不同方法移植胚胎脊髓促进成鼠损伤脊髓功能恢复的研究
张强 廖维宏 王正国 伍亚民 李应玉
摘 要 目的：研究提供血运的胚胎脊髓移植对成鼠损伤脊髓功能恢复的作用。方法：将成年Wistar大鼠作成脊髓半切洞损伤模型，应用单纯胚胎脊髓组织、胚胎脊髓+大网膜组织、胚胎脊髓+椎旁肌组织移植到半切洞损伤的脊髓中，手术后1、2、4、12周进行联合行为评分、感觉诱发电位(SEP)和运动诱发电位(MEP)检查，并与正常组及单纯损伤组比较。结果：联合行为评分，单纯移植组和胚胎脊髓+大网膜组织移植组优于单纯损伤组，SEP和MEP潜峰时的恢复，移植各组均优于单纯损伤组，以胚胎脊髓+大网膜组织移植组效果最好，单纯胚胎脊髓移植组优于胚胎脊髓+椎旁肌移植组。结论：提供血运的胚胎脊髓移植对成鼠损伤脊髓功能恢复有较好的促进作用。
关键词：脊髓损伤 脊髓内移植 胚胎脊髓 大网膜 椎旁肌
, http://www.100md.com
胚胎脊髓移植治疗脊髓损伤的实验研究已开展多年，但如何进一步促进胚胎脊髓移植后脊髓神经功能恢复尚无重大进展。本实验应用单纯胚胎脊髓移植、胚胎脊髓移植+大网膜、胚胎脊髓移植+椎旁肌的方法移植到成年大鼠脊髓半切洞中。然后应用联合行为评分(CBS)、运动诱发电位(MEP)和感觉诱发电位(SEP)检查脊髓功能恢复情况。结果表明，提供血运的胚胎脊髓移植能够促进大鼠损伤脊髓功能恢复。
1 材料与方法
1.1 动物分组
Wistar成年大鼠170只，体重180～250g，雌雄不拘。分为单纯脊髓半切洞损伤组(A组)、胚胎脊髓移植组(B组)、胚胎脊髓+大网膜移植组(C组)、胚胎脊髓+椎旁肌移植组(D组)，术后1、2、4、12周各时相点每组10只，正常对照组10只动物。
1.2 手术方法
, 百拇医药
用戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，腰背部脱毛，无菌条件下暴露脊髓腰膨大，用负压吸引的方法损毁并吸除左侧半脊髓，造成一约2×2×2mm大小的洞腔。胚胎脊髓供体为同种异体妊娠14d的大鼠。在麻醉和无菌条件下取出胎鼠，显微镜下仔细切取颈胸段胎鼠脊髓约2mm，尽可能将胚胎脊髓表面的软脊膜等结缔组织切除干净，然后用玻璃针头吸取移植物，注入预制的脊髓洞腔内，用9-0线缝合硬脊膜。大网膜+胚胎脊髓移植，取左上腹部纵切口，将胃左动脉支大网膜经皮下隧道转移到腰背部切口内，将大网膜末端覆盖在移植的胚胎脊髓上，然后用9-0线缝合硬脊膜，并将蒂与硬脊膜缝合固定，注意尽量保持大网膜血运。椎旁肌+胚胎脊髓移植，顺椎旁肌方向切取带蒂的椎旁肌，同样将椎旁肌末端覆盖在移植的胚胎脊髓上，用9-0线缝合硬脊膜，并将肌蒂与硬脊膜缝合固定。
1.3 联合行为评分(CBS)
应用Gale[1]联合行为评分法，评定大鼠脊髓损伤运动、感觉、反射以及肢体动作协调等方面的功能。最大值是100分表示神经功能100%的丧失，最小值0分，表示神经功能完全正常。
, 百拇医药
1.4 诱发电位检查
应用第三军医大学野战外科研究所研制的多功能神经诱发电位仪检查。动物麻醉后，选择移植同侧坐骨神经和对侧大脑皮层运动区分别进行电刺激，记录SEP和MEP波形曲线。刺激频率4Hz，波宽0.2ms，强度40～60mV。信号经前置放大器放大10万倍，计算机叠加300次。
2 结果
2.1 联合行为评分
正常组为0分，损伤即刻评分为92±6.26，术后1、2、4、12周评分见表1。
表1 各组联合行为评分 (X±S)
手术后时间(周)
1
, 百拇医药
2
4
12
A组
88±5.18
71±6.50
62±7.68
37±4.56
B组
50±3.12①
35±4.17①
27±2.89①
, http://www.100md.com
18±3.46②
C组
41±4.44①
30±6.82①
25±3.49①
15±8.23②
D组
61±3.24②
40±3.23②
32±4.56①
, http://www.100md.com
23±4.67②
注:与A组比较，t检验，①P<0.01 ②P<0.05
