内毒素血症在急性胰腺炎肺损伤中的作用机制
作者：张刚 杨训 刘洲 周晓辉 李德华 陈晓理
单位：张刚 杨训 刘洲 周晓辉 李德华(四川省人民医院肝胆外科成都 610072)；陈晓理(华西医科大学附属第一医院普外科张肇达)
关键词：急性胰腺炎；内毒素；肿瘤坏死因子；肺损伤
中国现代医学杂志000719 目的：急性坏死性胰腺炎(ANP)常继发内毒素(ET)血症，本研究拟探讨 ，ET血症在ANP并发肺损伤过程中的地位及作用机制。方法：将大鼠分3组，AEP组即制备急 性水肿性胰腺炎模型；AEP+LPS组即诱导AEP后再以LPS行腹腔注射来模拟肠源性ET血症；LPS 组动物单纯接受LPS处理。在预定时点测定动物血浆TNF-α含量，并以免疫组化技术检测肺 组织中TNF-α的表达。结果：正常动物以LPS处理后肺内出现TNF-α的明显表达，血中TNF- α含量显著增加，伴有轻度肺损害的表现。AEP组动物肺组织中也有一定程度TNF-α的表达 ，如果再合并ET血症，则TNF-α的生成大大增加，同时出现严重的肺损伤。结论：急性胰腺 炎时ET血症可以通过诱导肺内TNF-α等炎症性细胞因子的过度表达而导致肺损伤。研究还提 示ET血症可能在启动SIRS/MODS及腺胰炎重症化进程中发挥重要作用。
, 百拇医药
分类号 R756
我们拟利用急性水肿性胰腺炎(AEP)合并内毒素血症的动物模型 ，探讨内毒素血症在ANP并发肺损伤过程中的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物与模型制备
成年健康Sprague-Dawley大鼠(雌雄不限，体重250～300g)共75只由华西医科大学实验动物 中心提供。自大鼠尾静脉注入蛙皮素(Sigma,美国)10μg/kg体重，1h后重复注射1次，制备 急性水肿性胰腺炎(AEP)模型[1]。在第1次注射蛙皮素后5h以脂多糖(LPS，Ecoli O111 B4，购自美国Sigma公司)10mg/kg体重注射至动物腹腔内，来模拟肠源 性内毒素症。未接受前述处理措施的动物以相应量的生理盐水替代注射。
, 百拇医药
1.2 实验分组
将75只大鼠采用随机表法分为A、B、C三组，每组25只。A组为AEP组，B组为AEP合并内毒素 血症组，即制备AEP后5h腹腔内再注入适量LPS；C组为单纯LPS处理组，系正常大鼠在同样时 点接受LPS腹腔内注射。各组的动物分别在第1次尾静脉注药后立即3，6，9和12h自下腔静脉 抽血处死各5只，取抗凝血分离血浆，胰腺和肺组织标本常规固定后石蜡包埋。
1.3 检测项目
1.3.1 血中TNF-α水平 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，试剂盒购自深 圳晶美生物工程有限公司，方法按操作说明。
1.3.2 肺组织内TNF-α的表达 取肺组织切片以免疫组织化学技术检测TNF -α的表达。抗大鼠TNF-α单克隆抗体来自第四军医大学病理学教研室，链亲和素-过氧化 物 酶连接法(简称SP法)染色系统购自美国Zymed公司。抗原修复采用高压锅法，一抗工作浓度 为1∶150，反应结束后以DAB显色，如细胞浆内出现较均匀的棕黄色颗粒，则为TNF-α表达 阳性。阴性对照组中将一抗换为PBS液。
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1.3.3 病理学检查 胰腺及肺组织切片行HE染色后，利用盲法由病理科医 师在光镜下观察其病理学改变。
1.4 数据处理
实验测定值以均数±标准差(
±s)表示，计量资料的比较主要采用t检验或 q检验，运用SPSS/PC+科研通用软件在计算机上完成。
2 结果
2.1 血TNF-α水平
附表 血中TNF-α水平测定结果 (±s，pg/ml ) 组别
时间(h)
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0
3
6
9
12
AEP
45.3±3.1
72.5±4.1
60.4±4.2
50.9±3.4
45.7±2.0
AEP+LPS
44.0±2.51)
, 百拇医药
76.1±8.71)
223.4±28.32)
95.6 ±15.42)
68.8±7.12)
LPS
43.4±4.31)
47.6±5.23)
162.4±20.54)
66.3±10 .04)
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注：1)与AEP组比较，t检验 P>0.05
2)与AEP组和LPS组比较，q检验 P<0.05
3)与AEP组和AEP+LPS组比较，t检验 P<0.05
4)与AEP组比较，q检验 P<0.05
2.2 肺组织内TNF-α的表达
