应用捕获ELISA法早期诊断肾综合征出血热
作者：潘发愤 卢明芹 王震龙 金益辉 金小亚 吴新
单位：浙江省温州医学院附属第一医院325000
关键词：捕获ELISA法；肾综合征出血热；早期诊断
中国现代医学杂志000731
目的：探讨肾综合征出血热早期诊断方法。方法：用macELISA、IFAT 两 种方法同时检测经临床诊断肾综合征出血热病人血清40份，非出血热血清20份，正常人血清 20份，并进行对比研究。而且阳性血清用2-巯基乙醇破坏IgM试验，阴性血清加类风湿因子 阳性血清进行干扰试验。结果：用macELISA法检测肾综合征出血热病人病程第2天即可出现 阳性，第3～4天特异性抗体IgM阳性率达89%；第5～7天可达100%，而IFAT法同病日抗体阳性 率只有55%与70%(P<0.05)。非出血热病人与正常人特异性抗体全部阴性。阳性血清 用2 -巯 基乙醇破坏IgM后macELISA检测为阴性；而阴性血清加类风湿阳性血清后再用本法检测无假 阳性。结论：与IFAT法相比，macELISA法诊断肾综合征出血热特异性强，灵敏度高，早期诊 断意义大。
, 百拇医药
分类号 R692
为了探索临床早期诊断肾综合征出血热的方法，作 者应用IgM抗体捕获ELISA法检测特异性抗体，早期诊断的价值远比 间接免疫荧光技术(IFAT)和反向间接血凝抑制试验(RPHI)优越，现将方法与结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 试剂
macELISA诊断试剂盒和IFAT抗原片由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。
1.2 血清
肾综合征出血热血清为我院1996年8月～1999年8月按文献[1]临床诊断肾综合征出 血热收治病人血清，共40份；非出血热病人血清：包括急性甲肝、戍肝、慢性乙肝、伤寒、 淋巴瘤、乙型脑炎、类风湿性关节炎等病人共20份；正常人血清共20份，年龄20～40岁。以 上血清标本均冻于-20℃保存。
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1.3 间接荧光疫免试验(IFAT) 按文献操作[2]
1.4 IgM抗体捕获ELISA法
羊抗人μ链抗体，稀释为5r/ml(pH9.6,0.1m碳酸盐缓冲液)，加至80孔聚 苯乙烯板反应孔，100μl/孔，37℃包被过夜。用洗涤液(PBSpH7.4，0.02M，0.05%Twee n-20 )洗3次。10%兔血清封闭，37℃，1h；加入1∶100稀释的待栓血清(稀释液为PBS-T，含5%小 牛血 清)，100μl/孔，37℃，1h，洗4次；加入阳性病毒抗原和对照抗原，100μl/孔，37℃，2h 或4℃16h孵育，洗4次；加入酶结合物，含0.045%H2O2。37℃，10min后用4NH 2SO4终止。
用Clini Bio128酶标仪测定OD值，(阴性抗原对照小于0.05按0.05计)。每次试验均设阴性 抗原对照，血清对照，抗原对照，酶对照和空白对照。
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结果测定：待检血清与阳性和阴性抗原反应的OD值的比值P/N≥2.1为阳性判断标准。
2 结果
2.1 macELISA检测肾综合征出血热IgM抗体的特异性研究
肾综合征出血热和非出血热病人，正常人血清检测见表1。
表1 macELISA检测不同来源血清特异性IgM抗体 血清
检查数
阳性数1)
阳性率(%)
出血热病人3～7病日
22
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20
90.9
正常人
20
0
0
非出血热病人2)
18
0
0
类风湿性关节炎(RF阳性)病人
2
0
, 百拇医药
0
注：1)以1∶100稀释，P/N≥2.1为阳性
2)其中1份血清乙脑IgM阳性(>1∶1000)，3份血清甲肝IgM阳性(>1∶1000)
结果表明仅出血热病人血清特异性IgM阳性，其余均为阴性，特异性100%。
2.2 二巯基乙醇(2-ME)破坏试验
2-ME可破坏IgM，为了证实所测定IgM抗体的特异性，选用了2 份IgM(+)血清和2份IgM(-)而IgG(+)血清，用2-ME与1∶5稀释的血清等量混和，37℃处理30m in即刻与处理前血清同时进行测定，结果表明：经2-ME处理后，IgM全部被破坏呈阴性，而I gG不受影响。
选择2份出血热IgM(-)血清，掺入类风湿因子阳性血清标本(用胶乳凝集试验测定为强阳性者 )，用macELISA测定，无1例阳性。结果表明类风湿因子对本法无干扰。
