肝素疗法对肾小球肾炎患者血小板活化状态的影响及其临床意义
作者：李宏向 张纪芸 夏伟 李秋环
单位：李宏向 张纪芸(济南军区总医院儿科250031)；夏伟 李秋环(山东医科大学附属医院)
关键词：肾小球肾炎；肝素；血小板
中国现代医学杂志000708 目的：探讨肝素疗法对不同病理类型肾小球肾炎患者血小板活化状态 的影响。方法：用全自动血细胞分析仪测定患者血小板计数、体积和分布宽度，用流式细胞 技术测定患者血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平。结果：95例肾小球肾炎肝素疗法病 人 发生肝素诱导性血小板减少症4你，发病率4.2%。肝素疗法对MC病人血小板计数、体积、分 布宽度，血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平无显著影响(P>0.05)，部分GS、MN、 PGN病人血小板计数减少(P<0.01)，体积增大(P<0.01)，分布宽度超过正常值，G S、MN、PGN病人血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平显著高于肝素疗法前表达水平(P <0.01)；HIT病人血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平是无HIT病人的2～3倍。结论： 肾小球肾炎肝素疗法可使部分GS、MN、PGN病人血小板活化，导致血小板破坏增加和血小板- 纤维蛋白原微栓子形成。
, 百拇医药
分类号 R558
EFFECT OF HEPARIN THERAPY ON THE PLATELET ACTIVATION
IN THE PATIENTS WITH GLOMERULONEPHRITIS
Li Hongxiang, Zhang Jiyuen, Xia Wei, et al.
(Pediatric Department, Jinan General Military Hospital, Jinan 250031)
[Abstract] Objective: To study the effect of heparin therap y (HT) on the state o f platelet activation in patients with varied pathologic types of glomerulonephr itis. Methods: We tested platelet counts (PC), mean platelet vol ume (MPV) and pl atelet distribution width (PDW) by automatic blood cell analytic apparatus and d etected the expressive levels of CD62p, CD63 and CD41 on the surfaces of platele ts in the patients. Results: There are four cases suffered from heparin-induced thrombocytopenia (HIT) and the incidence of HIT was 4.2 percent. There were not the effect of HT on the PC, MPV PDW and the expressive levels of CD62p, CD63 and CD41 in the patients with minimal change (MC). However, HT led to PC decreasing , MPV enlarging and PDW exceeding normal value in the patients with glomeruloscl erosis (GS), membranous nephropathy (MN) or proliferative glomerulonephritis (PG N), and the expressive levels of CD62p, CD63 and CD41 on the surfaces of platele ts are significantly elevated than those before HT in those patients. The patien ts with HIT were two to three times the expressive levels of CD62, CD63 and CD41 of the patients without HIT. Conclusions: HT could cause the pl atelet activatio n in the patients with GS, MN or PGN, resulting in increased removal of activate d platelet and formation of platelet-fibrinogen mincroembolus.
, 百拇医药
Key words: Glomerulonephritis; Heparin; Platelet
本文对 接受肝素疗法的肾小球肾炎患者外周血小板计数、体积、分布宽度，血小板表面CD62P、CD6 3和CD41表达水平进行测定，初步探讨肝素疗法对不同病理类型肾炎患者血小板活化状态的 影响及其临床意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象
