结缔组织生长因子基因的克隆
http://www.100md.com
中国医科学院学报 2000年第22卷第1期
李琦涵 赵红玲 王炯 付家中 赵树栋 姜莉
摘 要：目的 克隆细胞即刻早期基因反应产物人结缔组织生长因子(CTGF)基因，对分析细胞基因反应及 用于创伤修复研究的理论和应用研究均具有较大意义。方法 使用组织培养的方法，建立了人脐静脉内皮细胞系，在适当刺激后，提取mRNA，应用RT-PC R方法，分段克隆人结缔组织生长因子基因，并经无义突变形成酶切位点使之连接。 结果 经序列测定，发现该CTGF基因具有完整编码区及不同于文献报道的3′端非编码区结构的结 缔组织生长因子基因。结论 获得一个新的人CTGF基因。
关键词：人结缔组织生长因子 基因 克隆
在创伤修复研究中，表皮细胞及间充质细胞生长活性的调控是一个十分重要的部分。在 此过程中除了一些已知的细胞因子，如表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF) 、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)在发挥作用外，还有一些以即刻早 期基因(immediate-early gene)产物形式产生的细胞因子也起着重要的作用[1]。 近 年来发现的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)即是其中之一。CT GF属于一组对成纤维细胞、表皮细胞生长具有调节作用的即刻基因产物，它们包括鸡胚成纤 维细胞产生的Cef10[2]、鼠成纤维细胞3T3产生的Cyr61[3]和Fisp-12 [4]、鸡肾细胞产生的Nov[5]、非州爪蟾的Xnov。这组基因具有结构上的相 似性，其大小范围为343～379个氨基酸，并含有两个富含半胱氨酸(38→39个)的较保守区域 ，在序列上有一定同源性。对这组生长因子类活性物质的研究很可能是深入研究细胞增殖周期及分化调节机制的一个新途径。同时，由于它们在创伤修复中的特殊意义，尤其是人CTGF可以启动一系列介导组织创伤修复和再生的生物学过程[6]，故具有潜在的应用前 景。基于该因子的特点，本文的工作为利用中国人种脐静脉内皮细胞克隆人CTGF，其目的是 为深入研究创伤修复的分子机制及应用上的可能提供基础。
, 百拇医药
材料和方法
细胞 原代人脐静脉内皮细胞培养物，取自PBS洗净的健康婴儿脐带。胶原酶Ⅱ(Sigma产品)1 μg/ ml与0.025%的胰酶混合于PBS，将此混合液灌注于脐静脉中，37℃ 30 min，离心收集细胞 ，静止生长于含10%胎牛血清(Sigma产品)的1640培养液中，37℃ 3～4 d后形成单层。
mRNA提取 经血小板生长因子(PDGF)(10 pg/ml)刺激1 h后的人单层脐静脉细胞，冷PBS洗2次，并悬 浮 刮下的细胞，再经冷PBS洗后，使用mRNA提取试剂盒(Pharmacia产品)提取mRNA，方法按试剂 盒使用说明进行。
RT-PCR克隆CTGF基因 使用cDNA第一链逆转录试剂盒(Pharmacia产品)，先以PolyT为引物完成cDNA逆转录，方法按 试剂盒说明书。再以3对引物，分别以PCR方法扩增获取CTGF基因：(1) 5′GATGAATTCATGACC GCCGCCAG-TA3′，5′GACTGAATTCCGAAGTCACAGAAG-AG3′；(2) 5′GATGAATTCGCTCCCCGGCC -AACCGC3′，5′GATGGAATTCCGTGTCTTCC-AGTCG3′；(3) 5′GATGAATTCTTTGCCCCAG-ACCA AC3′，polyT-gAATTCATG(PCR试剂盒购自华美公司)。扩增条件为：95℃ 2.5 min，94℃ 1 min， 54 ℃ 1.5 min，72℃ 2 min，如此进行35次循环。产物纯化后以相应酶切，再与pUC-19连接 ，方法按常规 。以Lac-X-gal系统产生的蓝白斑筛选重组克隆。重组克隆再经酶切初步鉴定。
, 百拇医药
CTGF基因的序列测定 使用T7 DNA聚合酶测序试剂盒(Pharmacia产品)，M13/pUC常规引物(正向及反向)；和4对正 反向CTGF测序引物。测序过程按试剂盒说明书进行。测序样品上样于7.5%PAGE-尿素胶，1 700 V电泳，电泳完毕后经固定后使用X-胶片于室温曝光过夜。
结 果
人脐静脉内皮细胞原代培养物的建立 经胶原酶Ⅰ和胰酶混合消化的人脐静脉内皮细胞可以稳定形成贴壁单层细胞，但传代转为困 难。
经RT-PCR得到的CTGF基因克隆 经过3对引物的RT-PCR，分别得到0.55、0.56、0.86 kb的3个产物片段(图1)，利用设计 引物中的EcoRⅠ酶切位点克隆入pUC-19之中。3个片段经序列测序后，以重叠片段获得具有 完整编码区和3′端非编码区的CTGF基因(图2)。
, 百拇医药
图 1 经3对引物RT-PCR方法获得3个人结缔组织生长因子基因片段
Fig 1 Human connective tissue growth factor gene fragments from PT-PCR
1,4.DNA marker(入DNA/HindⅢ+EcoRⅠ)；2.RT-PCR of primer 1;3.RT-PCR of primer 2;5.RT-PCR of primer 3
图 2 人结缔组织生长因子基因克隆片段及测序方案
Fig 2 Cloning and sequencing map of human connective tissue growth factor gene fragments
, http://www.100md.com
CTGF基因测序结果 经多个克隆的不同片段测序后，证实该基因为人CTGF基因(图3)。
图 3 人结缔组织生长因子编码区和非编码区序列
Fig 3 The sequence of human connective tissue growth factor coding region a nd human 3′noncoding region
Underlined indicated the region is difference with the sequence reported[2]
讨论
, 百拇医药
