吉林地区正常汉族人群载脂蛋白E基因多态性分布状态的研究
作者：刘华欣 曹丽春 罗正里 黄晶波 任 旷 王承志 王吉伟
单位：刘华欣 曹丽春 罗正里 黄晶波 任 旷 王承志(第四军医大学吉林军医学院132013)；王吉伟(湖南医科大学分子生物学研究中心410018)
关键词：ApoE基因；基因多态性；基因型；等位基因
中国现代医学杂志000712 目的：研究载脂蛋白(Apo)E基因多态性在吉林地区正常汉族人群中的分 布状态。方法：应用聚合酶链反应——限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法先扩增出ApoE 基因第4外显子内的227bp片段，继以限制性切酶Cfol酶解消化，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，最 后银染显带判定基因型，并计算等位基因频率。结果：本实验共检测分析了206例吉林地区 正常汉族人的ApoE基因型及等位基因频率。结果表明纯合子ε3/3基因型频率及ε 3等位基因频率最高。ε2高于ε4。且ε2随年龄增长有增加趋势。结论：该方法 快速、准确，分辨率高。ApoE基因多态性分布的研究为ApoE生理功能的研究及进一步临床应 用打下基础。
, http://www.100md.com
分类号 Q343
DISTRIBUTION OF APOLIPOPROTEIN E GENE POLYMORPHISM IN
NORMAL HAN NATIONALITYPOPULATION OF JILIN DISTRICT
Liu Huaxin, Huang Jingbo, Ren Kuang, et al.
(The Fourth Military Medical University, Jilin Military Medical College, Jilin 13 2013)
Wang Jiwei
(Research Center of Molecular Biology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
, 百拇医药
[Abstract] Objective: To study the distribution of Apolipop rotein E gene polymor phism in normal Han nationality population of Jilin district. Methods: The polym erase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technig ue was used to amplify 227 base-pair DNA fragments in the fourth exon of Apo E g ene and to digest them with restriction endonuclease CfoI. Then, electrophoresis on 8% polyacrylamid gel for the cleavaged products was carried out. Subsequentl y their genotypes were determined by silver staining and allele frequencies were calculated. Results: In 206 healthy individuals of Han ethnicgr oup, the frequen cies of homozygous genotype ε3/3 andε3 allele were the highest, ε2 allele fre quency was higher than that ofε4 andε2 allele frequency tends to increase with the group-ages. Conclusions: This method is rapid and precise, showing high dis criminating rate. Study on the distribution of Apolipoprotein E gene polymorphis m would play an important role for the research of ApoE physiological function a nd further clinical application.
, 百拇医药
Key words: ApoE gene; Gene Polymorphism; Genotype Allele
ApoE基因位于第19号染色体上，与ApoE CI及CII紧密连锁。该基因第4 外显子内编码第112位氨基酸及第158位氨基酸的密码子具有多态性，可产生三种常见的等位 基因：ε2，ε3及ε4。近年来关于ApoE基因多态性与心脑血管疾病的相关性研究越 来越受到人们的关注，并取得一定的进展。因此，我们采用聚合酶链反应——限制性片段 长度多态性(PCR-RFLP)方法检测ApoE基因多态性，并探讨ApoE基因多态性在吉林地区正常汉 族人群中的分布状态。
1 对象与方法
1.1 研究对象
随机选择206名体检健康个体，其中男105例，女101例，年龄30～78岁，平均年龄(55.1±6 .8)岁。所选研究对象均为吉林地区无血缘关系的汉族人，经相关检查排除心脑血管疾病及 肝、肾和内分泌等影响脂类代谢的疾病。
, 百拇医药
1.2 主要试剂
Cfol内切酶为Boehringer Mannheim产品，Taq DNA聚合酶及4种脱氧核糖核酸(dNTP)为Prome ga产品，其余试剂均为分析纯。
1.3 研究方法
1.3.1 基因组DNA提取 主要依照文献[1]方法，提取样本外周血 基因组DNA作为PCR扩增模板，引物上游序列为：5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’，引物 下游序列为5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3’，由上海细胞所合成。