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2.3 临床血清标本特异性IgM检测
表2 macELISA检测不同病日出血热病人特异性抗体与IFAT法比较 病日
检查数
IgM(macELISA)
IgG(IFAT)
(+) 1)
%
(+)2)
%
2～3
3
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2
66.7
0
0
4～5
9
8
89
5
55.6
5～7
10
10
100
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7
70
7～10
12
12
100
10
83.3
10～30
4
4
100
4
100
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>30
2
1
50
2
100
注：1)以1∶100稀释，P/N≥2.1为阳性
2)1∶20稀释，有特征性荧光颗粒出现
表2结果表明：用macELISA法，在第2～3病日可检测到特异性IgM，而IFAT法3例均未 出现阳性，第4～5病日IgM(+)达89%，而IgG仅55.6%，第5～7病日IgM(+)达100%，而IgG 仅70 %。但到30病日后IgM阳性开始下降，共结果符合一般病毒性疾病特异性抗体的产生规律。也 反映出特异性IgM检测在肾综合征出血热早期诊断中的重要价值。
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2.4 第3～7病日肾综合征出血热病人特异性IgM和IgG抗体阳性率比较
表3 第3～7病日特异性IgM和IgG抗体阳性率比较
IgM(macELISA)
总计
(+)
(-)
IgG(IFAT)
(+)
12
0
12
(-)
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8
2
10
总计
20
2
22
IgM在3～7d阳性率达90 .9%(20/22，macELISA)，而IgG仅54.5%(12/20IFAT)，IgM和IgG阳性率差异有显著性P< 0.05。
不同病日肾综合征出血热病人血清特异性抗体(1∶100稀释度)P/N值和IFAT法滴度的比较 显示：P/N值与不同病日有一定规律，即在3～6病日迅速升高，7～20病日达高峰，30病日以 后逐渐下降。3 讨论
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通过上述实验表明：用macELISA法检测肾综合征出血热特异性抗体有如下优点：特异性强。不受类风湿因子干扰，对其他疾病病人血清或IgM，正常人血清无特异性反应，特异度100% ；灵敏度高。在第3～7病日IgM检出率达90.9%，而IFAT法同病日敏感度只有54.5%，P<0. 05；早期诊断意义大，用本法在病程第2日即可检出特异性抗体。第3～5日IgM阳性率达89%，第5 ～7日达100%；而 IFAT法 ，同病日IgG阳性率仅55%与70%。而且，IFAT法是检测IgG总抗体，在本病流行区隐 性感 染率达2～10%，家鼠型流行区更高[3，4]。若用单份血清检查，IFAT不易区分是 隐性感染还是既往感染，因而容易造成误诊。而macELISA测定特异性IgM抗体，更适合于早 期诊断。
本组在发病5d以内2例患者血清特异性IgM抗体(-)，但在病后10d再用macELISA法检测呈阳性 ，这可能与这些患者个体免疫差异IgM抗体出现较晚有关[5]。故尽管macELISA法 有诸多优点，但对早期病人(起病5d内)血清阳性率并非100%。因此，对可疑病人早期标本的 阴性结果，有必要进行第2次血清 标本的检查。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，陈灏珠主编.实用内科学.第10版.北京：人民卫生出版社，310～316
2，宋 干.中国医学科学院学报，1982；4：72
3，Lee HN.Isolation of etiological agent of korean Hemorrhagic feve r.J infect Dis,1978;137:298
4，张桂林.野鼠型和家鼠型疫区人群肾综合征出血热隐性感染人群研究.中华流 行病学杂志，1993；1：30
5，于丹萍.流行性出血热临床发病学观察及治疗原则探讨.中华内科杂志，199 2；3：163, 百拇医药
单位：浙江省温州医学院附属第一医院325000
关键词：捕获ELISA法；肾综合征出血热；早期诊断
中国现代医学杂志000731
