骨髓增生异常综合征患者骨髓细胞凋亡的研究
齐君原 郝玉书 宋玉华 邵宗鸿 陈桂彬 张益枝 钱林生
关键词：骨髓增生异常综合征 造血干细胞 肿瘤坏死因子α 细胞凋亡
骨髓增生异常综合征(MDS)是一种克隆性造血干细胞疾患，骨髓存在无效造血，其原因可能是造血细胞过度凋亡。近年来，有关MDS骨髓细胞凋亡水平的检测已有报道 ，但结果不一；关于肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱发造血细胞凋亡的研究也有少数报告；而凋亡调控蛋白bcl-2及bax在MDS造血细胞凋亡中的意义尚未见报道。我们检测了29例MDS 患者骨髓细胞的凋亡率和bcl-2、bax基因的表达，并对部分患者血清TNF-α水平及患者血清在体外培养中对正常骨髓细胞凋亡的影响进行了测定。
病例和方法
1 病例 29例MDS、2例MDS后急性髓系白血病(post-MDS AML)及7例原发急性髓系白血病(de novo AML)均系我院1997年11月至1998年12 月门诊或住院患者，诊断依照FAB标准。MDS患者中，9例为难治性贫血(RA)，1例为环形铁粒幼细胞增多的RA(RAS)，12例为RA伴原始细胞增多(RAEB)，6例为转化中的RAEB(RAEB-t)和1例慢性粒-单核细胞白血病(CMML)。男性22例，女性7例。中位年龄45岁(9～77岁)。5份对照血清取自正常人。正常骨髓取自接受胸外科手术的非血液系统疾病患者的肋骨。
, 百拇医药
2 骨髓单个核细胞(BMMNC)悬液制备 淋巴细胞分离液分离BMMNC，制备离心涂片。常规留取外周血血清，于-80℃保存。
3 bax和bcl-2蛋白检测 采用ABC免疫酶标法。阳性程度分为(+)～(++++)四级，每一“+”号记10分。计数200个细胞，计算阳性细胞总积分及平均单个细胞积分，并计算bax/bcl-2积分比。
4 凋亡细胞检测
4.1 TdT介导dUTP缺口末端标记(TUNEL)法：试剂盒为宝灵曼公司产品,操作按说明进行。在荧光显微镜下计数凋亡细胞，然后转换到普通光下计数同一视野中的所有细胞。共计数200个细胞，计算凋亡细胞所占百分率。
4.2 流式细胞仪(FACS)分析:常规碘化吡啶染色后，FACS分析。
5 血清TNF-α浓度测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA) 测定。试剂盒购自中国军事医学科学院基础医学研究所,操作按其说明。
, 百拇医药
6 培养 4份正常血清和12份MDS患者血清分别与由同一正常肋骨制备的BMMNC在24孔板上培养。培养体系1ml，含RPMI 1640培养液0.85ml，患者血清0.05ml或0.10ml，胎牛血清0.10ml或0.05ml。在37℃，体积分数为5%的CO2条件下培养24h后，收集细胞。PBS (pH 7.4)洗涤2次，以体积分数为70%的冰乙醇固定，用于FACS检测。以含体积分数为10%的研究对象血清培养液培养的细胞在固定前取少许离心制备涂片，用于TUNEL法检测凋亡细胞。
7 统计学方法 检测结果以X±s表示，独立样本及配对样本均数间比较用t检验。计算相关系数。使用软件包SSPS 8.0对结果进行统计处理。
结 果
1 MDS各亚型bax/bcl-2积分比和TUNEL阳性率 结果见表1,2。MDS各亚型间、低危与高危MDS间平均bax/bcl-2积分比及平均TUNEL阳性率差异均无显著性(P均>0.05)。
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表1 MDS各亚型bax/bcl-2积分比与TUNEL阳性率(X±s)
组别
例数
bax/bcl-2 积分比
TUNEL阳性率
(%)
RA
9
2.31±1.53
9.09±10.69
RAEB
12
, 百拇医药
9.21±12.79
14.47±12.10
RAEB-t
6
3.08±1.67
5.25±2.09
2 MDS、post-MDS AML、de novo AML的bax/bcl-2积分比和TUNEL阳性率 结果见表2。post-MDS AML与低危、高危MDS相比，bax/bcl-2积分比和TUNEL阳性率的差异均无显著性(P>0.05)；与正常对照、de novo AML组相比，差异均有显著性(P<0.01)。MDS与正常对照、 de novo AML相比，bax/bcl-2积分比的差异均无显著性(P>0.05)，TUNEL阳性率的差异均有显著性(P<0.01)。TUNEL阳性率与bax/bcl-2积分比之间呈正相关(r=0.60，P<0.01)。 表2 各组bax/bcl-2积分比与TUNEL阳性率(X±s)