1.3.2 PCR扩增及Cfol内切酶消化 PCR扩增在20μl反应体系中进行，其中 包括基因组DNA 200ng，引物各10pmol/L，4×dNTP各100μmol/L，氯化镁2.5mol/L，二甲基 亚砜10%(V/V)，Taq DNA聚合酶1U，并加入1滴矿物油覆盖反应物。然后进行95℃35s变性，6 0℃35s退火，70℃60s延伸，共计30个循环，最后72℃延伸10min。
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限制性酶切反应也在20μl体系中进行，其中包括PCR反应产物12μl，Cfol内切酶8U(10U/μ l)，轻轻混匀后置于37℃消化过夜，消化产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(交联度29∶1)。
1.3.3 银染 电泳后将凝胶用蒸馏水冲洗2～3次，再置于含10%乙醇和0.5% 冰乙酸的固定液中固定10min，然后用蒸馏水冲洗1～2次，用0.2%硝酸银染色8min。再用蒸 馏水冲洗凝胶数次，以显色液还原银颗粒，直至条带清晰。根据电泳图谱进行ApoE基因分型 。
1.4 统计方法
基因频率采用基因计算法计算。基因型或等位基因频率的比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 ApoE基因多态性分布状态
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不同年龄组别的ApoE基因型频率和等位基因频率分布见表1，不同性别的ApoE基因型频率和 等位基因频率分布见表2。
表1 不同年龄组别的ApoE基因型频率和等位基因频率分布 (%) 年龄
例数
ApoE基因型频率
ApoE等位基因频率
ε2/2
ε3/2
ε4/2
ε3/3
ε4/3
, 百拇医药
ε4/4
ε2
ε3
ε4
30～40
49
0
12.2
0
75.5
10.2
2.0
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6.1
86.7
7.1
41～50
44
0
13.6
2.3
72.7
9.1
2.3
8.0
84.1
, http://www.100md.com
8.0
51～60
41
0
12.2
0
78.0
9.8
0
6.1
89.0
4.9
61～70
, 百拇医药
37
0
10.8
5.4
78.3
5.4
0
8.1
86.4
5.4
71～78
35
0
, 百拇医药 14.3
5.7
77.1
2.9
0
10.0
85.7
4.3
表2 不同性别的ApoE基因型频率和等位基因频率分布 (%) 性别
例数
ApoE基因型频率(%)
ApoE等位基因频率
, 百拇医药
ε2/2
ε3/2
ε4/2
ε3/3
ε4/3
ε4/4
ε2
ε3
ε4
男
105
, http://www.100md.com
0
13.3
2.8
74.2
7.6
1.9
8.1
84.7
7.1
女
101
0
13.9
, 百拇医药
1.9
75.3
8.9
0
7.9
86.7
5.4
总计
206
0
13.6
2.4
74.8
, 百拇医药
8.2
1.0
8.0
85.7
6.3
由表1可见，纯合子ε3/3基因型占吉林地区正常汉族人群中的比例最大 ，ε3等位基因频率最高，在任何一组别中ε2等位基因频率均高于ε4且ε2等位基 因频率随年龄增长在增加趋势。从表2中可以的看出ε2等位基因频率高于ε4，经统计 学处理男女间ApoE等位基因分布差异无显著性(P>0.05)。
2.2 检测结果与其他文献报道比较
, 百拇医药
本实验与其他文献报道比较见表3。表3 本实验与其他文献报道ApoE基因等位基因频率比较(%) 例数
等位基因频率(%)
ε2
ε3
ε4
1041[2]
6.6
8.13
11.9
640[3]
, 百拇医药 8.7
73.8
17.5
113[4]
9.3
83.2
7.5
206(本实验)
8.0
85.7
6.3
从表3中可见本实验检测的ApoE等位基因频率ε3与多数报道的结果相似 。3 讨论
, 百拇医药
1994年，Schachter[5]等首次报导了百岁老人的ε2等位基因频率同对照组相比 具有显著增加。随后有文献[6]加以证实，并发现ε2等位基因频率随年龄的增 大而增加，认为ε2等位基因与健康长寿有关。
PCR-RFLP方法是研究ApoE基因最为简便的基因方法，无需测序和杂交，最适于大范围的人群 检测及临床实验室的广泛开展。我们所用引物特异扩增出227bp的NDA片段，经Cfol酶切后产 生2～4条特异条带，易于判断分型，同时采用了灵敏的银染色技术，提高了实验中DNA的分 辨率。由于严格控制染色及显色时间，降低了银染色本底较高的缺点，获得了准确的分型结 果。通过PCR-RLLP方法对所选定的吉林地区正常汉族人群进行检查，所得结果支持了上述文 献报导。
ApoE与低密度脂蛋白(LDL)受体、肝脂蛋白残余物受体 、LDL受体相关蛋白以及可能由肝脏脂肪酶诱导的蛋白聚糖相联接。ε2编码的异构体ApoE 2与上述受体亲和力很低，而ε4编码的异构体ApoE4编码的异构体ApoE2与上述受 体的亲和力很高。人们认为含有ε2等位基因的个体，其乳糜粒残骸从血浆移走缓慢，诱 导肝LDL受体调节过度，致使血浆中的总胆固醇及LDL-相关胆固醇浓度变低。而携带ε4等 位 基因的个体，则与上述作用相反，反馈性调节引起血浆中总胆固醇及LDL-相关胆固醇浓度变 高。有人研究发现ε4等位基因与血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和ApoE水平增加呈 显著的正相关[4]。因此，人们推测ε2等位基因与健康长寿有关，是通过促进 人体低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)浓度的降低而起到保护性作用，但其具体机制仍不明确。 另外 ，在不同人群中ApoE等位基因频率分布也有所不同，而影响其在不同人群间分布差异的原因 也仍需进一步研究探讨。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Hixon JE,Vernier DJ.Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene apmlication and cleavage with Hhal.J Lipid Res,1990;31:545～548