CTGF是于1992年发现的一种以即刻早期基因产物形式产生的细胞因子。体外研究表明，CTGF 是由血小板生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)刺激某些血管内皮细胞而产 生，在创伤修复的生理学调节网络中具有特殊的意义。在机体中，CTGF可以刺激结缔组织细 胞，使其胞外基质的再生作用加强创伤处纤维填充、毛细血管生长加快等[7]。对 CTGF的这个生理效应的深入探讨发现，在机体的创伤反应中，CCN家族基因产物(如cyr61和F isp12)还提供了一种信号传递的机制，它使得远距离的细胞对创伤刺激也做出相应的基因反 应[8]。因此，CTGF除了做为即刻早期基因产物对细胞增殖反应进行调节作用外， 其应用意义也很明显。一些研究还提示：CTGF在主动脉粥样硬化等疾病的病理过程中出现了 较强的表达，这个现象表明CTGF在此病理过程中具有重要的作用，但是益还是弊尚未明确 [9]。本研究完整地克隆到中国人种的CTGF基因读码框架部分，与国外发表的CTGF基 因序列[2]稍有差异，且差异部分集中于3′端非编码区末端，编码区无差异，故对 该基因表达无明显影响。从而为进一步开展对CTGF基础研究工作及其应用探索提供了基础。
, 百拇医药
基金项目：云南省科技攻关项目(95C17-1)资助 Supported by the Yunnan Provi ncial
Program for Key Science and Technology Projects;
作者简介：李琦涵 Co rresponding author Tel:08718315905,Fax:0871-8181483,Email:glimbcam@km.y m.cn
作者单位：李琦涵(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
赵红玲(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
王炯(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
, 百拇医药
付家中(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
赵树栋(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
姜莉(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
参考文献：
[1] Ryseck RP,Macdonald-Bravo H,Mattei MG,et al.Structur e,ma pping,and expression of fish-12 a growth factor-inducible gene encoding a secr eted cysteine-rich protein.Cell Growth Differentia,1991,2:225-233
, 百拇医药
[2] Simmons D,Levy DB,Yannoni Y,et al.Indentification of a phorbo l es ter-repressible v-src-inducible gene.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:1178-118 2
[3] O'Brien TP,Yang GP,Sanders L,et al.Expression of cyr61,a grow th factor-inducible immediate-early gene.Mol Cell Biol,1990,10(7):3567-3577
[4] Bork P.The molecular.Architecture of a new family of growth regul ator related to connective tissue growth factor.FEBS,1993,327(2):123-130
, 百拇医药
[5] Joliot V,Martinerie C,Dambrine G,et al.Proviral rearrangement s an d overexpression of a new cellular gene(nov) in myelob-lastosis-associated vi rus type 1-induced nephroblastomas.Mol Cell Biol,1992,12:10-12
[6] Igarashi A,Okochi H,Bradham H,et al.Regulation of connective tissu e growth factor gene expression in human skin fibroblasts and during wound repai r.Mol Biol Cell,1993,4:637-645
[7] Frazier K,Williams S,Kothapalli D,et al.Stimulation of fibrob last cell growth,matrix production,and granulation tissue formation by coonective ti ssue growth factor.J Invest Dermatol,1996,107(3):404-411
[8] Kireeva ML,Latinkic BV,Kolesnikova TV,et al.Cyr61 and Fisp12 are both ECM-associated sigualing moleculos:activities,metabolism and localization during development.Exp Cell Res,1997,233(1):63-77
[9] Oemar BS,Luscher JF.Connective tissue growth factor:Friend or foe .Art eriosder Thromb Vasc Biol,1997,17(8):1483-1489, 百拇医药