, 百拇医药
组别
例数
bax/bcl-2
TUNEL
积分比
P值
阳性率(%)
P值
MDS组
29
5.74±8.74
12.21±12.24
低危组
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10
3.28±2.63
10.33±10.82
高危组
19
6.69±10.06
13.20±13.09
post-MDS AML组
2
6.68±2.30
>0.05
9.40±4.24
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>0.05
de novo AML组
7
0.24±0.15
>0.05
0.99±0.65
<0.05
正常对照组
5
0.83±0.28
>0.05
0.58±0.43
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<0.05
注:表中P值为post-MDS AML、正常对照和de novo AML与MDS比较的结果
3 MDS患者与正常对照血清TNF-α浓度 5份正常对照血清的TNF-α浓度为74.62～107.15ng/L，14例MDS患者为93.33～281.84ng/L；两组均值间差异有显著性(P<0.01)。RA、RAEB和RAEB-t的平均血清TNF-α浓度有逐渐升高的趋势，但仅RA与RAEB-t间的差异有显著性(P<0.01)(表3)。
4 血清TNF-α水平与骨髓细胞凋亡的关系 血清TNF-α浓度与研究对象自身骨髓细胞TUNEL阳性率间呈正相关(r=0.46，P<0.05)。
5 MDS患者血清对正常BMMNC的影响 结果见表3。正常BMMNC在有体积分数为5%或10%的MDS患者血清的培养基中培养24h后的凋亡率，显著高于在正常对照血清培养中的凋亡率(P<0.01)。配对t检验结果表明，正常BMMNC在体积分数为10%的MDS患者或正常对照血清中培养后的凋亡率，高于在体积分数为5%的患者血清培养中的凋亡率(P<0.01)。RA、RAEB、RAEB-t患者血清诱导正常BMMNC的凋亡率同TNF-α一样，有升高趋势，但差异无显著性(P>0.05)。正常BMMNC在体积分数为5%和10%的MDS患者或正常对照血清的培养基中培养后的凋亡率(FACS检测)与TNF-α浓度呈正相关(r均=0.64，P均<0.01)；在体积分数为10%的MDS患者血清中培养后正常BMMNC的TUNEL阳性率与TNF-α浓度之间亦呈正相关(r=0.83，P<0.01)。
, 百拇医药
表3 TNF-α血清浓度及正常骨髓细胞经MDS患者血清培养后的细胞凋亡率(X±s)
组别
例数
TNF-α(ng/L)
FACS检测凋亡率(%)
TUNEL阳性率(%)
(10%患者血清)
5%患者血清
10%患者血清
MDS组
14
, 百拇医药 176.97±56.38
8.27±4.37
13.74±5.16
14.29±5.20
RA
5
124.54±26.61
7.29±5.32
14.77±4.63
10.63±3.19
RAEB
5
, 百拇医药
172.01±54.23
5.23±2.95
10.63±5.62
13.67±2.04
RAEB-t
4
226.41±41.58
11.49±3.70
15.50±5.66
17.18±7.86
正常对照
5
, 百拇医药
83.56±13.42
1.01±0.77
5.27±2.15
4.67±1.56
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：表中P值均为MDS患者与正常对照比较的结果
讨 论
我们发现，MDS患者骨髓细胞凋亡水平较正常对照及de novo AML高。MDS各亚型间、低危与高危MDS间骨髓细胞凋亡率无明显区别。文献中报道的有关结果极不一致，Raza等[1,2]发现低危MDS患者骨髓细胞凋亡率较低， 各亚型中以RAEB-t的凋亡率最高；但也有报道低危MDS患者骨髓细胞凋亡水平高于高危MDS[3,4];Bouscary等[5]则发现细胞凋亡水平最高的是RA和RAEB，而RAEB-t骨髓细胞凋亡率正常或偏低，与post-MDS AML相同。
, 百拇医药