2.2 SEP与MEP检查结果
见表2。
表2 各组MEP和SEP潜峰时 (X±S) ( ms)
MEP
SEP
1周
2周
4周
12周
, 百拇医药 1周
2周
4周
12周
正常组
1.48±0.46
1.48±0.46
1.48±0.46
1.48±0.46
2.31±0.26
2.31±0.26
2.31±0.26
, http://www.100md.com 2.31±0.26
A组
5.45±0.82
5.12±0.74
4.26±0.62
4.50±0.65
4.90±1.54
4.63±1.57
4.43±1.65
3.81±1.62
B组
2.64±0.45①
, http://www.100md.com
2.36±0.41①
2.31±0.34①
1.96±0.26①
3.12±0.62
3.04±0.54
2.89±0.47
2.45±0.34
C组
2.16±0.64②
2.08±0.45②
, 百拇医药 1.98±0.22①
1.60±0.38②
2.68±0.44①
2.60±0.49
2.54±0.52
2.40±0.36
D组
3.10±0.48①
2.94±0.47①
2.50±0.61①
, 百拇医药
2.02±0.41①
3.30±0.41
3.22±0.43
3.12±0.50
2.61±0.45
注:与A组比较,t检验，①P<0.05，②P<0.01
3 讨论
根据联合行为评分，损伤后即刻各组都丧失了90%以上的功能，以后各组功能逐渐恢复。单纯损伤组手术后1周恢复不明显，手术后12周仅恢复了60%的功能。移植各组手术后1周功能恢复比较快，胚胎脊髓+大网膜移值组恢复最快,手术后1周已恢复了60%的功能，单纯胚胎脊髓移植组恢复了50%，胚胎脊髓+椎旁肌移值组恢复了40%。至手术后12周胚胎脊髓+大网膜移值组恢复了85%的功能，单纯胚胎脊髓移植组恢复了82%，胚胎脊髓+椎旁肌移植组仅恢复了77%的功能。
, 百拇医药
脊髓损伤及移植后即刻所有动物MEP、SEP波幅都明显减低或完全消失，手术后1周，单纯损伤组基本没有变化，移植各组恢复也不明显。4周以后各组均有不同程度的恢复，单纯损伤组SEP、MEP到手术后12周也没有恢复到接近正常的波幅和潜峰时。移植各组手术后4周潜峰时逐渐恢复，到12周时已接近正常，其中，以胚胎脊髓+大网膜移植组恢复最好。另外，胚胎脊髓+大网膜移植组恢复比较快，4周时已接近正常，胚胎脊髓+椎旁肌移植组恢复比较慢，12周时还不如单纯胚胎脊髓移植组恢复得好。Miya[2]认为移植的胚胎脊髓组织能使下行系统影响马尾脊髓，主要由直接生长通过损伤部位或在胚胎脊髓形成中继站。实验中还发现来自脑干的5-HT纤维生长进入并通过了移植物。另外，神经解剖和病理结果还表明，移植的胚胎脊髓还可以通过其神经营养功能影响损伤的腰段脊髓，保持神经元的活性[3]。因此，我们推测移植胚胎脊髓促进脊髓修复的机理可能是促进神经轴突的再生、解救濒死的神经元、保持神经回路的营养，并通过代偿机制改善营养环境，由此改善运动功能。
, http://www.100md.com
已有报道表明[4]，大网膜组织脊髓内移植后72h大网膜与脊髓间有血管沟通，1周有广泛的血管连接并深入到白质。椎旁肌移植手术后24h肌瓣与脊髓及其周围组织粘连;2周时肌瓣与周围组织愈合,不易分离;1个月时肌瓣明显纤维化，增生的纤维组织甚至侵入脊髓白质组织内。我们的研究结果表明,大网膜+胚胎脊髓组织移植组效果较好，运动功能恢复快，4周时已接近正常。因此，可以推测大网膜+胚胎脊髓移植不仅可以提供血液循环，而且可以吸收渗血、渗液，减轻脊髓水肿，改善局部内环境，阻止脊髓继发性损伤。椎旁肌移植覆盖胚胎脊髓，由于肌组织再生能力差，纤维瘢痕样改变造成广泛粘连，纤维化肌瓣内的血管也随着纤维组织老化和收缩而逐渐闭合、纤维化，使血液循环减少，不仅无助于脊髓血流量的恢复，甚至成为脊髓血液循环和功能恢复的障碍[5]。
本研究为动物试验，在人体是否产生同样的效果有待进一步研究。