摘 要：目的 克隆细胞即刻早期基因反应产物人结缔组织生长因子(CTGF)基因，对分析细胞基因反应及 用于创伤修复研究的理论和应用研究均具有较大意义。方法 使用组织培养的方法，建立了人脐静脉内皮细胞系，在适当刺激后，提取mRNA，应用RT-PC R方法，分段克隆人结缔组织生长因子基因，并经无义突变形成酶切位点使之连接。 结果 经序列测定，发现该CTGF基因具有完整编码区及不同于文献报道的3′端非编码区结构的结 缔组织生长因子基因。结论 获得一个新的人CTGF基因。
关键词：人结缔组织生长因子 基因 克隆
在创伤修复研究中，表皮细胞及间充质细胞生长活性的调控是一个十分重要的部分。在 此过程中除了一些已知的细胞因子，如表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF) 、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)在发挥作用外，还有一些以即刻早 期基因(immediate-early gene)产物形式产生的细胞因子也起着重要的作用[1]。 近 年来发现的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)即是其中之一。CT GF属于一组对成纤维细胞、表皮细胞生长具有调节作用的即刻基因产物，它们包括鸡胚成纤 维细胞产生的Cef10[2]、鼠成纤维细胞3T3产生的Cyr61[3]和Fisp-12 [4]、鸡肾细胞产生的Nov[5]、非州爪蟾的Xnov。这组基因具有结构上的相 似性，其大小范围为343～379个氨基酸，并含有两个富含半胱氨酸(38→39个)的较保守区域 ，在序列上有一定同源性。对这组生长因子类活性物质的研究很可能是深入研究细胞增殖周期及分化调节机制的一个新途径。同时，由于它们在创伤修复中的特殊意义，尤其是人CTGF可以启动一系列介导组织创伤修复和再生的生物学过程[6]，故具有潜在的应用前 景。基于该因子的特点，本文的工作为利用中国人种脐静脉内皮细胞克隆人CTGF，其目的是 为深入研究创伤修复的分子机制及应用上的可能提供基础。
, 百拇医药
材料和方法
细胞 原代人脐静脉内皮细胞培养物，取自PBS洗净的健康婴儿脐带。胶原酶Ⅱ(Sigma产品)1 μg/ ml与0.025%的胰酶混合于PBS，将此混合液灌注于脐静脉中，37℃ 30 min，离心收集细胞 ，静止生长于含10%胎牛血清(Sigma产品)的1640培养液中，37℃ 3～4 d后形成单层。
mRNA提取 经血小板生长因子(PDGF)(10 pg/ml)刺激1 h后的人单层脐静脉细胞，冷PBS洗2次，并悬 浮 刮下的细胞，再经冷PBS洗后，使用mRNA提取试剂盒(Pharmacia产品)提取mRNA，方法按试剂 盒使用说明进行。
RT-PCR克隆CTGF基因 使用cDNA第一链逆转录试剂盒(Pharmacia产品)，先以PolyT为引物完成cDNA逆转录，方法按 试剂盒说明书。再以3对引物，分别以PCR方法扩增获取CTGF基因：(1) 5′GATGAATTCATGACC GCCGCCAG-TA3′，5′GACTGAATTCCGAAGTCACAGAAG-AG3′；(2) 5′GATGAATTCGCTCCCCGGCC -AACCGC3′，5′GATGGAATTCCGTGTCTTCC-AGTCG3′；(3) 5′GATGAATTCTTTGCCCCAG-ACCA AC3′，polyT-gAATTCATG(PCR试剂盒购自华美公司)。扩增条件为：95℃ 2.5 min，94℃ 1 min， 54 ℃ 1.5 min，72℃ 2 min，如此进行35次循环。产物纯化后以相应酶切，再与pUC-19连接 ，方法按常规 。以Lac-X-gal系统产生的蓝白斑筛选重组克隆。重组克隆再经酶切初步鉴定。
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CTGF基因的序列测定 使用T7 DNA聚合酶测序试剂盒(Pharmacia产品)，M13/pUC常规引物(正向及反向)；和4对正 反向CTGF测序引物。测序过程按试剂盒说明书进行。测序样品上样于7.5%PAGE-尿素胶，1 700 V电泳，电泳完毕后经固定后使用X-胶片于室温曝光过夜。
结 果
人脐静脉内皮细胞原代培养物的建立 经胶原酶Ⅰ和胰酶混合消化的人脐静脉内皮细胞可以稳定形成贴壁单层细胞，但传代转为困 难。
经RT-PCR得到的CTGF基因克隆 经过3对引物的RT-PCR，分别得到0.55、0.56、0.86 kb的3个产物片段(图1)，利用设计 引物中的EcoRⅠ酶切位点克隆入pUC-19之中。3个片段经序列测序后，以重叠片段获得具有 完整编码区和3′端非编码区的CTGF基因(图2)。
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图 1 经3对引物RT-PCR方法获得3个人结缔组织生长因子基因片段
Fig 1 Human connective tissue growth factor gene fragments from PT-PCR
1,4.DNA marker(入DNA/HindⅢ+EcoRⅠ)；2.RT-PCR of primer 1;3.RT-PCR of primer 2;5.RT-PCR of primer 3
图 2 人结缔组织生长因子基因克隆片段及测序方案
Fig 2 Cloning and sequencing map of human connective tissue growth factor gene fragments
, http://www.100md.com
CTGF基因测序结果 经多个克隆的不同片段测序后，证实该基因为人CTGF基因(图3)。
图 3 人结缔组织生长因子编码区和非编码区序列
Fig 3 The sequence of human connective tissue growth factor coding region a nd human 3′noncoding region
Underlined indicated the region is difference with the sequence reported[2]
讨论
, 百拇医药
