用。
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作者单位：邹静(050082 石家庄 白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科)
毕爱芳(050082 石家庄 白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科)
吴兴辰(神经内科)
李振彬(中医科)
杨伟炎(解放军总医院耳鼻咽喉科)
通信作者：邹静(Email：zouj@126.com)
参考文献
1，邹静,翟所强,姜泗长,等. 豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析. 中华耳鼻咽喉科杂志,1995,30:13-16.
2，黄次波,朱楚汉. 系统性红斑狼疮. 见:孔海云. 现代自身免疫病学.北京:人民军医出版社,1996.151-182.
, 百拇医药
3，袁国华,魏琴,刘湘源, 等. 系统性红斑狼疮并发中枢神经系统病变的危险因素. 中华风湿病杂志,1999,3:33-35.
4，Sperling NM, Tehrani K, Liebling A, et al.Aural symptoms and hearing loss in patients with lupus.Otolaryngol Head Neck Surg,1998,118:762-765.
5，Veldman JE, Hanada T, Meeuwsen F.Diagnostic and therapeutic dilemmas in rapidly progressive sensorineural hearing loss and sudden deafness. A reappraisal of immune reactivity in inner ear disorders.Acta Otolaryngol ,1993,113:303-306.
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6，Halme S,Syrjala H,Bloigu A,et al.Lymphocyte responses to Chlamydia antigens in patients with coronary heart disease.Eur Heart J,1997,18:1095-1101.
7，van der Wal AC, Piek JJ, de Boer OJ,et al.Recent activation of the plaque immune response in coronary lesions underlying acute coronary syndromes. Heart,1998,80:14-18.
8，Orchard TJ,Virella G,Forrest KY,et al.Antibodies to oxidized LDL predict coronary artery disease in type 1 diabetes:a nested case-control study from the Pittsburgh Epidemiology of Diabetes Complications Study.Diabetes,1999,48:1454-1458., 百拇医药