△ 本课题为全军医学重点实验室资助项目 编号：97015
, 百拇医药
作者单位：张强 济南军区第88医院全军骨科中心 271000 山东省泰安市(现在第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所三室 400042 重庆市长江支路10号
廖维宏 第三军医大学附属大平医院野战外科研究所
王正国 第三军医大学附属大平医院野战外科研究所
伍亚民 第三军医大学附属大平医院野战外科研究所
李应玉 第三军医大学附属大平医院野战外科研究所
参考文献
[1]Gale K,kerasidis H,Wrathall JR.Spinal cord contusion in the rat:behavioral analysis of functional neurological impairment[J].Exp Neurol,1985,88(1):123-127.
, 百拇医药
[2]Miya D,Giszter S,Mori F,et al.Fetal transplants alter the development of function after spinal cord transection in new born rats[J].J Neurosci,1997,17(12):4856-4872.
[3]Bregman BS.Spinal cord transplants permit the growth of serotonergic axons across the site of neonatal sponal cord transection[J].Dev Brain Res,1987,34(2):265-279.
[4]胥少汀.关于带血运组织移植覆盖于脊髓[J].中华骨科杂志，1997，17(5)：283.
[5]赵文汝，张振伟，周庆芬，等.带蒂骶棘肌脊髓移植后移植肌瓣的组织学观察[J].中国脊髓柱脊髓杂志，1995，3(5)：209-210., 百拇医药
摘 要 目的：研究提供血运的胚胎脊髓移植对成鼠损伤脊髓功能恢复的作用。方法：将成年Wistar大鼠作成脊髓半切洞损伤模型，应用单纯胚胎脊髓组织、胚胎脊髓+大网膜组织、胚胎脊髓+椎旁肌组织移植到半切洞损伤的脊髓中，手术后1、2、4、12周进行联合行为评分、感觉诱发电位(SEP)和运动诱发电位(MEP)检查，并与正常组及单纯损伤组比较。结果：联合行为评分，单纯移植组和胚胎脊髓+大网膜组织移植组优于单纯损伤组，SEP和MEP潜峰时的恢复，移植各组均优于单纯损伤组，以胚胎脊髓+大网膜组织移植组效果最好，单纯胚胎脊髓移植组优于胚胎脊髓+椎旁肌移植组。结论：提供血运的胚胎脊髓移植对成鼠损伤脊髓功能恢复有较好的促进作用。
关键词：脊髓损伤 脊髓内移植 胚胎脊髓 大网膜 椎旁肌
, http://www.100md.com
胚胎脊髓移植治疗脊髓损伤的实验研究已开展多年，但如何进一步促进胚胎脊髓移植后脊髓神经功能恢复尚无重大进展。本实验应用单纯胚胎脊髓移植、胚胎脊髓移植+大网膜、胚胎脊髓移植+椎旁肌的方法移植到成年大鼠脊髓半切洞中。然后应用联合行为评分(CBS)、运动诱发电位(MEP)和感觉诱发电位(SEP)检查脊髓功能恢复情况。结果表明，提供血运的胚胎脊髓移植能够促进大鼠损伤脊髓功能恢复。
1 材料与方法
1.1 动物分组
Wistar成年大鼠170只，体重180～250g，雌雄不拘。分为单纯脊髓半切洞损伤组(A组)、胚胎脊髓移植组(B组)、胚胎脊髓+大网膜移植组(C组)、胚胎脊髓+椎旁肌移植组(D组)，术后1、2、4、12周各时相点每组10只，正常对照组10只动物。
1.2 手术方法
, 百拇医药
用戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，腰背部脱毛，无菌条件下暴露脊髓腰膨大，用负压吸引的方法损毁并吸除左侧半脊髓，造成一约2×2×2mm大小的洞腔。胚胎脊髓供体为同种异体妊娠14d的大鼠。在麻醉和无菌条件下取出胎鼠，显微镜下仔细切取颈胸段胎鼠脊髓约2mm，尽可能将胚胎脊髓表面的软脊膜等结缔组织切除干净，然后用玻璃针头吸取移植物，注入预制的脊髓洞腔内，用9-0线缝合硬脊膜。大网膜+胚胎脊髓移植，取左上腹部纵切口，将胃左动脉支大网膜经皮下隧道转移到腰背部切口内，将大网膜末端覆盖在移植的胚胎脊髓上，然后用9-0线缝合硬脊膜，并将蒂与硬脊膜缝合固定，注意尽量保持大网膜血运。椎旁肌+胚胎脊髓移植，顺椎旁肌方向切取带蒂的椎旁肌，同样将椎旁肌末端覆盖在移植的胚胎脊髓上，用9-0线缝合硬脊膜，并将肌蒂与硬脊膜缝合固定。
1.3 联合行为评分(CBS)
应用Gale[1]联合行为评分法，评定大鼠脊髓损伤运动、感觉、反射以及肢体动作协调等方面的功能。最大值是100分表示神经功能100%的丧失，最小值0分，表示神经功能完全正常。
, 百拇医药
1.4 诱发电位检查
应用第三军医大学野战外科研究所研制的多功能神经诱发电位仪检查。动物麻醉后，选择移植同侧坐骨神经和对侧大脑皮层运动区分别进行电刺激，记录SEP和MEP波形曲线。刺激频率4Hz，波宽0.2ms，强度40～60mV。信号经前置放大器放大10万倍，计算机叠加300次。
2 结果
2.1 联合行为评分
正常组为0分，损伤即刻评分为92±6.26，术后1、2、4、12周评分见表1。
表1 各组联合行为评分 (X±S)
手术后时间(周)
1
, 百拇医药
2
4
12
A组
88±5.18
71±6.50
62±7.68
37±4.56
B组
50±3.12①
35±4.17①
27±2.89①
, http://www.100md.com
18±3.46②
C组
41±4.44①
30±6.82①
25±3.49①
15±8.23②
D组
61±3.24②
40±3.23②
32±4.56①
, http://www.100md.com
23±4.67②
注:与A组比较，t检验，①P<0.01 ②P<0.05
2.2 SEP与MEP检查结果
见表2。
表2 各组MEP和SEP潜峰时 (X±S) ( ms)
MEP
SEP
1周
2周
4周
12周
, 百拇医药 1周
2周
4周
12周
正常组
1.48±0.46
1.48±0.46
1.48±0.46
1.48±0.46
2.31±0.26
2.31±0.26
2.31±0.26
, http://www.100md.com 2.31±0.26
A组
5.45±0.82
5.12±0.74
4.26±0.62
4.50±0.65
4.90±1.54
4.63±1.57
4.43±1.65
3.81±1.62
B组
2.64±0.45①
, http://www.100md.com
2.36±0.41①
2.31±0.34①
1.96±0.26①
3.12±0.62
3.04±0.54
2.89±0.47
2.45±0.34
C组
2.16±0.64②
2.08±0.45②
, 百拇医药 1.98±0.22①
1.60±0.38②
2.68±0.44①
2.60±0.49
2.54±0.52
2.40±0.36
D组
3.10±0.48①
2.94±0.47①
2.50±0.61①
, 百拇医药
2.02±0.41①
3.30±0.41
3.22±0.43
3.12±0.50
2.61±0.45
注:与A组比较,t检验，①P<0.05，②P<0.01
3 讨论
根据联合行为评分，损伤后即刻各组都丧失了90%以上的功能，以后各组功能逐渐恢复。单纯损伤组手术后1周恢复不明显，手术后12周仅恢复了60%的功能。移植各组手术后1周功能恢复比较快，胚胎脊髓+大网膜移值组恢复最快,手术后1周已恢复了60%的功能，单纯胚胎脊髓移植组恢复了50%，胚胎脊髓+椎旁肌移值组恢复了40%。至手术后12周胚胎脊髓+大网膜移值组恢复了85%的功能，单纯胚胎脊髓移植组恢复了82%，胚胎脊髓+椎旁肌移植组仅恢复了77%的功能。
, 百拇医药