本研究结果表明，post-MDS AML与de novo AML患者相比，骨髓细胞凋亡水平有明显差异，前者与MDS相似，而后者与正常骨髓接近，凋亡率极低。MDS向post-MDS AML转化过程中，以及转为post-MDS AML后，骨髓细胞凋亡水平无明显变化。Yoshida等[6]以及我们曾推断，MDS向post-MDS AML进展过程中伴随凋亡过度到凋亡障碍的改变。但我们的结果未证实之。这可能有两种解释：① MDS、post-MDS AML与de novo AML是非同质的，两者在细胞增殖动力学上有所不同，凋亡就是反映这种不同的一个重要侧面；② MDS、post-MDS AML与de novo AML是同质的，其区别仅在于原始细胞在骨髓细胞中的比值。细胞增殖动力学参数的差别及细胞凋亡水平的高低，取决于原始细胞的比值。对这些疾患细胞增殖和凋亡的研究，是基于所有骨髓细胞，或依据细胞表面抗原筛选的某些亚群，而非MDS或AML克隆细胞。一般来说，MDS和post-MDS AML骨髓中原始细胞比率偏低，而de novo AML的较高，对研究结果会产生一定影响。
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我们还发现，MDS患者骨髓细胞凋亡过度与bax和bcl-2比例的失衡有关。bax诱导细胞色素C从线粒体释放，利于caspases通过裂解方式的激活过程，从而促进细胞凋亡；bcl-2的作用相反。细胞内bax与bcl-2的分子数相当时，两者形成异二聚体，均不能发挥各自的作用,当bax较多时，自身形成同二聚体，则利于凋亡信号触发细胞凋亡,反之，则抑制凋亡[7]。我们的检测结果表明，bax/bcl-2比值的高低与凋亡水平具有明显的相关性。MDS及post-MDS AML的凋亡率高，bax/bcl-2比值远大于1；而正常对照和de novo AML的凋亡水平低，其bax/bcl-2比值接近1或远小于1(表2)。
TNF-α可能是MDS骨髓细胞过度凋亡的一个诱因。MDS患者血清TNF-α升高。正常BMMNC同MDS患者血清培养后的细胞凋亡率，明显高于同正常对照血清培养后的细胞凋亡率；而且体积分数为10%的血清较体积分数为5%的血清影响大。不仅如此，血清TNF-α浓度与正常BMMNC培养后的凋亡率，以及与MDS患者BMMNC的凋亡率均呈正相关,这与Raza等[8]的结果一致。他们用免疫组织化学和原位缺口翻译标记法检测MDS患者骨髓活检标本中TNF-α水平及细胞凋亡率，发现TNF-α特异性地分布在凋亡细胞周围，且两者具有明显的相关性。
, 百拇医药
作者单位:齐君原(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
郝玉书(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
宋玉华(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
邵宗鸿(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
陈桂彬(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
张益枝(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
钱林生(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
, 百拇医药
参考文献
1，Raza A,Gezer S,Mundle S,et al.Apoptosis in bone marrow biopsy samples involving stromal and haemopoietic cells in 50 patients with myelodysplastic syndromes.Blood,1995,86:268-276.
2，Raza A,Mundle S,Iftikhar A,et al.Simultaneous assessment of cell kinetics and programmed cell death in bone marrow biopsies of myelodysplasia reveals extensive apoptosis as the probable basis for ineffective hematopoiesis.Am J Hematol,1995,48:143-154.
, 百拇医药
3，Bogdanovic AD,Trpinac DP,Jankovic GM,et al.Incidence and role of apoptosis in myelodysplastic syndrome: morphological and ultrastructural assessment. Leukemia,1997,11:656-659.
