人胰腺癌p16蛋白的表达及意义
作者：周家华 杨德同 孙桂勤 姚青 尹克铮 汤文浩
单位：周家华 杨德同 汤文浩(南京铁道医学院第一附属医院胆胰外科 210009)；姚青 尹克铮(病理科)；孙桂勤(南京军区南京总医院病理科)
关键词：
江苏医药000724 p16基因是抑癌基因，其表达的p16蛋白是调节细胞周期的主要成分，我们用免疫组织化学技术，对35例原发性胰腺癌的p16蛋白表达进行研究，探讨其在胰腺癌发生、病理学特征及临床分期的关系。
一、材料与方法
一、材料
1.标本采集：35例人胰腺癌患者癌组织及癌旁正常组织，其中12例为外科新鲜标本，23例为石蜡块标本，分别由本院、江苏省人民医院、江苏省肿瘤医院提供并鉴定。男女比为4∶3，年龄最大74岁，最小19岁，平均59岁。
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2.试剂：免疫组化试剂p16蛋白抗体(1∶100)(Santa cruz)、即用型LSAB试剂盒(DAKO公司)、DAB试剂盒(SABC)，组织学检测用常规HE染色。
二、方法
1.采用LSAB技术：石蜡包埋组织作4 μm厚的切片，常规脱蜡水化，将切片于0.01M柠檬酸盐缓冲液中(pH6.0)，微波炉煮沸10 min修复抗原，取出待冷却至室温后，用蒸馏水洗三次，继用0.3%H2O2-甲醇常温下孵育切片10’，以阻断内源性过氧化物酶，擦去周围PBS，滴加封闭剂，置切片于湿盒中孵育37℃20’，吸去封闭剂(勿洗)，用p16抗体1∶20浓度滴加，37°孵育1小时，4°湿盒过液，切片用PBS洗3×5’，滴加LSAB二抗工作液(即ABC)置切片于湿盒中37°孵育30’，PBS洗3×5’，将DAB以DAB工作液稀释50倍滴加到切片上，显色5’-10’(在显微镜下控制显色)后用自来水冲洗3’终止，用苏木素复染1-1.5’，冲洗10’，脱水、透明、封片、镜检。
, 百拇医药
对照：其中以已知的乳腺癌p16阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，以正常胰腺组织作正常对照。
2.结果判定：以胞浆染成棕黄色颗粒作为阳性判断标准，按无阳性瘤细胞或阳性瘤细胞数表达<10%为阴性，阳性瘤细胞细胞数表达<25%为“+”，细胞数占25%～50%为“++”，细胞数>50%为“+++”。
3.统计学分析用四格表精确概率法及列联表精确概率法处理。
二、结果
1.分析发现有21个标本出现不同程度的p16蛋白表达下降(12例阴性，9例“+～++”)，占60%见表1。
表1 人胰腺癌p16蛋白表达情况 表达程度
病例数
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-
12
+
6
++
3
+++以上
14
注：p16蛋白表达下降与p16蛋白表达+++相比，差异显著(P<0.05)
2.p16蛋白表达异常与胰腺癌分化程度的关系见表2。表2 p16蛋白表达异常与胰腺癌分化程度的关系 分化程度
p16蛋白表达下降
, 百拇医药
p16蛋白表达未下降
低
1
4
中
10
7
高
10
3
注：中低分化蛋白表达下降为66%，而高分化蛋白表达下降为20%，但差异不显著(P>0.05)
3.p16蛋白表达异常与胰腺癌TNM分期的关系见表3。表3 p16蛋白表达异常与胰腺癌TNM分期的关系 TNM分期
, 百拇医药
p16蛋白表达异常
表达下降
表达正常
Ⅰ
2
3
Ⅱ
4
8
Ⅲ
12
3
Ⅳ
3
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2
注：Ⅲ期与Ⅰ期+Ⅱ期相比有明显的差异性P<0.05(FI＝5.67)
Ⅲ期与Ⅰ期+Ⅱ期+Ⅳ期相比有明显的差异性P<0.05(FI＝5.43)
三、讨论
p16基因是第一个被证明为肿瘤抑制基因的细胞调控机制的内在成分，是近年来肿瘤分子生物学研究的一个热点，研究发现p16基因与胰腺癌有较为密切的关系[1，2]。
p16蛋白选择性的抑制CDK4，当p16基因变异影响p16蛋白的结构和功能而表达下降时，导致细胞周期抑制作用消失，产生肿瘤。基因缺失、突变、甲基化是引起p16蛋白表达下降的主要原因。在细胞中野生型p53蛋白含量少，且半衰期短仅6～20分钟，因此用一般的免疫组化检测到的p53蛋白为突变型，而野生型p16蛋白与之相反，所以用一般的免疫组化检测到的p16蛋白是野生型而非突变型，有较高的临床应用价值。本文用敏感的LSAB方法对35例胰腺癌进行p16蛋白表达研究，有21个标本出现不同程度的p16蛋白表达下降(12例阴性，9例“+～++”)占60%(与基因缺失和突变基本吻合，论文另发)从而证实了p16基因突变参与了人胰腺癌的发生。
, 百拇医药