目的：探讨肾综合征出血热早期诊断方法。方法：用macELISA、IFAT 两 种方法同时检测经临床诊断肾综合征出血热病人血清40份，非出血热血清20份，正常人血清 20份，并进行对比研究。而且阳性血清用2-巯基乙醇破坏IgM试验，阴性血清加类风湿因子 阳性血清进行干扰试验。结果：用macELISA法检测肾综合征出血热病人病程第2天即可出现 阳性，第3～4天特异性抗体IgM阳性率达89%；第5～7天可达100%，而IFAT法同病日抗体阳性 率只有55%与70%(P<0.05)。非出血热病人与正常人特异性抗体全部阴性。阳性血清 用2 -巯 基乙醇破坏IgM后macELISA检测为阴性；而阴性血清加类风湿阳性血清后再用本法检测无假 阳性。结论：与IFAT法相比，macELISA法诊断肾综合征出血热特异性强，灵敏度高，早期诊 断意义大。
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分类号 R692
为了探索临床早期诊断肾综合征出血热的方法，作 者应用IgM抗体捕获ELISA法检测特异性抗体，早期诊断的价值远比 间接免疫荧光技术(IFAT)和反向间接血凝抑制试验(RPHI)优越，现将方法与结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 试剂
macELISA诊断试剂盒和IFAT抗原片由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。
1.2 血清
肾综合征出血热血清为我院1996年8月～1999年8月按文献[1]临床诊断肾综合征出 血热收治病人血清，共40份；非出血热病人血清：包括急性甲肝、戍肝、慢性乙肝、伤寒、 淋巴瘤、乙型脑炎、类风湿性关节炎等病人共20份；正常人血清共20份，年龄20～40岁。以 上血清标本均冻于-20℃保存。
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1.3 间接荧光疫免试验(IFAT) 按文献操作[2]
1.4 IgM抗体捕获ELISA法
羊抗人μ链抗体，稀释为5r/ml(pH9.6,0.1m碳酸盐缓冲液)，加至80孔聚 苯乙烯板反应孔，100μl/孔，37℃包被过夜。用洗涤液(PBSpH7.4，0.02M，0.05%Twee n-20 )洗3次。10%兔血清封闭，37℃，1h；加入1∶100稀释的待栓血清(稀释液为PBS-T，含5%小 牛血 清)，100μl/孔，37℃，1h，洗4次；加入阳性病毒抗原和对照抗原，100μl/孔，37℃，2h 或4℃16h孵育，洗4次；加入酶结合物，含0.045%H2O2。37℃，10min后用4NH 2SO4终止。
用Clini Bio128酶标仪测定OD值，(阴性抗原对照小于0.05按0.05计)。每次试验均设阴性 抗原对照，血清对照，抗原对照，酶对照和空白对照。
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结果测定：待检血清与阳性和阴性抗原反应的OD值的比值P/N≥2.1为阳性判断标准。
2 结果
2.1 macELISA检测肾综合征出血热IgM抗体的特异性研究
肾综合征出血热和非出血热病人，正常人血清检测见表1。
表1 macELISA检测不同来源血清特异性IgM抗体 血清
检查数
阳性数1)
阳性率(%)
出血热病人3～7病日
22
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20
90.9
正常人
20
0
0
非出血热病人2)
18
0
0
类风湿性关节炎(RF阳性)病人
2
0
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0
注：1)以1∶100稀释，P/N≥2.1为阳性
2)其中1份血清乙脑IgM阳性(>1∶1000)，3份血清甲肝IgM阳性(>1∶1000)
结果表明仅出血热病人血清特异性IgM阳性，其余均为阴性，特异性100%。
2.2 二巯基乙醇(2-ME)破坏试验
2-ME可破坏IgM，为了证实所测定IgM抗体的特异性，选用了2 份IgM(+)血清和2份IgM(-)而IgG(+)血清，用2-ME与1∶5稀释的血清等量混和，37℃处理30m in即刻与处理前血清同时进行测定，结果表明：经2-ME处理后，IgM全部被破坏呈阴性，而I gG不受影响。
选择2份出血热IgM(-)血清，掺入类风湿因子阳性血清标本(用胶乳凝集试验测定为强阳性者 )，用macELISA测定，无1例阳性。结果表明类风湿因子对本法无干扰。
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2.3 临床血清标本特异性IgM检测
表2 macELISA检测不同病日出血热病人特异性抗体与IFAT法比较 病日