研究对象的入选条件：原发性肾小球疾病并经肾组织病理分型；肾功能正常(包括肌酐清除 率正常，浓缩-稀释功能正常)；肝素疗法前2周及治疗中无类固醇，免疫抑制及其它抗血小 板药物应用史，无输血及其它血制品应用；无出血性疾病等血液系统疾病。符合上述条件者 95例，男56例，女39例，年龄8～13岁。根据病理类型将治疗对象分为微小病变(MC)10例， 肾小球硬化(GS)30例，膜性肾病(MN)20例，增殖性肾小球肾炎(PGN，包括系膜增殖性肾小球 肾炎13例，膜增殖性肾小球肾炎22例)35例。按年龄、性别匹配，选定正常对照组47例。
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1.2 方法
肝素疗法(HT)普通肝素100Iu/kg/d(1mg=125Iu)加葡萄糖液内静滴，1次/d，连续静滴10d为1 疗程[1]。
血小板指标测定于HT前1d(治疗前)及HT第10天(治疗后)分别取静脉血1ml加入特制试管内，1 5% EDTA-K210ul抗凝，充分混匀，用美国Beckman公司生产的coulter-ONYX型全自动细胞分析仪 测定血小板计数，体积、分布宽度，变异系数控制在5%以内。
1.3 血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平的测定
采用Bacton Dickemson公司流式细胞仪及软件。鼠抗人单克隆抗体CD62P-FITC、CD63-FITC( 异硫氰酸荧光素标记)，鼠抗人单克隆抗体CD41-PE(藻红蛋白标记)及阴性对照IgG1-FITC、I gG1-PE，均由法国国际免疫公司提供。
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治疗前、后分取静脉血2ml，2%EDTA 1∶9抗凝，800r/min，离心5min，取上层血清即为多血 小板血清(PS)，调整血小板数106ml，4℃保存时间不超过24h。取5支试管，均加PS100ul， 再分别加入CD62P-FITC、CD63-FITC、CD41-PE工作液及阴性对照IgG1-FITC、IgG1-PE工作液 20ul。室温避光30min，离心1?500r/min，10min，磷酸缓冲液(PBS)2ml漂洗，离心速度同 上，弃上清加PBS0.5ml，上机。上机前用标准荧光微球调整仪器，使变异系数稳定在2% 以内 。上机后收集1万个血小板，荧光强度以对数放大，在Macintosh650计算机上用Cell Quest Plot软件分析数据，打印结果。用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 HT对血小板计数、体积、分布宽度的影响
血小板计数减少10～50×109/L者：MC组4例，GS组8例，MN组8例，PGN组10例；50～10 0×109/L者：GS组17例，MN组9例，PGN组19例，HIT组4例，发病率4.2%；GS组2例， MN组1例，PGN组1例，见表1。
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2.2 HT对血小板表面CD62P、CD63和CD41表达的影响 见表2。
表1 HT对血小板计数、体积、分布宽度的影响 (x±s) 组别
例数
计数(10×109/L)
体积(fl)
分布宽度(%)
治疗前
治疗后
治疗前
治疗后
治疗前
, 百拇医药
治疗后
正常组
47
24.0±4.7169
7.74±0.4723
15.9±0.7478
MC组
10
23.7±5.021
21.9±4.39201)2)
7.75±0.6054
8.09 ±0.56121)2)
, 百拇医药
16.14±0.6946
16.47±0.6404
GS组
28
23.7±4.4044
18.9±4.04691)2)
7.89±0.6338
9.29 ±0.89071)2)
16.04±0.7122
18.1±0.8323
MN组
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19
23.2±4.8436
18.3±4.51771)2)
8.02±0.5606
9.23 ±1.01091)2)
16.20±0.6640
17.9±0.9671
PGN组
34
23.1±4.2144
18.9±3.06911)2)
, 百拇医药
7.94±0.5309
9.3 3±1.03481)2)
16.20±0.6468
18.4±0.7232
HIT组
4
24.2±5.0613
7.2±1.6021
7.84±0.6031
9.39±1.4241
16.0±0.5424
, 百拇医药
19.0±1.2423
注：1)治疗后与正常组比较P<0.01
2)治疗后与治疗前比较P<0.01 分布宽度正常值15%～17%表2 HT对血小板表面CD62P、CD63、CD41表达的影响 (
±s，%) 组别
例数
CD62P
CD63
CD41
治疗前
治疗后
治疗前
, 百拇医药
治疗后
治疗前
治疗后
正常组
32
0.98±0.2884
1.13±0.4439
1.24±0.5329
MC组
10
1.05±0.4278
1.14±0.45191)2)
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1.30±0.6924
1.39±0.68371)2)