CTGF是于1992年发现的一种以即刻早期基因产物形式产生的细胞因子。体外研究表明，CTGF 是由血小板生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)刺激某些血管内皮细胞而产 生，在创伤修复的生理学调节网络中具有特殊的意义。在机体中，CTGF可以刺激结缔组织细 胞，使其胞外基质的再生作用加强创伤处纤维填充、毛细血管生长加快等[7]。对 CTGF的这个生理效应的深入探讨发现，在机体的创伤反应中，CCN家族基因产物(如cyr61和F isp12)还提供了一种信号传递的机制，它使得远距离的细胞对创伤刺激也做出相应的基因反 应[8]。因此，CTGF除了做为即刻早期基因产物对细胞增殖反应进行调节作用外， 其应用意义也很明显。一些研究还提示：CTGF在主动脉粥样硬化等疾病的病理过程中出现了 较强的表达，这个现象表明CTGF在此病理过程中具有重要的作用，但是益还是弊尚未明确 [9]。本研究完整地克隆到中国人种的CTGF基因读码框架部分，与国外发表的CTGF基 因序列[2]稍有差异，且差异部分集中于3′端非编码区末端，编码区无差异，故对 该基因表达无明显影响。从而为进一步开展对CTGF基础研究工作及其应用探索提供了基础。
, 百拇医药
基金项目：云南省科技攻关项目(95C17-1)资助 Supported by the Yunnan Provi ncial
Program for Key Science and Technology Projects;
作者简介：李琦涵 Co rresponding author Tel:08718315905,Fax:0871-8181483,Email:glimbcam@km.y m.cn
作者单位：李琦涵(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
赵红玲(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
王炯(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
, 百拇医药
付家中(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
赵树栋(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
姜莉(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物研究所病毒免疫室，昆 明 650118)
参考文献：
[1] Ryseck RP,Macdonald-Bravo H,Mattei MG,et al.Structur e,ma pping,and expression of fish-12 a growth factor-inducible gene encoding a secr eted cysteine-rich protein.Cell Growth Differentia,1991,2:225-233
, 百拇医药
[2] Simmons D,Levy DB,Yannoni Y,et al.Indentification of a phorbo l es ter-repressible v-src-inducible gene.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:1178-118 2
[3] O'Brien TP,Yang GP,Sanders L,et al.Expression of cyr61,a grow th factor-inducible immediate-early gene.Mol Cell Biol,1990,10(7):3567-3577
[4] Bork P.The molecular.Architecture of a new family of growth regul ator related to connective tissue growth factor.FEBS,1993,327(2):123-130
, 百拇医药
[5] Joliot V,Martinerie C,Dambrine G,et al.Proviral rearrangement s an d overexpression of a new cellular gene(nov) in myelob-lastosis-associated vi rus type 1-induced nephroblastomas.Mol Cell Biol,1992,12:10-12
[6] Igarashi A,Okochi H,Bradham H,et al.Regulation of connective tissu e growth factor gene expression in human skin fibroblasts and during wound repai r.Mol Biol Cell,1993,4:637-645
[7] Frazier K,Williams S,Kothapalli D,et al.Stimulation of fibrob last cell growth,matrix production,and granulation tissue formation by coonective ti ssue growth factor.J Invest Dermatol,1996,107(3):404-411
[8] Kireeva ML,Latinkic BV,Kolesnikova TV,et al.Cyr61 and Fisp12 are both ECM-associated sigualing moleculos:activities,metabolism and localization during development.Exp Cell Res,1997,233(1):63-77
[9] Oemar BS,Luscher JF.Connective tissue growth factor:Friend or foe .Art eriosder Thromb Vasc Biol,1997,17(8):1483-1489, 百拇医药