4，Rajapaksa R,Ginzton N,Rott LS,et al.Altered oncoprotein expression and apoptosis in myelodysplastic syndrome marrow cells.Blood,1996,88:4275-4287.
5，Bouscary D,de Vos J,Guesnu M,et al.Fas/Apo (CD95) expression and apoptosis in patients with myelodysplastic syndromes.Leukemia,1997,11:839-845.
, 百拇医药
6，Yoshida Y,Anzai N,Kawabata H.Apoptosis in myelodysplasia:a paradox or paradigm.Leuk Res,1995,19:887-891.
7，Adams JM,Cory S.The bcl-2 protein family: arbiters of cell survival.Science,1998,281:1322-1325.
8，Raza A,Mundle S,Shetty V,et al.Novel insights into the biology of myelodysplastic syndromes:excessive apoptosis and the role of cytokines.Intern J Hematol,1996,63:265-278., 百拇医药
关键词：骨髓增生异常综合征 造血干细胞 肿瘤坏死因子α 细胞凋亡
骨髓增生异常综合征(MDS)是一种克隆性造血干细胞疾患，骨髓存在无效造血，其原因可能是造血细胞过度凋亡。近年来，有关MDS骨髓细胞凋亡水平的检测已有报道 ，但结果不一；关于肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱发造血细胞凋亡的研究也有少数报告；而凋亡调控蛋白bcl-2及bax在MDS造血细胞凋亡中的意义尚未见报道。我们检测了29例MDS 患者骨髓细胞的凋亡率和bcl-2、bax基因的表达，并对部分患者血清TNF-α水平及患者血清在体外培养中对正常骨髓细胞凋亡的影响进行了测定。
病例和方法
1 病例 29例MDS、2例MDS后急性髓系白血病(post-MDS AML)及7例原发急性髓系白血病(de novo AML)均系我院1997年11月至1998年12 月门诊或住院患者，诊断依照FAB标准。MDS患者中，9例为难治性贫血(RA)，1例为环形铁粒幼细胞增多的RA(RAS)，12例为RA伴原始细胞增多(RAEB)，6例为转化中的RAEB(RAEB-t)和1例慢性粒-单核细胞白血病(CMML)。男性22例，女性7例。中位年龄45岁(9～77岁)。5份对照血清取自正常人。正常骨髓取自接受胸外科手术的非血液系统疾病患者的肋骨。
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2 骨髓单个核细胞(BMMNC)悬液制备 淋巴细胞分离液分离BMMNC，制备离心涂片。常规留取外周血血清，于-80℃保存。
3 bax和bcl-2蛋白检测 采用ABC免疫酶标法。阳性程度分为(+)～(++++)四级，每一“+”号记10分。计数200个细胞，计算阳性细胞总积分及平均单个细胞积分，并计算bax/bcl-2积分比。
4 凋亡细胞检测
4.1 TdT介导dUTP缺口末端标记(TUNEL)法：试剂盒为宝灵曼公司产品,操作按说明进行。在荧光显微镜下计数凋亡细胞，然后转换到普通光下计数同一视野中的所有细胞。共计数200个细胞，计算凋亡细胞所占百分率。
4.2 流式细胞仪(FACS)分析:常规碘化吡啶染色后，FACS分析。
5 血清TNF-α浓度测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA) 测定。试剂盒购自中国军事医学科学院基础医学研究所,操作按其说明。
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6 培养 4份正常血清和12份MDS患者血清分别与由同一正常肋骨制备的BMMNC在24孔板上培养。培养体系1ml，含RPMI 1640培养液0.85ml，患者血清0.05ml或0.10ml，胎牛血清0.10ml或0.05ml。在37℃，体积分数为5%的CO2条件下培养24h后，收集细胞。PBS (pH 7.4)洗涤2次，以体积分数为70%的冰乙醇固定，用于FACS检测。以含体积分数为10%的研究对象血清培养液培养的细胞在固定前取少许离心制备涂片，用于TUNEL法检测凋亡细胞。
7 统计学方法 检测结果以X±s表示，独立样本及配对样本均数间比较用t检验。计算相关系数。使用软件包SSPS 8.0对结果进行统计处理。
结 果