2，Lahoz C,Osgood D,Wilson PWF,et al.Frequency ofphenotype genotype discr epancies at the apolipoprotein E locus in a large population study.Clin Chem,199 6;42(11):1817
3，Hanse PS,Gerdes Lu,Klausen IC,et al.Genotyping ompared with protein ph enotyping of the common apolipoprotein E polymorphism.Chim Acta,1994;224:131
, 百拇医药
4，鄢盛恺，周 新，哈黛文.汉族人载脂蛋白E基因多态性对血脂、载脂蛋白和脂蛋 白(α)水平的影响.基础医学与临床，1998；18(1)：48～51
5，Schachter F,Faure-Dland FL,Guenot F,et al.Genetic associations with hu man longevity at the apoE and ACE loci.Nat Genet,1994;6:29～32
6，Louhija J,Miettinen HE,Tikkanen MJ,et al.Aging and genetic variation o f plasma apolipoprotein relative loss of the aploipoprotein ε4.phenotype in centenarians.Arterioscler Thromb,1994;14:1084～1089, http://www.100md.com
单位：刘华欣 曹丽春 罗正里 黄晶波 任 旷 王承志(第四军医大学吉林军医学院132013)；王吉伟(湖南医科大学分子生物学研究中心410018)
关键词：ApoE基因；基因多态性；基因型；等位基因
中国现代医学杂志000712 目的：研究载脂蛋白(Apo)E基因多态性在吉林地区正常汉族人群中的分 布状态。方法：应用聚合酶链反应——限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法先扩增出ApoE 基因第4外显子内的227bp片段，继以限制性切酶Cfol酶解消化，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，最 后银染显带判定基因型，并计算等位基因频率。结果：本实验共检测分析了206例吉林地区 正常汉族人的ApoE基因型及等位基因频率。结果表明纯合子ε3/3基因型频率及ε 3等位基因频率最高。ε2高于ε4。且ε2随年龄增长有增加趋势。结论：该方法 快速、准确，分辨率高。ApoE基因多态性分布的研究为ApoE生理功能的研究及进一步临床应 用打下基础。
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分类号 Q343
DISTRIBUTION OF APOLIPOPROTEIN E GENE POLYMORPHISM IN
NORMAL HAN NATIONALITYPOPULATION OF JILIN DISTRICT
Liu Huaxin, Huang Jingbo, Ren Kuang, et al.
(The Fourth Military Medical University, Jilin Military Medical College, Jilin 13 2013)
Wang Jiwei
(Research Center of Molecular Biology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
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[Abstract] Objective: To study the distribution of Apolipop rotein E gene polymor phism in normal Han nationality population of Jilin district. Methods: The polym erase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technig ue was used to amplify 227 base-pair DNA fragments in the fourth exon of Apo E g ene and to digest them with restriction endonuclease CfoI. Then, electrophoresis on 8% polyacrylamid gel for the cleavaged products was carried out. Subsequentl y their genotypes were determined by silver staining and allele frequencies were calculated. Results: In 206 healthy individuals of Han ethnicgr oup, the frequen cies of homozygous genotype ε3/3 andε3 allele were the highest, ε2 allele fre quency was higher than that ofε4 andε2 allele frequency tends to increase with the group-ages. Conclusions: This method is rapid and precise, showing high dis criminating rate. Study on the distribution of Apolipoprotein E gene polymorphis m would play an important role for the research of ApoE physiological function a nd further clinical application.
