肿瘤坏死因子α对兔门静脉高压症形成的作用
周松 徐学俊 郑硕云 杨爱国
摘 要：目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)在门静脉高压症(PHT)形成过程中的作用。方法 本实验通过门静脉缩窄法制备兔PHT模型，采用MTT法测定对照组、PHT组门静脉缩窄后1，3，7d以及3周时的外周血TNF-α水平，并应用电磁血流量计和多导生理记录仪测定其门静脉血流动力学的变化以及一氧化氮(NO)合成抑制剂对PHT血流动力学的影响。结果 PHT组自由门静脉压(FPP)、门静脉血流量(PVF)、门体分流率(PSSRP)以及外周血TNF-α水平显著升高(P<0.01)；而平均动脉压(MAP)、向肝门静脉血流量(Qpv)、脏侧闭塞门静脉压(SOPP)明显下降(P<0.01)。应用NO合成抑制剂后PHT组PVF明显降低(P<0.01)，MAP明显升高(P<0.01)，而FPP无明显变化(P>0.05)；对照组除MAP明显升高(P<0.01)外，PVF，FPP均无明显变化(P>0.05)。结论 TNF-α对PHT血流动力学改变可能起重要作用，NO是介导此过程的主要介质。
, 百拇医药
关键词：高血压，门静脉/病理生理学 肿瘤坏死因子 疾病模型，动物 门静脉/病理生理学 一氧化氮
门静脉高压症(PHT)的发病机理尚不完全清楚，近年来，由于检测手段的进展和对PHT的研究日益加深，陆续发现一些液递物质与PHT的发病密切相关，本研究通过测定PHT形成过程中外周血肿瘤坏死因子α(TNF-α) 水平的变化，探讨其在PHT形成过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性新西兰大白兔16只，体重2.5～3.0kg，随机分成PHT组、对照组，每组8只。
1.2 主要试剂
TNF-α标准品(美国Sigma公司)，3-(4.5-二甲基噻唑-2-yl)2，5-二酚四唑溴蓝(MTT，法国Fluka公司)，放线菌素D(AMD，上海公司)、二甲基亚砜(DMSO，上海公司)、硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME，美国Sigma公司)。
, http://www.100md.com
1.3 主要仪器
多导生理记录仪(日本Nihon Kohden株式会社)，MFV-2100电磁血流量计(日本Nihon Kohden株式会社)，721型分光光度计(上海第二分析仪器厂)，酶联仪(德国Bio-Rad公司)，Heraeus CO2孵箱(德国公司)。
1.4 PHT模型制备
采用门静脉缩窄法(PVL)，经腹正中切口进腹，近肝门处游离门静脉，用18号钝性针头(美国公司生产)，平行放置于门静脉主干上，3-0丝线横扎1道，拔去针头，缝合腹部切口。对照组行单纯开腹手术，然后关腹。
1.5 血流动力学测定
术后3周，于静脉滴注一氧化氮合成抑制剂L-NAME(30ug/kg/min)前及1h后进行血流动力学测定：3%戊巴比妥(25mg/kg)静脉缓慢注射麻醉，切开腹股沟皮肤、皮下，游离出股动脉、股静脉，股静脉插管静脉滴注生理盐水60～80ml/h，股动脉插管至腹主动脉，经压力转换器与多导生理记录仪相连，测定平均动脉压(MAP)。经原切口进腹，游离门静脉，用电磁血流量计测定门静脉血流量(PVF)；经肠系膜小静脉插管至门静脉，以脊柱前缘为O点水平，将导管经压力转换器与多导生理记录仪相连，测定自由门静脉压(FPP)、脏侧闭塞门静脉压(SOPP)。门体分流率(PSS)通过以下公式计算得出：Qpv/Q=1-[(Ppv/Ppvs-Ppv/Pa)/(1-Ppv/Pa)][1]。计算结果为向肝门静脉灌注率，1-Qpv/Q则为肝外门体分流率。
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1.6 血液样本采集
分别采集PHT组术后1，3，7d，3周时及对照组外周动脉血样本3ml, 分离血清贮存待测。
1.7 血清TNF-α测定
传代细胞株L929，以含10%NBS的PR 1640调制成4×105ml细胞悬液，置于96孔细胞培 养板，50μl/孔；加入AMD 1μg/孔及血清样品5μl/孔； 每份样品均作2孔于37℃，5% CO2培养24h, 500rpm离心10min，去上清，再加入DMSO 100μl/ 孔，于570nm处比色，测出OD570。将2000pg/ml的TNF-α标准品倍比稀释后，按上述步骤分别测定其OD570，绘制出标准曲线，即可计算出血标本TNF-α水平。
1.8 统计学处理
, 百拇医药
数据以均数±标准差表示(X±s);采用student's t检验。
2 结 果
2.1 血流动力学变化