1 MDS各亚型bax/bcl-2积分比和TUNEL阳性率 结果见表1,2。MDS各亚型间、低危与高危MDS间平均bax/bcl-2积分比及平均TUNEL阳性率差异均无显著性(P均>0.05)。
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表1 MDS各亚型bax/bcl-2积分比与TUNEL阳性率(X±s)
组别
例数
bax/bcl-2 积分比
TUNEL阳性率
(%)
RA
9
2.31±1.53
9.09±10.69
RAEB
12
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9.21±12.79
14.47±12.10
RAEB-t
6
3.08±1.67
5.25±2.09
2 MDS、post-MDS AML、de novo AML的bax/bcl-2积分比和TUNEL阳性率 结果见表2。post-MDS AML与低危、高危MDS相比，bax/bcl-2积分比和TUNEL阳性率的差异均无显著性(P>0.05)；与正常对照、de novo AML组相比，差异均有显著性(P<0.01)。MDS与正常对照、 de novo AML相比，bax/bcl-2积分比的差异均无显著性(P>0.05)，TUNEL阳性率的差异均有显著性(P<0.01)。TUNEL阳性率与bax/bcl-2积分比之间呈正相关(r=0.60，P<0.01)。 表2 各组bax/bcl-2积分比与TUNEL阳性率(X±s)
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组别
例数
bax/bcl-2
TUNEL
积分比
P值
阳性率(%)
P值
MDS组
29
5.74±8.74
12.21±12.24
低危组
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10
3.28±2.63
10.33±10.82
高危组
19
6.69±10.06
13.20±13.09
post-MDS AML组
2
6.68±2.30
>0.05
9.40±4.24
, http://www.100md.com
>0.05
de novo AML组
7
0.24±0.15
>0.05
0.99±0.65
<0.05
正常对照组
5
0.83±0.28
>0.05
0.58±0.43
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<0.05
注:表中P值为post-MDS AML、正常对照和de novo AML与MDS比较的结果
3 MDS患者与正常对照血清TNF-α浓度 5份正常对照血清的TNF-α浓度为74.62～107.15ng/L，14例MDS患者为93.33～281.84ng/L；两组均值间差异有显著性(P<0.01)。RA、RAEB和RAEB-t的平均血清TNF-α浓度有逐渐升高的趋势，但仅RA与RAEB-t间的差异有显著性(P<0.01)(表3)。
4 血清TNF-α水平与骨髓细胞凋亡的关系 血清TNF-α浓度与研究对象自身骨髓细胞TUNEL阳性率间呈正相关(r=0.46，P<0.05)。
5 MDS患者血清对正常BMMNC的影响 结果见表3。正常BMMNC在有体积分数为5%或10%的MDS患者血清的培养基中培养24h后的凋亡率，显著高于在正常对照血清培养中的凋亡率(P<0.01)。配对t检验结果表明，正常BMMNC在体积分数为10%的MDS患者或正常对照血清中培养后的凋亡率，高于在体积分数为5%的患者血清培养中的凋亡率(P<0.01)。RA、RAEB、RAEB-t患者血清诱导正常BMMNC的凋亡率同TNF-α一样，有升高趋势，但差异无显著性(P>0.05)。正常BMMNC在体积分数为5%和10%的MDS患者或正常对照血清的培养基中培养后的凋亡率(FACS检测)与TNF-α浓度呈正相关(r均=0.64，P均<0.01)；在体积分数为10%的MDS患者血清中培养后正常BMMNC的TUNEL阳性率与TNF-α浓度之间亦呈正相关(r=0.83，P<0.01)。
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表3 TNF-α血清浓度及正常骨髓细胞经MDS患者血清培养后的细胞凋亡率(X±s)
组别
例数
TNF-α(ng/L)
FACS检测凋亡率(%)
TUNEL阳性率(%)
(10%患者血清)
5%患者血清
10%患者血清
MDS组
14
, 百拇医药 176.97±56.38
8.27±4.37
13.74±5.16
14.29±5.20
RA
5
124.54±26.61
7.29±5.32
14.77±4.63
10.63±3.19
RAEB
5
, 百拇医药
172.01±54.23
5.23±2.95
10.63±5.62
13.67±2.04
RAEB-t
4
226.41±41.58
11.49±3.70