, 百拇医药
Key words: ApoE gene; Gene Polymorphism; Genotype Allele
ApoE基因位于第19号染色体上，与ApoE CI及CII紧密连锁。该基因第4 外显子内编码第112位氨基酸及第158位氨基酸的密码子具有多态性，可产生三种常见的等位 基因：ε2，ε3及ε4。近年来关于ApoE基因多态性与心脑血管疾病的相关性研究越 来越受到人们的关注，并取得一定的进展。因此，我们采用聚合酶链反应——限制性片段 长度多态性(PCR-RFLP)方法检测ApoE基因多态性，并探讨ApoE基因多态性在吉林地区正常汉 族人群中的分布状态。
1 对象与方法
1.1 研究对象
随机选择206名体检健康个体，其中男105例，女101例，年龄30～78岁，平均年龄(55.1±6 .8)岁。所选研究对象均为吉林地区无血缘关系的汉族人，经相关检查排除心脑血管疾病及 肝、肾和内分泌等影响脂类代谢的疾病。
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1.2 主要试剂
Cfol内切酶为Boehringer Mannheim产品，Taq DNA聚合酶及4种脱氧核糖核酸(dNTP)为Prome ga产品，其余试剂均为分析纯。
1.3 研究方法
1.3.1 基因组DNA提取 主要依照文献[1]方法，提取样本外周血 基因组DNA作为PCR扩增模板，引物上游序列为：5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’，引物 下游序列为5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3’，由上海细胞所合成。
1.3.2 PCR扩增及Cfol内切酶消化 PCR扩增在20μl反应体系中进行，其中 包括基因组DNA 200ng，引物各10pmol/L，4×dNTP各100μmol/L，氯化镁2.5mol/L，二甲基 亚砜10%(V/V)，Taq DNA聚合酶1U，并加入1滴矿物油覆盖反应物。然后进行95℃35s变性，6 0℃35s退火，70℃60s延伸，共计30个循环，最后72℃延伸10min。
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限制性酶切反应也在20μl体系中进行，其中包括PCR反应产物12μl，Cfol内切酶8U(10U/μ l)，轻轻混匀后置于37℃消化过夜，消化产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(交联度29∶1)。
1.3.3 银染 电泳后将凝胶用蒸馏水冲洗2～3次，再置于含10%乙醇和0.5% 冰乙酸的固定液中固定10min，然后用蒸馏水冲洗1～2次，用0.2%硝酸银染色8min。再用蒸 馏水冲洗凝胶数次，以显色液还原银颗粒，直至条带清晰。根据电泳图谱进行ApoE基因分型 。
1.4 统计方法
基因频率采用基因计算法计算。基因型或等位基因频率的比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 ApoE基因多态性分布状态
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不同年龄组别的ApoE基因型频率和等位基因频率分布见表1，不同性别的ApoE基因型频率和 等位基因频率分布见表2。
表1 不同年龄组别的ApoE基因型频率和等位基因频率分布 (%) 年龄
例数
ApoE基因型频率
ApoE等位基因频率
ε2/2
ε3/2
ε4/2
ε3/3
ε4/3
, 百拇医药
ε4/4
ε2
ε3
ε4
30～40
49
0
12.2
0
75.5
10.2
2.0
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6.1
86.7
7.1
41～50
44
0
13.6
2.3
72.7
9.1
2.3
8.0
84.1
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8.0
51～60
41
0
12.2
0
78.0
9.8
0
6.1
89.0
4.9
61～70
, 百拇医药
37
0
10.8
5.4
78.3
5.4
0
8.1
86.4
5.4
71～78
35
0
, 百拇医药 14.3
5.7
77.1
2.9
0
10.0
85.7
4.3
表2 不同性别的ApoE基因型频率和等位基因频率分布 (%) 性别
例数
ApoE基因型频率(%)
ApoE等位基因频率
, 百拇医药
ε2/2
ε3/2
ε4/2
ε3/3
ε4/3
ε4/4
ε2
ε3
ε4
男
105
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0
13.3
2.8
74.2
7.6
1.9
8.1
84.7
7.1
女
101
0
13.9
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1.9
75.3
8.9
0
7.9
86.7
5.4
总计
206
0
13.6
2.4
74.8
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8.2
1.0
