CD44和E-cadherin表达与肾癌细胞增殖潜能的研究
程小丽 李旭 陈葳 傅伟
摘要 目的：探讨CD44和E-cadherin分子表达与人肾癌细 胞增殖潜能的关系。方法：建立人肾癌GRC-1和RLC-310细胞的克隆 性亚细胞株，检测其克隆形成率，应用免疫组织化学法检测CD44和E-cadherin分子 表达，同时用流式细胞术分析CD44分子表达。结果：RLC-310 细胞的三个亚株RLC-310A，RLC-310B和RLC-310C在软琼脂上的集落形成率分别为48%，50 %，30%，CD44阳性表达率为10.6%，15.6%和65.0%；GRC-1细胞的三个亚株GRC-1A， GRC-1B和GRC-1C在软琼脂上均不形成集落，CD44阳性表达率分别为51.3%，64.8%和 83.5%。两株细胞的不同亚株E-cadherin表达均为强阳性。结论：肾 癌细胞株均表达CD44和E-cadherin，CD44表达下降与肾癌细胞的增殖潜能增 加有关，E-cadherin与肾癌细胞的增殖能力变化无明显关系。
, 百拇医药
关键词：肾肿瘤 癌
实体瘤组织中不同侵袭和转移潜能的克隆原细胞亚群是肿瘤生长转移和复发的基础。由于肿瘤侵袭和转移是造成临床治疗困难和病人死亡的主要原因，因而从肿瘤细胞增殖潜能角度研究肿瘤细胞侵袭和转移的分子机制对抑制肿瘤进展或逆转恶性肿瘤侵袭和转移表型具有十分重要的意义。资料表明，E-cadherin具有抑制侵袭作用，CD44分子与恶性肿瘤的侵袭和转移有关[1，2]。我们采用CD44和E-cadherin分子单克隆抗体对两株成瘤性不同的人肾癌细胞株亚株进行了免疫化学标记，以探讨肾癌细胞CD44和E-cadherin表达与细胞增殖能力的关系。
材料和方法
一、细胞株
人肾癌GRC-1细胞株购自北京医科大学泌尿外科研究所[3]，RLC-310肾癌细胞株为本室自建[4]。
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二、主要试剂及仪器
E-cadherin单克隆抗体为SHE78-7克隆。CD44单克隆抗体为2C5克隆，与全部CD44分子反应，包括CD44y3、4/5、6、8/9等[5]。LSAB试剂盒购自北京中山生物制品公司。流式细胞仪EpicsElite型，美国Coulter公司产品。
三、克隆性细胞株的建立
将处于指数生长期的GRC-1和RLC-310细胞各100个分别接种于60mm平皿中，37℃，CO2条件下培养，培养基为内含10%新生小牛血清的RPMI1640。每周换液2次，于第14d挑出单克隆扩大培养。
四、克隆形成率和集落形成率测定
将处于指数生长期的各种亚克隆细胞分别按100和200个的数量接种于60mm平皿中，持续培养14d后固定染色，计数克隆形成率。同时用含0.6%的低溶点琼脂糖10%小牛血清的DMEM铺底层，0.35%低溶点琼脂糖10%小牛血清的DMEM铺上层。将上述各亚克隆细胞按每皿(35mm)50和100个的数量分别加入上层培养基中，37℃，5%CO2条件培养14d，显微镜下计数集落。两种实验每个细胞数量均设三个平行样，每个实验重复三次，计数平均值。
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五、免疫组织化学染色
将生长旺盛的各种亚克隆细胞接种于盖玻片上，培养48h后用0.25%戊二醛固定，经3%H2O2处理后，分别滴加1∶10的抗CD44抗体和1∶100的抗E-cadherin抗体，按LSAB试剂盒操作，AEC染色，苏木素复染，中性树胶封片，PBS代替一抗作空白对照，已知阳性标本作阳性对照。阳性判断，两种分子均以细胞膜染色为阳性反应，阳性细胞>50%者判定为+++，25%～为++，<25%为+。
六、流式细胞仪分析
取指数生长期的亚克隆细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，分别用抗CD44单克隆抗体和同型抗体(阴性对照)标记，40min后用PBS洗涤，用流式细胞仪分析。计数2×104个细胞中阳性细胞的百分比。
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结 果
一、克隆形成率与集落形成率
从GRC-1和RLC-310细胞中分别建立三个亚克隆细胞株，分别命名为GRC-1A、GRC-1B、GRC-1C和RLC-310A、RLC-310B、RLC-310C，其克隆形成率和集落形成率见表1。
表1 肾癌不同亚克隆细胞株克隆原细胞形成率(%)
细胞株
克隆形成率
集落形成率
GRC-1A
25
0
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GRC-1B
23
0
GRC-1C
18
0
RLC-310A
56
48