PHT组FPP，PVF，PSS均显著高于对照组(P<0.01)，而MAP，SOPP，Qpv明显低于对照组(P<0.01)(表1)。静脉滴注L-NAME后，PHT组PVF明显降低，MAP明显升高，而FPP无明显变化；对照组除MAP明显升高外，PVF，FPP均无明显变化(表2)。
表1 PHT组与对照组血流动力学指标比较(X±s)
组别
FPP(cmH2O)
SOPP(cmH2O)
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PVF(ml/min)
Qpv(ml/min)
PSS(%)
MAP(cmH2O)
PHT组
20.39±1.22
24.88±1.73
170.93±2.17
41.90±9.26
75.51±5.315)
78.62±2.65
, 百拇医药
对照组
7.75±0.92
40.48±3.06
131.63±2.80
116.34±4.01
11.62±1.88
90.24±4.18
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
, 百拇医药
<0.01
<0.01
表2 L-NAME用药前后各指标的变化(X±s)
组别
用 药 前
用 药 后
PVF(ml/min)
FPP(cmH2O)
MAP(cmH2O)
PVF(ml/min)
FPP(cmH2O)
, 百拇医药
MAP(cmH2O)
PHT组
170.93±2.17
20.39±1.22
78.62±2.65
158.22±2.821)
20.09±1.222)
100.23±3.473)
对照组
131.63±2.80
, http://www.100md.com 7.75±0.92
90.24±4.18
130.40±4.284)
7.55±1.335)
107.17±6.736)
注：与用药前比1)，3)，6) P<0.01；2)，4)，5) P>0.05
2.2 外周血TNF-α水平
PHT组PVL术后1，3，7d以及3周的外周血TNF-α水平均显著高于对照组(P<0.01)(表3)。
表3 不同时期外周血TNF-α水平(pg/ml)的比较(X±s)
, http://www.100md.com
项目
对照组
PVL后
1d
3d
7d
21d
TNF-α
301.90±31.70
1304.84±371.72
1566.80±305.80
1390.18±261.92
, 百拇医药
1327.11±232.51
注：与对照组比P<0.01
3 讨 论
近年来的研究表明，液递物质在PHT发病机制中起着重要作用。由于肝功能损害和侧支循环的开放，使血液中有血管活性作用的物质浓度升高，这些物质又再作用于肝内外血管，使内脏血管的阻力和流量发生变化，从而造成内脏和全身血流动力学紊乱。
TNF-α是一种分子量为17000的细胞毒性蛋白质，由细菌内毒素、组织损伤及肿瘤细胞等刺激单核巨噬细胞而产生。本实验结果显示，PHT组外周血TNF-α水平显著升高，表明TNF-α对PHT兔血流动力学改变可能起重要作用。TNF-α升高的形成机制目前尚不清楚，PVL后早期可能与手术创伤刺激、门静脉向肝血流灌注量降低，致使肝脏灭活作用下降有关。而PVL后期由于广泛门体侧支循环引起门体分流，使来自门静脉肠区、胃脾区的内毒素未经肝脏解毒直接进入体循环，门静脉向肝血流的减少亦可影响肝脏对内毒素的灭活作用，导致血中内毒素水平的升高。内毒素是刺激TNF-α产生的作用最强的物质，血中高浓度的内毒素必然会刺激单核巨噬细胞产生和分泌大量的TNF-α。
, 百拇医药
本实验结果显示，L-NAME能显者降低PHT组门静脉血流量，减轻内脏高动力循环状态。而大量研究证明，TNF-α在体内和体外均可以刺激NO的合成和释放[2～4]，说明TNF-α在血流动力学方面的作用是由NO介导的。应用L-NAMA后，PHT组的PVF虽有降低，但仍显著高于对照组，表明TNF-α的作用除通过NO介导外，可能还有其它途径，PHT的血流动力学紊乱除与TNF-α，NO有关外，可能还有其它血管活性物质的参与。尽管L-NAME能显著降低门静脉血流量，但它不能降低门静脉压力，其原因可能是它不仅能增加全身及内脏血管的阻力，而且能引起门体侧支血管的收缩，导致其阻力的增高[5]。总之，关于TNF-α在PHT中的作用机制目前尚不完全清楚，进一步研究TNF-α在PHT中的作用将为PHT药物治疗提供新的思路。
作者简介：周松(1971-)，男，上海青浦人，解放军第一
七五医院主治医师，硕士，从事门静脉高压症方面研究。
, 百拇医药
作者单位：周松(解放军第一七五医院普外科，福建漳州363000)
徐学俊(第二军医大学长征医院普外科， 上海200003)
郑硕云(解放军第一七五医院普外科，福建漳州363000)