正常或造成模型后立即处死的大鼠肺内无或偶见表达TNF-α的细胞。A组大鼠在造成AEP后3h 肺内浸润的单核巨噬细胞增多，部分呈TNF-α表达阳性，但随后这种表达很快减弱。B组大 鼠在制备AEP前提下接受LPS刺激后1～4h，肺组织中炎细胞数目更多，TNF-α的表达明显强 于A组，其中以单核巨噬细胞的阳性表达为主，少量中性粒细胞亦有染色。LPS处理后7h，B 组TNF-α的表达仍较强。C组大鼠单纯以LPS处理后4h，亦发现肺内出现TNF-α的明显表达， 稍高于A组，但较B组显著减少，且LPS处理后7h，TNF-α的表达基本回复正常水平。
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2.3 病理学检查
A组大鼠胰腺组织学变化符合典型的AEP表现；B组大鼠胰腺病变与A组相似，未发现确切的实 质出血和腺泡坏死；C组除少数大鼠出现胰腺轻度水肿外，其余胰腺无明显病变。肺组织学 检查显示A组大鼠在造成AEP后3～6h，肺间质轻度水肿增宽，中性粒细胞浸润增多，小血管 充血等，但肺泡腔渗出、出血不明显，并且9h以后肺病变逐渐消失。B组大鼠在制备AEP基础 上同时注射LPS后，在9和12h可见其肺间质大量炎细胞浸润，灶性出血，肺泡腔内明显渗出 、出血，其肺损伤程度显著重于单纯AEP组。C组大鼠在接受LPS注射后4h，肺间质也有明显 水肿及中性粒细胞浸润，肺泡腔内无出血及渗液，其损伤程度明显较B组大鼠为轻，再观察3 h上述病变稍有改善。
3 讨论
大多数重症急性胰腺炎(SAP)患者将发生明显的内毒素(ET)血症，而这种现象在轻症患者中 很少见，因此学者们认为内毒素血症可能与胰外器官的损害或MODS的发生有紧密的联系 [2，3]。 为进一步探讨ET血症在ANP时 细胞因子过度生成以及各脏器局部生成的情况。为进一步探讨ET血症在ANP时细胞因子过度 生成以及胰外器官(肺)损伤进程中的地位与作用机制，我们选择在开始 诱导AEP后5h向动物腹腔内注射LPS(10mg/kg体重)[9]，来模仿SAP患者发生的肠源 性ET血症，从而观察ET血症对以TNF-α为代表的细胞因子生成的影响。结果表明，正常大鼠 腹腔内注入LPS后可使其肺组织中炎细胞渗出明显增多，并出现TNF-α的明显表达，伴有血 中TNF-α含量显著增加，同时肺部出现轻度病理损害的表现，这与其他作者的研究结果相符 合[9]。在大鼠单纯诱导AEP后肺内亦出现一定程度的TNF-α表达，血中TNF-α含量 轻度增 加，但是此过程较为短暂，TNF-α的表达较快地回复基础水平，并且该组动物未并发明显的 肺组织损伤。如果在诱导AEP的前提下再合并ET血症的刺激，则不论肺组织内TNF-α的表达 还 是TNF-α在血中的水平均大幅度增加，明显超过单纯制备AEP或单纯LPS处理的两组动物。特 别值得注意的是，在这组动物存在明显肺部损害的病理学证据，从而提示罹患AP时机体对ET 的易感性增加，正常时机体可能耐受的ET血症将引发较严重的肺部损伤。
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在AP早期肺组织中TNF-α的表达上调可能系机体对胰腺炎症的一种全身反应，与ET 血症无关。这种反应在AEP时呈自限性，以代偿性抗炎反应综合征(CARS)为主，并不能导致 明显的肺损伤。相反，在ANP时炎症性细胞因子过度表达，全身炎症反应综合征(SIRS)占据 主导地位，可能与ET血症的出现有一定联系，但尚未获直接依据。本实验证实AP时，ET血症 确能通过诱导机体内TNF-α等炎症性细胞因子的过度生成并导致胰外器官损害，从而提示ET 血症可能在胰腺炎重症化及MODS发生发展过程中发挥重要作用。
参 考 文 献
1，张 刚，张肇达，刘续宝，等.实验性急性胰腺炎大鼠肺内肿瘤坏死因子α mRNA 的表达及其意义.华西医科大学学报，1999；30(4)：379
2，胡伟明，张肇达，田伯乐，等.重症胰腺炎血浆内毒素水平变化及临床意义.中国 普外基础与临床杂志，1999；6(6)：350
3，Windsor JA,Fearon KC,Ross JA,et al.Role of serum endotox in core antib ody levels in predicting the development of MOF in acute pancreatitis.Br J Surg, 1993;80(8):1042
4，邱海波，潘家绮，赵永强，等.内毒素诱导器官损伤中炎症性细胞因子的表达及 药物治疗探讨.中华医学杂志，1996；76(4)：254, 百拇医药
单位：张刚 杨训 刘洲 周晓辉 李德华(四川省人民医院肝胆外科成都 610072)；陈晓理(华西医科大学附属第一医院普外科张肇达)
关键词：急性胰腺炎；内毒素；肿瘤坏死因子；肺损伤