RLC-310B
62
50
RLC-310C
, 百拇医药
83
30
二、CD44分子表达
GRC-1和RLC-310细胞的不同亚株均表达CD44，但存在表达强度的区别，同一细胞的各亚株之间也存在差异，流式细胞仪检测与免疫组化结果见表2。表2 肾癌不同亚克隆细胞株CD44分子表达
细胞株
免疫组化
染色阳性
流式细胞术阳性
细胞比例(%)
GRC-1A
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+++
51.3
GRC-1B
+++
64.8
GRC-1C
+++
83.5
RLC-310A
+
10.6
RLC-310B
+
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15.6
RLC-310C
+++
65.0
三、E-cadherin分子表达
GRC-1和RLC-310细胞的各亚株均表达E-cadherin，表达强度均为+++。讨 论
针对肿瘤细胞侵袭和转移过程具有多阶段、多因素参与的特点，人们试图从肿瘤转移的分子机理中寻找转移性癌细胞的标志，CD44和E-cadherin分子表达改变与肿瘤细胞侵袭和转移的关系引起更多关注[6，7]。本实验结果表明，CD44分子表达变化与肾癌细胞的增殖潜能有关。
CD44基因由于其转录过程中的不同剪接和翻译后的不同修饰，产生20种CD44变异体分子，主要分为不含V区外显子的标准型，CD44S或CD44H，和含有V区外显子的变异型CD44V。它们分别起着淋巴细胞增生的分化抗原，淋巴细胞和内皮细胞相互作用的粘附分子，胚胎发育过程中细胞外基质再塑形功能糖蛋白和细胞恶变及转移潜能标志物的作用[7]。
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人正常肾小球低表达CD44S，主要在基质区域。胎儿肾脏和成人肾脏均不表达CD44V3、X4/s、V6、V8/9等变异型[5]，而肾癌组织不仅表达CD44S，也表达不同的CD44V，并且随着肿瘤进展表达强度明显增加[8]。这种CD44V的表达与肿瘤进展和预后相关性也见于非小细胞肺癌、结肠癌、乳癌和胃癌等[9，10]。既往研究表明：GRC-1细胞的细胞倍增时间为16h，克隆形成率和集落形成率分别为14%和17.5%[3]，RLC-310细胞的群体倍增时间为32h，克隆形成率和集落形成率分别为42%和44%[4]。我们采用能与各种CD44分子结合的抗CD44单克隆抗体，检测不同克隆原性的人肾癌亚克隆细胞株，发现细胞增殖能力差的GRC-1细胞亚克隆都高表达CD44分子，而RLC-310细胞亚克隆CD44表达下降，如RLC-310A和RLC-310B，同一细胞的不同亚克隆细胞CD44表达也有差异。由于肿瘤细胞的生长、转移和多发都依赖于细胞增殖，增殖能力强弱必然影响到肿瘤的形成和转移。GRC-1细胞接种裸鼠成瘤后7天消失,RLC-310细胞接种裸鼠100%成瘤(8/8)，这一结果也支持上述观点。因此我们认为，CD44分子的高表达与肾癌进展有关，同时肾癌增殖能力变化也引起CD44分子的表达改变。近年来人们也发现在宫颈CINIII和原位癌以及有淋巴结转移者CD44S和不同的CD44V表达下降[11]。
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E-cadherin是钙依赖粘附素家族成员之一。在肿瘤细胞中的改变为表达下降，具有侵袭性的癌细胞E-cadherin呈阴性表达[6]。本实验中，不同增殖潜能和成瘤性的肾癌细胞均高表达E-cadherin，不同克隆原细胞的亚克隆细胞株之间E-cadherin表达无明显区别，表明肾癌细胞的增殖能力与E-cadherin分子表达之间无明显关系，同时也显示肾癌细胞CD44分子表达改变与E-cadherin分子之间缺乏相关性。
总之，由于CD44分子在原发灶与移植灶不同类型肿瘤中表达的不一致性[12]，以及体外实验资料结果的差异性，将CD44作为肿瘤转移标志物还需作更多的工作 。
作者单位：程小丽(710061 西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心)
李 旭(710061 西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心)
, 百拇医药
陈 葳(710061 西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心)
傅 伟(710061 西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心)
参考文献
1 王吾如.关于癌转移分子病理学的研究.中华病理学杂志,1994,23∶197-199.