脊髓损伤及移植后即刻所有动物MEP、SEP波幅都明显减低或完全消失，手术后1周，单纯损伤组基本没有变化，移植各组恢复也不明显。4周以后各组均有不同程度的恢复，单纯损伤组SEP、MEP到手术后12周也没有恢复到接近正常的波幅和潜峰时。移植各组手术后4周潜峰时逐渐恢复，到12周时已接近正常，其中，以胚胎脊髓+大网膜移植组恢复最好。另外，胚胎脊髓+大网膜移植组恢复比较快，4周时已接近正常，胚胎脊髓+椎旁肌移植组恢复比较慢，12周时还不如单纯胚胎脊髓移植组恢复得好。Miya[2]认为移植的胚胎脊髓组织能使下行系统影响马尾脊髓，主要由直接生长通过损伤部位或在胚胎脊髓形成中继站。实验中还发现来自脑干的5-HT纤维生长进入并通过了移植物。另外，神经解剖和病理结果还表明，移植的胚胎脊髓还可以通过其神经营养功能影响损伤的腰段脊髓，保持神经元的活性[3]。因此，我们推测移植胚胎脊髓促进脊髓修复的机理可能是促进神经轴突的再生、解救濒死的神经元、保持神经回路的营养，并通过代偿机制改善营养环境，由此改善运动功能。
, http://www.100md.com
已有报道表明[4]，大网膜组织脊髓内移植后72h大网膜与脊髓间有血管沟通，1周有广泛的血管连接并深入到白质。椎旁肌移植手术后24h肌瓣与脊髓及其周围组织粘连;2周时肌瓣与周围组织愈合,不易分离;1个月时肌瓣明显纤维化，增生的纤维组织甚至侵入脊髓白质组织内。我们的研究结果表明,大网膜+胚胎脊髓组织移植组效果较好，运动功能恢复快，4周时已接近正常。因此，可以推测大网膜+胚胎脊髓移植不仅可以提供血液循环，而且可以吸收渗血、渗液，减轻脊髓水肿，改善局部内环境，阻止脊髓继发性损伤。椎旁肌移植覆盖胚胎脊髓，由于肌组织再生能力差，纤维瘢痕样改变造成广泛粘连，纤维化肌瓣内的血管也随着纤维组织老化和收缩而逐渐闭合、纤维化，使血液循环减少，不仅无助于脊髓血流量的恢复，甚至成为脊髓血液循环和功能恢复的障碍[5]。
本研究为动物试验，在人体是否产生同样的效果有待进一步研究。
△ 本课题为全军医学重点实验室资助项目 编号：97015
, 百拇医药
作者单位：张强 济南军区第88医院全军骨科中心 271000 山东省泰安市(现在第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所三室 400042 重庆市长江支路10号
廖维宏 第三军医大学附属大平医院野战外科研究所
王正国 第三军医大学附属大平医院野战外科研究所
伍亚民 第三军医大学附属大平医院野战外科研究所
李应玉 第三军医大学附属大平医院野战外科研究所
参考文献
[1]Gale K,kerasidis H,Wrathall JR.Spinal cord contusion in the rat:behavioral analysis of functional neurological impairment[J].Exp Neurol,1985,88(1):123-127.
, 百拇医药
[2]Miya D,Giszter S,Mori F,et al.Fetal transplants alter the development of function after spinal cord transection in new born rats[J].J Neurosci,1997,17(12):4856-4872.
[3]Bregman BS.Spinal cord transplants permit the growth of serotonergic axons across the site of neonatal sponal cord transection[J].Dev Brain Res,1987,34(2):265-279.
[4]胥少汀.关于带血运组织移植覆盖于脊髓[J].中华骨科杂志，1997，17(5)：283.
[5]赵文汝，张振伟，周庆芬，等.带蒂骶棘肌脊髓移植后移植肌瓣的组织学观察[J].中国脊髓柱脊髓杂志，1995，3(5)：209-210., 百拇医药