杨爱国(解放军第一七五医院普外科，福建漳州363000)
参考文献：
[1]刘建华，孟宪民，张德恒.术中观测肝外门体分流率[J].中华外科杂志，1991，29(12)：784～786
[2]Kibourm RG, Gross SS, Jubran A, et al. NG-methyl-L-arginine inhibits tumor necrosis factor induced hypotension: implications for the involement of nitric oxide[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87(8):3629～3632
, 百拇医药
[3]Shibano T, Vanhoutte PM. Induction of NO production by TNF-α and lipopolysaccharide in porcine coronary arteries without endothelium[J]. Am J Physiol, 1993,264(6):H403～H407
[4]Markewitz BA, Michael JR, Kohan DE, et al. Cytokine-induced expression of a nitric oxide synthase in rat renal tubule cells[J]. Clin Invest, 1993,91(5):2138～2141
[5]García-Pagán JC, Fernandez M, Bernadich C, et al. Effects of continued NO inhibition on portal hypertensive syndrome after portal vein stenosis in rat[J]. Am J Physiol, 1994,267(6pt 1):G984～G990, http://www.100md.com
摘 要：目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)在门静脉高压症(PHT)形成过程中的作用。方法 本实验通过门静脉缩窄法制备兔PHT模型，采用MTT法测定对照组、PHT组门静脉缩窄后1，3，7d以及3周时的外周血TNF-α水平，并应用电磁血流量计和多导生理记录仪测定其门静脉血流动力学的变化以及一氧化氮(NO)合成抑制剂对PHT血流动力学的影响。结果 PHT组自由门静脉压(FPP)、门静脉血流量(PVF)、门体分流率(PSSRP)以及外周血TNF-α水平显著升高(P<0.01)；而平均动脉压(MAP)、向肝门静脉血流量(Qpv)、脏侧闭塞门静脉压(SOPP)明显下降(P<0.01)。应用NO合成抑制剂后PHT组PVF明显降低(P<0.01)，MAP明显升高(P<0.01)，而FPP无明显变化(P>0.05)；对照组除MAP明显升高(P<0.01)外，PVF，FPP均无明显变化(P>0.05)。结论 TNF-α对PHT血流动力学改变可能起重要作用，NO是介导此过程的主要介质。
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关键词：高血压，门静脉/病理生理学 肿瘤坏死因子 疾病模型，动物 门静脉/病理生理学 一氧化氮
门静脉高压症(PHT)的发病机理尚不完全清楚，近年来，由于检测手段的进展和对PHT的研究日益加深，陆续发现一些液递物质与PHT的发病密切相关，本研究通过测定PHT形成过程中外周血肿瘤坏死因子α(TNF-α) 水平的变化，探讨其在PHT形成过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性新西兰大白兔16只，体重2.5～3.0kg，随机分成PHT组、对照组，每组8只。
1.2 主要试剂
TNF-α标准品(美国Sigma公司)，3-(4.5-二甲基噻唑-2-yl)2，5-二酚四唑溴蓝(MTT，法国Fluka公司)，放线菌素D(AMD，上海公司)、二甲基亚砜(DMSO，上海公司)、硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME，美国Sigma公司)。
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1.3 主要仪器
多导生理记录仪(日本Nihon Kohden株式会社)，MFV-2100电磁血流量计(日本Nihon Kohden株式会社)，721型分光光度计(上海第二分析仪器厂)，酶联仪(德国Bio-Rad公司)，Heraeus CO2孵箱(德国公司)。