8.0
85.7
6.3
由表1可见，纯合子ε3/3基因型占吉林地区正常汉族人群中的比例最大 ，ε3等位基因频率最高，在任何一组别中ε2等位基因频率均高于ε4且ε2等位基 因频率随年龄增长在增加趋势。从表2中可以的看出ε2等位基因频率高于ε4，经统计 学处理男女间ApoE等位基因分布差异无显著性(P>0.05)。
2.2 检测结果与其他文献报道比较
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本实验与其他文献报道比较见表3。表3 本实验与其他文献报道ApoE基因等位基因频率比较(%) 例数
等位基因频率(%)
ε2
ε3
ε4
1041[2]
6.6
8.13
11.9
640[3]
, 百拇医药 8.7
73.8
17.5
113[4]
9.3
83.2
7.5
206(本实验)
8.0
85.7
6.3
从表3中可见本实验检测的ApoE等位基因频率ε3与多数报道的结果相似 。3 讨论
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1994年，Schachter[5]等首次报导了百岁老人的ε2等位基因频率同对照组相比 具有显著增加。随后有文献[6]加以证实，并发现ε2等位基因频率随年龄的增 大而增加，认为ε2等位基因与健康长寿有关。
PCR-RFLP方法是研究ApoE基因最为简便的基因方法，无需测序和杂交，最适于大范围的人群 检测及临床实验室的广泛开展。我们所用引物特异扩增出227bp的NDA片段，经Cfol酶切后产 生2～4条特异条带，易于判断分型，同时采用了灵敏的银染色技术，提高了实验中DNA的分 辨率。由于严格控制染色及显色时间，降低了银染色本底较高的缺点，获得了准确的分型结 果。通过PCR-RLLP方法对所选定的吉林地区正常汉族人群进行检查，所得结果支持了上述文 献报导。
ApoE与低密度脂蛋白(LDL)受体、肝脂蛋白残余物受体 、LDL受体相关蛋白以及可能由肝脏脂肪酶诱导的蛋白聚糖相联接。ε2编码的异构体ApoE 2与上述受体亲和力很低，而ε4编码的异构体ApoE4编码的异构体ApoE2与上述受 体的亲和力很高。人们认为含有ε2等位基因的个体，其乳糜粒残骸从血浆移走缓慢，诱 导肝LDL受体调节过度，致使血浆中的总胆固醇及LDL-相关胆固醇浓度变低。而携带ε4等 位 基因的个体，则与上述作用相反，反馈性调节引起血浆中总胆固醇及LDL-相关胆固醇浓度变 高。有人研究发现ε4等位基因与血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和ApoE水平增加呈 显著的正相关[4]。因此，人们推测ε2等位基因与健康长寿有关，是通过促进 人体低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)浓度的降低而起到保护性作用，但其具体机制仍不明确。 另外 ，在不同人群中ApoE等位基因频率分布也有所不同，而影响其在不同人群间分布差异的原因 也仍需进一步研究探讨。
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参 考 文 献
1，Hixon JE,Vernier DJ.Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene apmlication and cleavage with Hhal.J Lipid Res,1990;31:545～548
2，Lahoz C,Osgood D,Wilson PWF,et al.Frequency ofphenotype genotype discr epancies at the apolipoprotein E locus in a large population study.Clin Chem,199 6;42(11):1817
3，Hanse PS,Gerdes Lu,Klausen IC,et al.Genotyping ompared with protein ph enotyping of the common apolipoprotein E polymorphism.Chim Acta,1994;224:131
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4，鄢盛恺，周 新，哈黛文.汉族人载脂蛋白E基因多态性对血脂、载脂蛋白和脂蛋 白(α)水平的影响.基础医学与临床，1998；18(1)：48～51
5，Schachter F,Faure-Dland FL,Guenot F,et al.Genetic associations with hu man longevity at the apoE and ACE loci.Nat Genet,1994;6:29～32
6，Louhija J,Miettinen HE,Tikkanen MJ,et al.Aging and genetic variation o f plasma apolipoprotein relative loss of the aploipoprotein ε4.phenotype in centenarians.Arterioscler Thromb,1994;14:1084～1089, http://www.100md.com