1.32±0.6451
1.41±0.71011)2)
GS组
28
1.14±0.4192
2.49±1.24921)2)
1.29±0.7382
2. 73±1.58911)2)
, 百拇医药
1.38±0.7283
3.12±1.24041)2)
MN组
19
1.09±0.38353)
2.61±0.78531)2)
1.24±0.6231 3)
2.65±1.24101)2)
1.29±0.61633)
2.87±1.1156 1)2)
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PGN组
34
1.21±0.4195
2.67±0.84751)2)
1.34±0.6507
2. 94±1.32791)2)
1.43±0.7325
3.45±1.25701)2)
HIT组
4
1.15±0.5306
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5.84±1.9243
1.30±0.7256
4.96±2.4134
1.36±0.7432
6.04±2.8764
注：1)治疗后与正常组比较P<0.01
2)治疗后与治疗前比较P>0.01
3)治疗前与正常组比较P<0.05 3 讨论
反映血小板活化状态的直接指标是血小板表面 活化标志物CD 62P(又称GM P-140，血小板P选择素)和CD63(血小板活化因子)[2]。 本文发现HT对MC组病人血小板CD62P、CD63表达水平无影响，但可显著上调GS组，MN组、PG N 组部分病人血小板CD62P、CD63的表达，HIT组表达水平是以上各组的2～3倍，表明HT对MC组 病人血小板活化状态无影响，但可提高HIT病人及GS组、MN组、PGN组病人血小板活化程度。 这些结果提示HT对血小板活化状态的影响与肾小球肾炎病理类型有一定联系，HIT的发生取 决于HT血小板活化程度的高低。
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血小 板CD62P又可粘附中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和CD4+ CD8+T细胞，使白细胞在血栓内聚[3]。本研究发现MC组病人血小板CD41表 达正常，GS组、MN组、PGN组CD41表达增多，HIT的病人CD41表达水平是上述病人的2～3倍。 这提示HIT、MN、GS、PGN病人体内有血小板-纤维蛋白原微栓子的形成及在肾脏沉积，可能 对患儿造成不利影响。本组病人血小板计数减少，体积增大，分布宽度加大，均提示血小板 破坏增多，与CD62P、CD63、CD41上调相符。
参 考 文 献
1，吴瑞萍，胡亚美，江载芳.实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社，1996：16 44
2，Sedlmayr P,Muntean W.Flow cytometric detection of intracelluarplatel e tantigens.Cytometry,1996;23:284～289
3，Modderman PW,Vondem Borne AE,Sonnenberg A.P-Selectin mediates Ca 2+-dependent adhesion of activated platelets to many different types of leuk ocytes:detection by flow cytometry,1992;80:134～142, http://www.100md.com
单位：李宏向 张纪芸(济南军区总医院儿科250031)；夏伟 李秋环(山东医科大学附属医院)
关键词：肾小球肾炎；肝素；血小板
中国现代医学杂志000708 目的：探讨肝素疗法对不同病理类型肾小球肾炎患者血小板活化状态 的影响。方法：用全自动血细胞分析仪测定患者血小板计数、体积和分布宽度，用流式细胞 技术测定患者血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平。结果：95例肾小球肾炎肝素疗法病 人 发生肝素诱导性血小板减少症4你，发病率4.2%。肝素疗法对MC病人血小板计数、体积、分 布宽度，血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平无显著影响(P>0.05)，部分GS、MN、 PGN病人血小板计数减少(P<0.01)，体积增大(P<0.01)，分布宽度超过正常值，G S、MN、PGN病人血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平显著高于肝素疗法前表达水平(P <0.01)；HIT病人血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平是无HIT病人的2～3倍。结论： 肾小球肾炎肝素疗法可使部分GS、MN、PGN病人血小板活化，导致血小板破坏增加和血小板- 纤维蛋白原微栓子形成。
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分类号 R558
EFFECT OF HEPARIN THERAPY ON THE PLATELET ACTIVATION
IN THE PATIENTS WITH GLOMERULONEPHRITIS
Li Hongxiang, Zhang Jiyuen, Xia Wei, et al.