1.4 PHT模型制备
采用门静脉缩窄法(PVL)，经腹正中切口进腹，近肝门处游离门静脉，用18号钝性针头(美国公司生产)，平行放置于门静脉主干上，3-0丝线横扎1道，拔去针头，缝合腹部切口。对照组行单纯开腹手术，然后关腹。
1.5 血流动力学测定
术后3周，于静脉滴注一氧化氮合成抑制剂L-NAME(30ug/kg/min)前及1h后进行血流动力学测定：3%戊巴比妥(25mg/kg)静脉缓慢注射麻醉，切开腹股沟皮肤、皮下，游离出股动脉、股静脉，股静脉插管静脉滴注生理盐水60～80ml/h，股动脉插管至腹主动脉，经压力转换器与多导生理记录仪相连，测定平均动脉压(MAP)。经原切口进腹，游离门静脉，用电磁血流量计测定门静脉血流量(PVF)；经肠系膜小静脉插管至门静脉，以脊柱前缘为O点水平，将导管经压力转换器与多导生理记录仪相连，测定自由门静脉压(FPP)、脏侧闭塞门静脉压(SOPP)。门体分流率(PSS)通过以下公式计算得出：Qpv/Q=1-[(Ppv/Ppvs-Ppv/Pa)/(1-Ppv/Pa)][1]。计算结果为向肝门静脉灌注率，1-Qpv/Q则为肝外门体分流率。
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1.6 血液样本采集
分别采集PHT组术后1，3，7d，3周时及对照组外周动脉血样本3ml, 分离血清贮存待测。
1.7 血清TNF-α测定
传代细胞株L929，以含10%NBS的PR 1640调制成4×105ml细胞悬液，置于96孔细胞培 养板，50μl/孔；加入AMD 1μg/孔及血清样品5μl/孔； 每份样品均作2孔于37℃，5% CO2培养24h, 500rpm离心10min，去上清，再加入DMSO 100μl/ 孔，于570nm处比色，测出OD570。将2000pg/ml的TNF-α标准品倍比稀释后，按上述步骤分别测定其OD570，绘制出标准曲线，即可计算出血标本TNF-α水平。
1.8 统计学处理
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数据以均数±标准差表示(X±s);采用student's t检验。
2 结 果
2.1 血流动力学变化
PHT组FPP，PVF，PSS均显著高于对照组(P<0.01)，而MAP，SOPP，Qpv明显低于对照组(P<0.01)(表1)。静脉滴注L-NAME后，PHT组PVF明显降低，MAP明显升高，而FPP无明显变化；对照组除MAP明显升高外，PVF，FPP均无明显变化(表2)。
表1 PHT组与对照组血流动力学指标比较(X±s)
组别
FPP(cmH2O)
SOPP(cmH2O)
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PVF(ml/min)
Qpv(ml/min)
PSS(%)
MAP(cmH2O)
PHT组
20.39±1.22
24.88±1.73
170.93±2.17
41.90±9.26
75.51±5.315)
78.62±2.65
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对照组
7.75±0.92
40.48±3.06
131.63±2.80
116.34±4.01
11.62±1.88
90.24±4.18
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
, 百拇医药
<0.01
<0.01
表2 L-NAME用药前后各指标的变化(X±s)
组别
用 药 前
用 药 后
PVF(ml/min)
FPP(cmH2O)
MAP(cmH2O)
PVF(ml/min)
FPP(cmH2O)
, 百拇医药
MAP(cmH2O)
PHT组
170.93±2.17
20.39±1.22
78.62±2.65
158.22±2.821)
20.09±1.222)
100.23±3.473)
对照组
131.63±2.80
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90.24±4.18
130.40±4.284)
7.55±1.335)
107.17±6.736)
注：与用药前比1)，3)，6) P<0.01；2)，4)，5) P>0.05
2.2 外周血TNF-α水平
PHT组PVL术后1，3，7d以及3周的外周血TNF-α水平均显著高于对照组(P<0.01)(表3)。
表3 不同时期外周血TNF-α水平(pg/ml)的比较(X±s)
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项目
对照组
PVL后
1d
3d
7d