2 Rudy W,Hofmann M,Schwartzalbiez R,et al. The two major CD44 protein e xp ressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice va riants:each one individually suffices to confer metastatic behavior.Cancer Res, 1993,53∶1262-1268.
, 百拇医药
3 丁义,俞莉章,李鸣,等.人肾癌颗粒细胞系(GRC-1)的建立及其生物学特性.中华泌尿 外科杂志,1995,16∶3-6.
4 李旭,南勋义,党建功,等.人肾癌细胞系RLC-310的建立及其生物学特性.中华泌尿外科 杂志,1996,17∶643-646.
5 Fox S,Fawcett J,Jackson D,et al.Normal human tissues,in addition to some tu mors,express multiple different CD44 isoforms. Cancer Res,1994,54∶4539-4 546.
6 曹世龙主编.肿瘤学新理论与新技术.第1版.上海:上海科技教育出版社.1997,290-30 5.
7 Borland G,Ross JA,Guy K.Forms and functions of CD44.Immunology,1998,93 ∶139-146.
, 百拇医药
8 Terpe HJ,Storkel S,Zimmer U,et al.Expression of CD44 isoforms in renal cell tumors.Am J Pathol,1996,148∶453-458.
9 Hirata J,Fukuse J,Naiki H,et al.Expression of CD44 variant exon 6 in st age I non-small cell lung carcinomas as a prognostic factor.Cancer Res,1998,58 ∶1108-1110.
10 Hsieh HF,Yu JC,Ho L,et al.Molecular studies into the role of CD4 4 v ariant in metastasis in gastric cancer.J Clin Pathol:Mol Pathol,1999,52∶25-30.
11 Shimabukuro K,Toyama SN,Ozaki Y,et al.The expression patterns of standard and variant CD44 molecules in normal uterine cervix and cervical cancer.Gy necol Oncol,1997,64∶26-32.
12 甘云,芬淑贞,雍凌.CD44粘附分子表达与肿瘤转移相关性的探讨.中国癌症杂志 ,1998,8∶267-271., 百拇医药
摘要 目的：探讨CD44和E-cadherin分子表达与人肾癌细 胞增殖潜能的关系。方法：建立人肾癌GRC-1和RLC-310细胞的克隆 性亚细胞株，检测其克隆形成率，应用免疫组织化学法检测CD44和E-cadherin分子 表达，同时用流式细胞术分析CD44分子表达。结果：RLC-310 细胞的三个亚株RLC-310A，RLC-310B和RLC-310C在软琼脂上的集落形成率分别为48%，50 %，30%，CD44阳性表达率为10.6%，15.6%和65.0%；GRC-1细胞的三个亚株GRC-1A， GRC-1B和GRC-1C在软琼脂上均不形成集落，CD44阳性表达率分别为51.3%，64.8%和 83.5%。两株细胞的不同亚株E-cadherin表达均为强阳性。结论：肾 癌细胞株均表达CD44和E-cadherin，CD44表达下降与肾癌细胞的增殖潜能增 加有关，E-cadherin与肾癌细胞的增殖能力变化无明显关系。
, 百拇医药
关键词：肾肿瘤 癌
实体瘤组织中不同侵袭和转移潜能的克隆原细胞亚群是肿瘤生长转移和复发的基础。由于肿瘤侵袭和转移是造成临床治疗困难和病人死亡的主要原因，因而从肿瘤细胞增殖潜能角度研究肿瘤细胞侵袭和转移的分子机制对抑制肿瘤进展或逆转恶性肿瘤侵袭和转移表型具有十分重要的意义。资料表明，E-cadherin具有抑制侵袭作用，CD44分子与恶性肿瘤的侵袭和转移有关[1，2]。我们采用CD44和E-cadherin分子单克隆抗体对两株成瘤性不同的人肾癌细胞株亚株进行了免疫化学标记，以探讨肾癌细胞CD44和E-cadherin表达与细胞增殖能力的关系。
材料和方法
一、细胞株
人肾癌GRC-1细胞株购自北京医科大学泌尿外科研究所[3]，RLC-310肾癌细胞株为本室自建[4]。
, 百拇医药
二、主要试剂及仪器
E-cadherin单克隆抗体为SHE78-7克隆。CD44单克隆抗体为2C5克隆，与全部CD44分子反应，包括CD44y3、4/5、6、8/9等[5]。LSAB试剂盒购自北京中山生物制品公司。流式细胞仪EpicsElite型，美国Coulter公司产品。
三、克隆性细胞株的建立