一般认为人胰腺癌分化程度低、浸润广泛、及临床分期处于Ⅲ～Ⅳ期的病人预后较差。统计学分析表明p16基因蛋白表达异常与人胰腺癌性别、年龄及病理类型无明确的关系；分化程度高的人胰腺癌标本p16蛋白表达下降率为20%(1/5)，而中低分化蛋白表达下降率为66%(20/30)，说明分化程度差p16失活高，但统计学无差异，可能与病例少有关。统计学分析表明p16蛋白表达异常与临床分期Ⅲ期有明确的关系。Detlf Bartsh[3]报道p16基因突变与胰腺癌Ⅲ期有相关性，发生p16突变的病人平均存活5.5个月，无p16突变的病人平均存活19个月，差异明显。Naka T[4]用免疫组化方法检测p16蛋白表达，发现p16蛋白表达阴性与临床分期有关，5例p16蛋白表达阳性的病例存活3年，而阴性病例很短。说明p16蛋白的检测对人胰腺癌的诊断及预后判断有重要的临床意义。
参考文献
1，Caldas C，Hahn SA，da Costa LT，et al.Frequent somatic mutation and homozygous deletions of p16(MTS1) gene in pancreatic adenocarcinoma.J Nat Genet，1994，8：27.
, http://www.100md.com
2，Muscarella P，Melvin WS，Fisher WE，et al.Genetic alteration in gastrinomas and nonfunctioning pancreatic neuroendocrine tumor：a analysis of p16/MTS1 tomur suppressor gene inactivation.J Cancer Res，1998，58(2)：237-40.
3，Bartsch D，Shevlin DW，Callery MP，et al.Reduced survical in patients with ductal pancreatic adenocarcinoma associated with CDKN2 mutation.J Nat cancer Inst，1996，88：680.
4，Naka T，Kobayashi M，Ashida K，et al.Aberrant p16INK4 expression related to clinical stage and prognosis in patients with pancreatic cancer.Int J Oncol，1998，12(5)：1111-6., 百拇医药
单位：周家华 杨德同 汤文浩(南京铁道医学院第一附属医院胆胰外科 210009)；姚青 尹克铮(病理科)；孙桂勤(南京军区南京总医院病理科)
关键词：
江苏医药000724 p16基因是抑癌基因，其表达的p16蛋白是调节细胞周期的主要成分，我们用免疫组织化学技术，对35例原发性胰腺癌的p16蛋白表达进行研究，探讨其在胰腺癌发生、病理学特征及临床分期的关系。
一、材料与方法
一、材料
1.标本采集：35例人胰腺癌患者癌组织及癌旁正常组织，其中12例为外科新鲜标本，23例为石蜡块标本，分别由本院、江苏省人民医院、江苏省肿瘤医院提供并鉴定。男女比为4∶3，年龄最大74岁，最小19岁，平均59岁。
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2.试剂：免疫组化试剂p16蛋白抗体(1∶100)(Santa cruz)、即用型LSAB试剂盒(DAKO公司)、DAB试剂盒(SABC)，组织学检测用常规HE染色。
二、方法
1.采用LSAB技术：石蜡包埋组织作4 μm厚的切片，常规脱蜡水化，将切片于0.01M柠檬酸盐缓冲液中(pH6.0)，微波炉煮沸10 min修复抗原，取出待冷却至室温后，用蒸馏水洗三次，继用0.3%H2O2-甲醇常温下孵育切片10’，以阻断内源性过氧化物酶，擦去周围PBS，滴加封闭剂，置切片于湿盒中孵育37℃20’，吸去封闭剂(勿洗)，用p16抗体1∶20浓度滴加，37°孵育1小时，4°湿盒过液，切片用PBS洗3×5’，滴加LSAB二抗工作液(即ABC)置切片于湿盒中37°孵育30’，PBS洗3×5’，将DAB以DAB工作液稀释50倍滴加到切片上，显色5’-10’(在显微镜下控制显色)后用自来水冲洗3’终止，用苏木素复染1-1.5’，冲洗10’，脱水、透明、封片、镜检。
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对照：其中以已知的乳腺癌p16阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，以正常胰腺组织作正常对照。
2.结果判定：以胞浆染成棕黄色颗粒作为阳性判断标准，按无阳性瘤细胞或阳性瘤细胞数表达<10%为阴性，阳性瘤细胞细胞数表达<25%为“+”，细胞数占25%～50%为“++”，细胞数>50%为“+++”。
3.统计学分析用四格表精确概率法及列联表精确概率法处理。
二、结果