21d
TNF-α
301.90±31.70
1304.84±371.72
1566.80±305.80
1390.18±261.92
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1327.11±232.51
注：与对照组比P<0.01
3 讨 论
近年来的研究表明，液递物质在PHT发病机制中起着重要作用。由于肝功能损害和侧支循环的开放，使血液中有血管活性作用的物质浓度升高，这些物质又再作用于肝内外血管，使内脏血管的阻力和流量发生变化，从而造成内脏和全身血流动力学紊乱。
TNF-α是一种分子量为17000的细胞毒性蛋白质，由细菌内毒素、组织损伤及肿瘤细胞等刺激单核巨噬细胞而产生。本实验结果显示，PHT组外周血TNF-α水平显著升高，表明TNF-α对PHT兔血流动力学改变可能起重要作用。TNF-α升高的形成机制目前尚不清楚，PVL后早期可能与手术创伤刺激、门静脉向肝血流灌注量降低，致使肝脏灭活作用下降有关。而PVL后期由于广泛门体侧支循环引起门体分流，使来自门静脉肠区、胃脾区的内毒素未经肝脏解毒直接进入体循环，门静脉向肝血流的减少亦可影响肝脏对内毒素的灭活作用，导致血中内毒素水平的升高。内毒素是刺激TNF-α产生的作用最强的物质，血中高浓度的内毒素必然会刺激单核巨噬细胞产生和分泌大量的TNF-α。
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本实验结果显示，L-NAME能显者降低PHT组门静脉血流量，减轻内脏高动力循环状态。而大量研究证明，TNF-α在体内和体外均可以刺激NO的合成和释放[2～4]，说明TNF-α在血流动力学方面的作用是由NO介导的。应用L-NAMA后，PHT组的PVF虽有降低，但仍显著高于对照组，表明TNF-α的作用除通过NO介导外，可能还有其它途径，PHT的血流动力学紊乱除与TNF-α，NO有关外，可能还有其它血管活性物质的参与。尽管L-NAME能显著降低门静脉血流量，但它不能降低门静脉压力，其原因可能是它不仅能增加全身及内脏血管的阻力，而且能引起门体侧支血管的收缩，导致其阻力的增高[5]。总之，关于TNF-α在PHT中的作用机制目前尚不完全清楚，进一步研究TNF-α在PHT中的作用将为PHT药物治疗提供新的思路。
作者简介：周松(1971-)，男，上海青浦人，解放军第一
七五医院主治医师，硕士，从事门静脉高压症方面研究。
, 百拇医药
作者单位：周松(解放军第一七五医院普外科，福建漳州363000)
徐学俊(第二军医大学长征医院普外科， 上海200003)
郑硕云(解放军第一七五医院普外科，福建漳州363000)
杨爱国(解放军第一七五医院普外科，福建漳州363000)
参考文献：
[1]刘建华，孟宪民，张德恒.术中观测肝外门体分流率[J].中华外科杂志，1991，29(12)：784～786
[2]Kibourm RG, Gross SS, Jubran A, et al. NG-methyl-L-arginine inhibits tumor necrosis factor induced hypotension: implications for the involement of nitric oxide[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87(8):3629～3632
, 百拇医药
[3]Shibano T, Vanhoutte PM. Induction of NO production by TNF-α and lipopolysaccharide in porcine coronary arteries without endothelium[J]. Am J Physiol, 1993,264(6):H403～H407
[4]Markewitz BA, Michael JR, Kohan DE, et al. Cytokine-induced expression of a nitric oxide synthase in rat renal tubule cells[J]. Clin Invest, 1993,91(5):2138～2141
[5]García-Pagán JC, Fernandez M, Bernadich C, et al. Effects of continued NO inhibition on portal hypertensive syndrome after portal vein stenosis in rat[J]. Am J Physiol, 1994,267(6pt 1):G984～G990, http://www.100md.com