将处于指数生长期的GRC-1和RLC-310细胞各100个分别接种于60mm平皿中，37℃，CO2条件下培养，培养基为内含10%新生小牛血清的RPMI1640。每周换液2次，于第14d挑出单克隆扩大培养。
四、克隆形成率和集落形成率测定
将处于指数生长期的各种亚克隆细胞分别按100和200个的数量接种于60mm平皿中，持续培养14d后固定染色，计数克隆形成率。同时用含0.6%的低溶点琼脂糖10%小牛血清的DMEM铺底层，0.35%低溶点琼脂糖10%小牛血清的DMEM铺上层。将上述各亚克隆细胞按每皿(35mm)50和100个的数量分别加入上层培养基中，37℃，5%CO2条件培养14d，显微镜下计数集落。两种实验每个细胞数量均设三个平行样，每个实验重复三次，计数平均值。
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五、免疫组织化学染色
将生长旺盛的各种亚克隆细胞接种于盖玻片上，培养48h后用0.25%戊二醛固定，经3%H2O2处理后，分别滴加1∶10的抗CD44抗体和1∶100的抗E-cadherin抗体，按LSAB试剂盒操作，AEC染色，苏木素复染，中性树胶封片，PBS代替一抗作空白对照，已知阳性标本作阳性对照。阳性判断，两种分子均以细胞膜染色为阳性反应，阳性细胞>50%者判定为+++，25%～为++，<25%为+。
六、流式细胞仪分析
取指数生长期的亚克隆细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，分别用抗CD44单克隆抗体和同型抗体(阴性对照)标记，40min后用PBS洗涤，用流式细胞仪分析。计数2×104个细胞中阳性细胞的百分比。
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结 果
一、克隆形成率与集落形成率
从GRC-1和RLC-310细胞中分别建立三个亚克隆细胞株，分别命名为GRC-1A、GRC-1B、GRC-1C和RLC-310A、RLC-310B、RLC-310C，其克隆形成率和集落形成率见表1。
表1 肾癌不同亚克隆细胞株克隆原细胞形成率(%)
细胞株
克隆形成率
集落形成率
GRC-1A
25
0
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GRC-1B
23
0
GRC-1C
18
0
RLC-310A
56
48
RLC-310B
62
50
RLC-310C
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83
30
二、CD44分子表达
GRC-1和RLC-310细胞的不同亚株均表达CD44，但存在表达强度的区别，同一细胞的各亚株之间也存在差异，流式细胞仪检测与免疫组化结果见表2。表2 肾癌不同亚克隆细胞株CD44分子表达
细胞株
免疫组化
染色阳性
流式细胞术阳性
细胞比例(%)
GRC-1A
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+++
51.3
GRC-1B
+++
64.8
GRC-1C
+++
83.5
RLC-310A
+
10.6
RLC-310B
+
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15.6
RLC-310C
+++
65.0
三、E-cadherin分子表达
GRC-1和RLC-310细胞的各亚株均表达E-cadherin，表达强度均为+++。讨 论
针对肿瘤细胞侵袭和转移过程具有多阶段、多因素参与的特点，人们试图从肿瘤转移的分子机理中寻找转移性癌细胞的标志，CD44和E-cadherin分子表达改变与肿瘤细胞侵袭和转移的关系引起更多关注[6，7]。本实验结果表明，CD44分子表达变化与肾癌细胞的增殖潜能有关。
CD44基因由于其转录过程中的不同剪接和翻译后的不同修饰，产生20种CD44变异体分子，主要分为不含V区外显子的标准型，CD44S或CD44H，和含有V区外显子的变异型CD44V。它们分别起着淋巴细胞增生的分化抗原，淋巴细胞和内皮细胞相互作用的粘附分子，胚胎发育过程中细胞外基质再塑形功能糖蛋白和细胞恶变及转移潜能标志物的作用[7]。
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人正常肾小球低表达CD44S，主要在基质区域。胎儿肾脏和成人肾脏均不表达CD44V3、X4/s、V6、V8/9等变异型[5]，而肾癌组织不仅表达CD44S，也表达不同的CD44V，并且随着肿瘤进展表达强度明显增加[8]。这种CD44V的表达与肿瘤进展和预后相关性也见于非小细胞肺癌、结肠癌、乳癌和胃癌等[9，10]。既往研究表明：GRC-1细胞的细胞倍增时间为16h，克隆形成率和集落形成率分别为14%和17.5%[3]，RLC-310细胞的群体倍增时间为32h，克隆形成率和集落形成率分别为42%和44%[4]。我们采用能与各种CD44分子结合的抗CD44单克隆抗体，检测不同克隆原性的人肾癌亚克隆细胞株，发现细胞增殖能力差的GRC-1细胞亚克隆都高表达CD44分子，而RLC-310细胞亚克隆CD44表达下降，如RLC-310A和RLC-310B，同一细胞的不同亚克隆细胞CD44表达也有差异。由于肿瘤细胞的生长、转移和多发都依赖于细胞增殖，增殖能力强弱必然影响到肿瘤的形成和转移。GRC-1细胞接种裸鼠成瘤后7天消失,RLC-310细胞接种裸鼠100%成瘤(8/8)，这一结果也支持上述观点。因此我们认为，CD44分子的高表达与肾癌进展有关，同时肾癌增殖能力变化也引起CD44分子的表达改变。近年来人们也发现在宫颈CINIII和原位癌以及有淋巴结转移者CD44S和不同的CD44V表达下降[11]。