(Pediatric Department, Jinan General Military Hospital, Jinan 250031)
[Abstract] Objective: To study the effect of heparin therap y (HT) on the state o f platelet activation in patients with varied pathologic types of glomerulonephr itis. Methods: We tested platelet counts (PC), mean platelet vol ume (MPV) and pl atelet distribution width (PDW) by automatic blood cell analytic apparatus and d etected the expressive levels of CD62p, CD63 and CD41 on the surfaces of platele ts in the patients. Results: There are four cases suffered from heparin-induced thrombocytopenia (HIT) and the incidence of HIT was 4.2 percent. There were not the effect of HT on the PC, MPV PDW and the expressive levels of CD62p, CD63 and CD41 in the patients with minimal change (MC). However, HT led to PC decreasing , MPV enlarging and PDW exceeding normal value in the patients with glomeruloscl erosis (GS), membranous nephropathy (MN) or proliferative glomerulonephritis (PG N), and the expressive levels of CD62p, CD63 and CD41 on the surfaces of platele ts are significantly elevated than those before HT in those patients. The patien ts with HIT were two to three times the expressive levels of CD62, CD63 and CD41 of the patients without HIT. Conclusions: HT could cause the pl atelet activatio n in the patients with GS, MN or PGN, resulting in increased removal of activate d platelet and formation of platelet-fibrinogen mincroembolus.
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Key words: Glomerulonephritis; Heparin; Platelet
本文对 接受肝素疗法的肾小球肾炎患者外周血小板计数、体积、分布宽度，血小板表面CD62P、CD6 3和CD41表达水平进行测定，初步探讨肝素疗法对不同病理类型肾炎患者血小板活化状态的 影响及其临床意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象
研究对象的入选条件：原发性肾小球疾病并经肾组织病理分型；肾功能正常(包括肌酐清除 率正常，浓缩-稀释功能正常)；肝素疗法前2周及治疗中无类固醇，免疫抑制及其它抗血小 板药物应用史，无输血及其它血制品应用；无出血性疾病等血液系统疾病。符合上述条件者 95例，男56例，女39例，年龄8～13岁。根据病理类型将治疗对象分为微小病变(MC)10例， 肾小球硬化(GS)30例，膜性肾病(MN)20例，增殖性肾小球肾炎(PGN，包括系膜增殖性肾小球 肾炎13例，膜增殖性肾小球肾炎22例)35例。按年龄、性别匹配，选定正常对照组47例。
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1.2 方法
肝素疗法(HT)普通肝素100Iu/kg/d(1mg=125Iu)加葡萄糖液内静滴，1次/d，连续静滴10d为1 疗程[1]。
血小板指标测定于HT前1d(治疗前)及HT第10天(治疗后)分别取静脉血1ml加入特制试管内，1 5% EDTA-K210ul抗凝，充分混匀，用美国Beckman公司生产的coulter-ONYX型全自动细胞分析仪 测定血小板计数，体积、分布宽度，变异系数控制在5%以内。
1.3 血小板表面CD62P、CD63和CD41表达水平的测定
采用Bacton Dickemson公司流式细胞仪及软件。鼠抗人单克隆抗体CD62P-FITC、CD63-FITC( 异硫氰酸荧光素标记)，鼠抗人单克隆抗体CD41-PE(藻红蛋白标记)及阴性对照IgG1-FITC、I gG1-PE，均由法国国际免疫公司提供。
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治疗前、后分取静脉血2ml，2%EDTA 1∶9抗凝，800r/min，离心5min，取上层血清即为多血 小板血清(PS)，调整血小板数106ml，4℃保存时间不超过24h。取5支试管，均加PS100ul， 再分别加入CD62P-FITC、CD63-FITC、CD41-PE工作液及阴性对照IgG1-FITC、IgG1-PE工作液 20ul。室温避光30min，离心1?500r/min，10min，磷酸缓冲液(PBS)2ml漂洗，离心速度同 上，弃上清加PBS0.5ml，上机。上机前用标准荧光微球调整仪器，使变异系数稳定在2% 以内 。上机后收集1万个血小板，荧光强度以对数放大，在Macintosh650计算机上用Cell Quest Plot软件分析数据，打印结果。用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 HT对血小板计数、体积、分布宽度的影响