中国现代医学杂志000719 目的：急性坏死性胰腺炎(ANP)常继发内毒素(ET)血症，本研究拟探讨 ，ET血症在ANP并发肺损伤过程中的地位及作用机制。方法：将大鼠分3组，AEP组即制备急 性水肿性胰腺炎模型；AEP+LPS组即诱导AEP后再以LPS行腹腔注射来模拟肠源性ET血症；LPS 组动物单纯接受LPS处理。在预定时点测定动物血浆TNF-α含量，并以免疫组化技术检测肺 组织中TNF-α的表达。结果：正常动物以LPS处理后肺内出现TNF-α的明显表达，血中TNF- α含量显著增加，伴有轻度肺损害的表现。AEP组动物肺组织中也有一定程度TNF-α的表达 ，如果再合并ET血症，则TNF-α的生成大大增加，同时出现严重的肺损伤。结论：急性胰腺 炎时ET血症可以通过诱导肺内TNF-α等炎症性细胞因子的过度表达而导致肺损伤。研究还提 示ET血症可能在启动SIRS/MODS及腺胰炎重症化进程中发挥重要作用。
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分类号 R756
我们拟利用急性水肿性胰腺炎(AEP)合并内毒素血症的动物模型 ，探讨内毒素血症在ANP并发肺损伤过程中的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物与模型制备
成年健康Sprague-Dawley大鼠(雌雄不限，体重250～300g)共75只由华西医科大学实验动物 中心提供。自大鼠尾静脉注入蛙皮素(Sigma,美国)10μg/kg体重，1h后重复注射1次，制备 急性水肿性胰腺炎(AEP)模型[1]。在第1次注射蛙皮素后5h以脂多糖(LPS，Ecoli O111 B4，购自美国Sigma公司)10mg/kg体重注射至动物腹腔内，来模拟肠源 性内毒素症。未接受前述处理措施的动物以相应量的生理盐水替代注射。
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1.2 实验分组
将75只大鼠采用随机表法分为A、B、C三组，每组25只。A组为AEP组，B组为AEP合并内毒素 血症组，即制备AEP后5h腹腔内再注入适量LPS；C组为单纯LPS处理组，系正常大鼠在同样时 点接受LPS腹腔内注射。各组的动物分别在第1次尾静脉注药后立即3，6，9和12h自下腔静脉 抽血处死各5只，取抗凝血分离血浆，胰腺和肺组织标本常规固定后石蜡包埋。
1.3 检测项目
1.3.1 血中TNF-α水平 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，试剂盒购自深 圳晶美生物工程有限公司，方法按操作说明。
1.3.2 肺组织内TNF-α的表达 取肺组织切片以免疫组织化学技术检测TNF -α的表达。抗大鼠TNF-α单克隆抗体来自第四军医大学病理学教研室，链亲和素-过氧化 物 酶连接法(简称SP法)染色系统购自美国Zymed公司。抗原修复采用高压锅法，一抗工作浓度 为1∶150，反应结束后以DAB显色，如细胞浆内出现较均匀的棕黄色颗粒，则为TNF-α表达 阳性。阴性对照组中将一抗换为PBS液。
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1.3.3 病理学检查 胰腺及肺组织切片行HE染色后，利用盲法由病理科医 师在光镜下观察其病理学改变。
1.4 数据处理
实验测定值以均数±标准差(
±s)表示，计量资料的比较主要采用t检验或 q检验，运用SPSS/PC+科研通用软件在计算机上完成。2 结果
2.1 血TNF-α水平
附表 血中TNF-α水平测定结果 (
±s，pg/ml ) 组别时间(h)
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0
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6
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12
AEP
45.3±3.1
72.5±4.1
60.4±4.2
50.9±3.4
45.7±2.0
AEP+LPS
44.0±2.51)
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76.1±8.71)
223.4±28.32)
95.6 ±15.42)
68.8±7.12)
LPS
43.4±4.31)
47.6±5.23)
162.4±20.54)
66.3±10 .04)
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注：1)与AEP组比较，t检验 P>0.05