15.50±5.66
17.18±7.86
正常对照
5
, 百拇医药
83.56±13.42
1.01±0.77
5.27±2.15
4.67±1.56
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：表中P值均为MDS患者与正常对照比较的结果
讨 论
我们发现，MDS患者骨髓细胞凋亡水平较正常对照及de novo AML高。MDS各亚型间、低危与高危MDS间骨髓细胞凋亡率无明显区别。文献中报道的有关结果极不一致，Raza等[1,2]发现低危MDS患者骨髓细胞凋亡率较低， 各亚型中以RAEB-t的凋亡率最高；但也有报道低危MDS患者骨髓细胞凋亡水平高于高危MDS[3,4];Bouscary等[5]则发现细胞凋亡水平最高的是RA和RAEB，而RAEB-t骨髓细胞凋亡率正常或偏低，与post-MDS AML相同。
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本研究结果表明，post-MDS AML与de novo AML患者相比，骨髓细胞凋亡水平有明显差异，前者与MDS相似，而后者与正常骨髓接近，凋亡率极低。MDS向post-MDS AML转化过程中，以及转为post-MDS AML后，骨髓细胞凋亡水平无明显变化。Yoshida等[6]以及我们曾推断，MDS向post-MDS AML进展过程中伴随凋亡过度到凋亡障碍的改变。但我们的结果未证实之。这可能有两种解释：① MDS、post-MDS AML与de novo AML是非同质的，两者在细胞增殖动力学上有所不同，凋亡就是反映这种不同的一个重要侧面；② MDS、post-MDS AML与de novo AML是同质的，其区别仅在于原始细胞在骨髓细胞中的比值。细胞增殖动力学参数的差别及细胞凋亡水平的高低，取决于原始细胞的比值。对这些疾患细胞增殖和凋亡的研究，是基于所有骨髓细胞，或依据细胞表面抗原筛选的某些亚群，而非MDS或AML克隆细胞。一般来说，MDS和post-MDS AML骨髓中原始细胞比率偏低，而de novo AML的较高，对研究结果会产生一定影响。
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我们还发现，MDS患者骨髓细胞凋亡过度与bax和bcl-2比例的失衡有关。bax诱导细胞色素C从线粒体释放，利于caspases通过裂解方式的激活过程，从而促进细胞凋亡；bcl-2的作用相反。细胞内bax与bcl-2的分子数相当时，两者形成异二聚体，均不能发挥各自的作用,当bax较多时，自身形成同二聚体，则利于凋亡信号触发细胞凋亡,反之，则抑制凋亡[7]。我们的检测结果表明，bax/bcl-2比值的高低与凋亡水平具有明显的相关性。MDS及post-MDS AML的凋亡率高，bax/bcl-2比值远大于1；而正常对照和de novo AML的凋亡水平低，其bax/bcl-2比值接近1或远小于1(表2)。
TNF-α可能是MDS骨髓细胞过度凋亡的一个诱因。MDS患者血清TNF-α升高。正常BMMNC同MDS患者血清培养后的细胞凋亡率，明显高于同正常对照血清培养后的细胞凋亡率；而且体积分数为10%的血清较体积分数为5%的血清影响大。不仅如此，血清TNF-α浓度与正常BMMNC培养后的凋亡率，以及与MDS患者BMMNC的凋亡率均呈正相关,这与Raza等[8]的结果一致。他们用免疫组织化学和原位缺口翻译标记法检测MDS患者骨髓活检标本中TNF-α水平及细胞凋亡率，发现TNF-α特异性地分布在凋亡细胞周围，且两者具有明显的相关性。
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作者单位:齐君原(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
郝玉书(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
宋玉华(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
邵宗鸿(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
陈桂彬(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
张益枝(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
钱林生(300020 天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院)
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参考文献
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