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E-cadherin是钙依赖粘附素家族成员之一。在肿瘤细胞中的改变为表达下降，具有侵袭性的癌细胞E-cadherin呈阴性表达[6]。本实验中，不同增殖潜能和成瘤性的肾癌细胞均高表达E-cadherin，不同克隆原细胞的亚克隆细胞株之间E-cadherin表达无明显区别，表明肾癌细胞的增殖能力与E-cadherin分子表达之间无明显关系，同时也显示肾癌细胞CD44分子表达改变与E-cadherin分子之间缺乏相关性。
总之，由于CD44分子在原发灶与移植灶不同类型肿瘤中表达的不一致性[12]，以及体外实验资料结果的差异性，将CD44作为肿瘤转移标志物还需作更多的工作 。
作者单位：程小丽(710061 西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心)
李 旭(710061 西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心)
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陈 葳(710061 西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心)
傅 伟(710061 西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心)
参考文献
1 王吾如.关于癌转移分子病理学的研究.中华病理学杂志,1994,23∶197-199.
2 Rudy W,Hofmann M,Schwartzalbiez R,et al. The two major CD44 protein e xp ressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice va riants:each one individually suffices to confer metastatic behavior.Cancer Res, 1993,53∶1262-1268.
, 百拇医药
3 丁义,俞莉章,李鸣,等.人肾癌颗粒细胞系(GRC-1)的建立及其生物学特性.中华泌尿 外科杂志,1995,16∶3-6.
4 李旭,南勋义,党建功,等.人肾癌细胞系RLC-310的建立及其生物学特性.中华泌尿外科 杂志,1996,17∶643-646.
5 Fox S,Fawcett J,Jackson D,et al.Normal human tissues,in addition to some tu mors,express multiple different CD44 isoforms. Cancer Res,1994,54∶4539-4 546.
6 曹世龙主编.肿瘤学新理论与新技术.第1版.上海:上海科技教育出版社.1997,290-30 5.
7 Borland G,Ross JA,Guy K.Forms and functions of CD44.Immunology,1998,93 ∶139-146.
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8 Terpe HJ,Storkel S,Zimmer U,et al.Expression of CD44 isoforms in renal cell tumors.Am J Pathol,1996,148∶453-458.
9 Hirata J,Fukuse J,Naiki H,et al.Expression of CD44 variant exon 6 in st age I non-small cell lung carcinomas as a prognostic factor.Cancer Res,1998,58 ∶1108-1110.
10 Hsieh HF,Yu JC,Ho L,et al.Molecular studies into the role of CD4 4 v ariant in metastasis in gastric cancer.J Clin Pathol:Mol Pathol,1999,52∶25-30.
11 Shimabukuro K,Toyama SN,Ozaki Y,et al.The expression patterns of standard and variant CD44 molecules in normal uterine cervix and cervical cancer.Gy necol Oncol,1997,64∶26-32.
12 甘云,芬淑贞,雍凌.CD44粘附分子表达与肿瘤转移相关性的探讨.中国癌症杂志 ,1998,8∶267-271., 百拇医药