检查数
IgM(macELISA)
IgG(IFAT)
(+) 1)
%
(+)2)
%
2～3
3
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2
66.7
0
0
4～5
9
8
89
5
55.6
5～7
10
10
100
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7
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7～10
12
12
100
10
83.3
10～30
4
4
100
4
100
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2
1
50
2
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注：1)以1∶100稀释，P/N≥2.1为阳性
2)1∶20稀释，有特征性荧光颗粒出现
表2结果表明：用macELISA法，在第2～3病日可检测到特异性IgM，而IFAT法3例均未 出现阳性，第4～5病日IgM(+)达89%，而IgG仅55.6%，第5～7病日IgM(+)达100%，而IgG 仅70 %。但到30病日后IgM阳性开始下降，共结果符合一般病毒性疾病特异性抗体的产生规律。也 反映出特异性IgM检测在肾综合征出血热早期诊断中的重要价值。
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2.4 第3～7病日肾综合征出血热病人特异性IgM和IgG抗体阳性率比较
表3 第3～7病日特异性IgM和IgG抗体阳性率比较
IgM(macELISA)
总计
(+)
(-)
IgG(IFAT)
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12
0
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总计
20
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IgM在3～7d阳性率达90 .9%(20/22，macELISA)，而IgG仅54.5%(12/20IFAT)，IgM和IgG阳性率差异有显著性P< 0.05。
不同病日肾综合征出血热病人血清特异性抗体(1∶100稀释度)P/N值和IFAT法滴度的比较 显示：P/N值与不同病日有一定规律，即在3～6病日迅速升高，7～20病日达高峰，30病日以 后逐渐下降。3 讨论
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通过上述实验表明：用macELISA法检测肾综合征出血热特异性抗体有如下优点：特异性强。不受类风湿因子干扰，对其他疾病病人血清或IgM，正常人血清无特异性反应，特异度100% ；灵敏度高。在第3～7病日IgM检出率达90.9%，而IFAT法同病日敏感度只有54.5%，P<0. 05；早期诊断意义大，用本法在病程第2日即可检出特异性抗体。第3～5日IgM阳性率达89%，第5 ～7日达100%；而 IFAT法 ，同病日IgG阳性率仅55%与70%。而且，IFAT法是检测IgG总抗体，在本病流行区隐 性感 染率达2～10%，家鼠型流行区更高[3，4]。若用单份血清检查，IFAT不易区分是 隐性感染还是既往感染，因而容易造成误诊。而macELISA测定特异性IgM抗体，更适合于早 期诊断。
本组在发病5d以内2例患者血清特异性IgM抗体(-)，但在病后10d再用macELISA法检测呈阳性 ，这可能与这些患者个体免疫差异IgM抗体出现较晚有关[5]。故尽管macELISA法 有诸多优点，但对早期病人(起病5d内)血清阳性率并非100%。因此，对可疑病人早期标本的 阴性结果，有必要进行第2次血清 标本的检查。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，陈灏珠主编.实用内科学.第10版.北京：人民卫生出版社，310～316
2，宋 干.中国医学科学院学报，1982；4：72
3，Lee HN.Isolation of etiological agent of korean Hemorrhagic feve r.J infect Dis,1978;137:298
4，张桂林.野鼠型和家鼠型疫区人群肾综合征出血热隐性感染人群研究.中华流 行病学杂志，1993；1：30
5，于丹萍.流行性出血热临床发病学观察及治疗原则探讨.中华内科杂志，199 2；3：163, 百拇医药