2)与AEP组和LPS组比较，q检验 P<0.05
3)与AEP组和AEP+LPS组比较，t检验 P<0.05
4)与AEP组比较，q检验 P<0.05
2.2 肺组织内TNF-α的表达
正常或造成模型后立即处死的大鼠肺内无或偶见表达TNF-α的细胞。A组大鼠在造成AEP后3h 肺内浸润的单核巨噬细胞增多，部分呈TNF-α表达阳性，但随后这种表达很快减弱。B组大 鼠在制备AEP前提下接受LPS刺激后1～4h，肺组织中炎细胞数目更多，TNF-α的表达明显强 于A组，其中以单核巨噬细胞的阳性表达为主，少量中性粒细胞亦有染色。LPS处理后7h，B 组TNF-α的表达仍较强。C组大鼠单纯以LPS处理后4h，亦发现肺内出现TNF-α的明显表达， 稍高于A组，但较B组显著减少，且LPS处理后7h，TNF-α的表达基本回复正常水平。
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2.3 病理学检查
A组大鼠胰腺组织学变化符合典型的AEP表现；B组大鼠胰腺病变与A组相似，未发现确切的实 质出血和腺泡坏死；C组除少数大鼠出现胰腺轻度水肿外，其余胰腺无明显病变。肺组织学 检查显示A组大鼠在造成AEP后3～6h，肺间质轻度水肿增宽，中性粒细胞浸润增多，小血管 充血等，但肺泡腔渗出、出血不明显，并且9h以后肺病变逐渐消失。B组大鼠在制备AEP基础 上同时注射LPS后，在9和12h可见其肺间质大量炎细胞浸润，灶性出血，肺泡腔内明显渗出 、出血，其肺损伤程度显著重于单纯AEP组。C组大鼠在接受LPS注射后4h，肺间质也有明显 水肿及中性粒细胞浸润，肺泡腔内无出血及渗液，其损伤程度明显较B组大鼠为轻，再观察3 h上述病变稍有改善。
3 讨论
大多数重症急性胰腺炎(SAP)患者将发生明显的内毒素(ET)血症，而这种现象在轻症患者中 很少见，因此学者们认为内毒素血症可能与胰外器官的损害或MODS的发生有紧密的联系 [2，3]。 为进一步探讨ET血症在ANP时 细胞因子过度生成以及各脏器局部生成的情况。为进一步探讨ET血症在ANP时细胞因子过度 生成以及胰外器官(肺)损伤进程中的地位与作用机制，我们选择在开始 诱导AEP后5h向动物腹腔内注射LPS(10mg/kg体重)[9]，来模仿SAP患者发生的肠源 性ET血症，从而观察ET血症对以TNF-α为代表的细胞因子生成的影响。结果表明，正常大鼠 腹腔内注入LPS后可使其肺组织中炎细胞渗出明显增多，并出现TNF-α的明显表达，伴有血 中TNF-α含量显著增加，同时肺部出现轻度病理损害的表现，这与其他作者的研究结果相符 合[9]。在大鼠单纯诱导AEP后肺内亦出现一定程度的TNF-α表达，血中TNF-α含量 轻度增 加，但是此过程较为短暂，TNF-α的表达较快地回复基础水平，并且该组动物未并发明显的 肺组织损伤。如果在诱导AEP的前提下再合并ET血症的刺激，则不论肺组织内TNF-α的表达 还 是TNF-α在血中的水平均大幅度增加，明显超过单纯制备AEP或单纯LPS处理的两组动物。特 别值得注意的是，在这组动物存在明显肺部损害的病理学证据，从而提示罹患AP时机体对ET 的易感性增加，正常时机体可能耐受的ET血症将引发较严重的肺部损伤。
, http://www.100md.com
在AP早期肺组织中TNF-α的表达上调可能系机体对胰腺炎症的一种全身反应，与ET 血症无关。这种反应在AEP时呈自限性，以代偿性抗炎反应综合征(CARS)为主，并不能导致 明显的肺损伤。相反，在ANP时炎症性细胞因子过度表达，全身炎症反应综合征(SIRS)占据 主导地位，可能与ET血症的出现有一定联系，但尚未获直接依据。本实验证实AP时，ET血症 确能通过诱导机体内TNF-α等炎症性细胞因子的过度生成并导致胰外器官损害，从而提示ET 血症可能在胰腺炎重症化及MODS发生发展过程中发挥重要作用。
参 考 文 献
1，张 刚，张肇达，刘续宝，等.实验性急性胰腺炎大鼠肺内肿瘤坏死因子α mRNA 的表达及其意义.华西医科大学学报，1999；30(4)：379
2，胡伟明，张肇达，田伯乐，等.重症胰腺炎血浆内毒素水平变化及临床意义.中国 普外基础与临床杂志，1999；6(6)：350
3，Windsor JA,Fearon KC,Ross JA,et al.Role of serum endotox in core antib ody levels in predicting the development of MOF in acute pancreatitis.Br J Surg, 1993;80(8):1042
4，邱海波，潘家绮，赵永强，等.内毒素诱导器官损伤中炎症性细胞因子的表达及 药物治疗探讨.中华医学杂志，1996；76(4)：254, 百拇医药