1.分析发现有21个标本出现不同程度的p16蛋白表达下降(12例阴性，9例“+～++”)，占60%见表1。
表1 人胰腺癌p16蛋白表达情况 表达程度
病例数
, http://www.100md.com
-
12
+
6
++
3
+++以上
14
注：p16蛋白表达下降与p16蛋白表达+++相比，差异显著(P<0.05)
2.p16蛋白表达异常与胰腺癌分化程度的关系见表2。表2 p16蛋白表达异常与胰腺癌分化程度的关系 分化程度
p16蛋白表达下降
, 百拇医药
p16蛋白表达未下降
低
1
4
中
10
7
高
10
3
注：中低分化蛋白表达下降为66%，而高分化蛋白表达下降为20%，但差异不显著(P>0.05)
3.p16蛋白表达异常与胰腺癌TNM分期的关系见表3。表3 p16蛋白表达异常与胰腺癌TNM分期的关系 TNM分期
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p16蛋白表达异常
表达下降
表达正常
Ⅰ
2
3
Ⅱ
4
8
Ⅲ
12
3
Ⅳ
3
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2
注：Ⅲ期与Ⅰ期+Ⅱ期相比有明显的差异性P<0.05(FI＝5.67)
Ⅲ期与Ⅰ期+Ⅱ期+Ⅳ期相比有明显的差异性P<0.05(FI＝5.43)
三、讨论
p16基因是第一个被证明为肿瘤抑制基因的细胞调控机制的内在成分，是近年来肿瘤分子生物学研究的一个热点，研究发现p16基因与胰腺癌有较为密切的关系[1，2]。
p16蛋白选择性的抑制CDK4，当p16基因变异影响p16蛋白的结构和功能而表达下降时，导致细胞周期抑制作用消失，产生肿瘤。基因缺失、突变、甲基化是引起p16蛋白表达下降的主要原因。在细胞中野生型p53蛋白含量少，且半衰期短仅6～20分钟，因此用一般的免疫组化检测到的p53蛋白为突变型，而野生型p16蛋白与之相反，所以用一般的免疫组化检测到的p16蛋白是野生型而非突变型，有较高的临床应用价值。本文用敏感的LSAB方法对35例胰腺癌进行p16蛋白表达研究，有21个标本出现不同程度的p16蛋白表达下降(12例阴性，9例“+～++”)占60%(与基因缺失和突变基本吻合，论文另发)从而证实了p16基因突变参与了人胰腺癌的发生。
, 百拇医药
一般认为人胰腺癌分化程度低、浸润广泛、及临床分期处于Ⅲ～Ⅳ期的病人预后较差。统计学分析表明p16基因蛋白表达异常与人胰腺癌性别、年龄及病理类型无明确的关系；分化程度高的人胰腺癌标本p16蛋白表达下降率为20%(1/5)，而中低分化蛋白表达下降率为66%(20/30)，说明分化程度差p16失活高，但统计学无差异，可能与病例少有关。统计学分析表明p16蛋白表达异常与临床分期Ⅲ期有明确的关系。Detlf Bartsh[3]报道p16基因突变与胰腺癌Ⅲ期有相关性，发生p16突变的病人平均存活5.5个月，无p16突变的病人平均存活19个月，差异明显。Naka T[4]用免疫组化方法检测p16蛋白表达，发现p16蛋白表达阴性与临床分期有关，5例p16蛋白表达阳性的病例存活3年，而阴性病例很短。说明p16蛋白的检测对人胰腺癌的诊断及预后判断有重要的临床意义。
参考文献
1，Caldas C，Hahn SA，da Costa LT，et al.Frequent somatic mutation and homozygous deletions of p16(MTS1) gene in pancreatic adenocarcinoma.J Nat Genet，1994，8：27.
, http://www.100md.com
2，Muscarella P，Melvin WS，Fisher WE，et al.Genetic alteration in gastrinomas and nonfunctioning pancreatic neuroendocrine tumor：a analysis of p16/MTS1 tomur suppressor gene inactivation.J Cancer Res，1998，58(2)：237-40.
3，Bartsch D，Shevlin DW，Callery MP，et al.Reduced survical in patients with ductal pancreatic adenocarcinoma associated with CDKN2 mutation.J Nat cancer Inst，1996，88：680.
4，Naka T，Kobayashi M，Ashida K，et al.Aberrant p16INK4 expression related to clinical stage and prognosis in patients with pancreatic cancer.Int J Oncol，1998，12(5)：1111-6., 百拇医药