血小板计数减少10～50×109/L者：MC组4例，GS组8例，MN组8例，PGN组10例；50～10 0×109/L者：GS组17例，MN组9例，PGN组19例，HIT组4例，发病率4.2%；GS组2例， MN组1例，PGN组1例，见表1。
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2.2 HT对血小板表面CD62P、CD63和CD41表达的影响 见表2。
表1 HT对血小板计数、体积、分布宽度的影响 (x±s) 组别
例数
计数(10×109/L)
体积(fl)
分布宽度(%)
治疗前
治疗后
治疗前
治疗后
治疗前
, 百拇医药
治疗后
正常组
47
24.0±4.7169
7.74±0.4723
15.9±0.7478
MC组
10
23.7±5.021
21.9±4.39201)2)
7.75±0.6054
8.09 ±0.56121)2)
, 百拇医药
16.14±0.6946
16.47±0.6404
GS组
28
23.7±4.4044
18.9±4.04691)2)
7.89±0.6338
9.29 ±0.89071)2)
16.04±0.7122
18.1±0.8323
MN组
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19
23.2±4.8436
18.3±4.51771)2)
8.02±0.5606
9.23 ±1.01091)2)
16.20±0.6640
17.9±0.9671
PGN组
34
23.1±4.2144
18.9±3.06911)2)
, 百拇医药
7.94±0.5309
9.3 3±1.03481)2)
16.20±0.6468
18.4±0.7232
HIT组
4
24.2±5.0613
7.2±1.6021
7.84±0.6031
9.39±1.4241
16.0±0.5424
, 百拇医药
19.0±1.2423
注：1)治疗后与正常组比较P<0.01
2)治疗后与治疗前比较P<0.01 分布宽度正常值15%～17%表2 HT对血小板表面CD62P、CD63、CD41表达的影响 (
±s，%) 组别例数
CD62P
CD63
CD41
治疗前
治疗后
治疗前
, 百拇医药
治疗后
治疗前
治疗后
正常组
32
0.98±0.2884
1.13±0.4439
1.24±0.5329
MC组
10
1.05±0.4278
1.14±0.45191)2)
, http://www.100md.com
1.30±0.6924
1.39±0.68371)2)
1.32±0.6451
1.41±0.71011)2)
GS组
28
1.14±0.4192
2.49±1.24921)2)
1.29±0.7382
2. 73±1.58911)2)
, 百拇医药
1.38±0.7283
3.12±1.24041)2)
MN组
19
1.09±0.38353)
2.61±0.78531)2)
1.24±0.6231 3)
2.65±1.24101)2)
1.29±0.61633)
2.87±1.1156 1)2)
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PGN组
34
1.21±0.4195
2.67±0.84751)2)
1.34±0.6507
2. 94±1.32791)2)
1.43±0.7325
3.45±1.25701)2)
HIT组
4
1.15±0.5306
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5.84±1.9243
1.30±0.7256
4.96±2.4134
1.36±0.7432
6.04±2.8764
注：1)治疗后与正常组比较P<0.01
2)治疗后与治疗前比较P>0.01
3)治疗前与正常组比较P<0.05 3 讨论
反映血小板活化状态的直接指标是血小板表面 活化标志物CD 62P(又称GM P-140，血小板P选择素)和CD63(血小板活化因子)[2]。 本文发现HT对MC组病人血小板CD62P、CD63表达水平无影响，但可显著上调GS组，MN组、PG N 组部分病人血小板CD62P、CD63的表达，HIT组表达水平是以上各组的2～3倍，表明HT对MC组 病人血小板活化状态无影响，但可提高HIT病人及GS组、MN组、PGN组病人血小板活化程度。 这些结果提示HT对血小板活化状态的影响与肾小球肾炎病理类型有一定联系，HIT的发生取 决于HT血小板活化程度的高低。
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血小 板CD62P又可粘附中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和CD4+ CD8+T细胞，使白细胞在血栓内聚[3]。本研究发现MC组病人血小板CD41表 达正常，GS组、MN组、PGN组CD41表达增多，HIT的病人CD41表达水平是上述病人的2～3倍。 这提示HIT、MN、GS、PGN病人体内有血小板-纤维蛋白原微栓子的形成及在肾脏沉积，可能 对患儿造成不利影响。本组病人血小板计数减少，体积增大，分布宽度加大，均提示血小板 破坏增多，与CD62P、CD63、CD41上调相符。
参 考 文 献
1，吴瑞萍，胡亚美，江载芳.实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社，1996：16 44
2，Sedlmayr P,Muntean W.Flow cytometric detection of intracelluarplatel e tantigens.Cytometry,1996;23:284～289
3，Modderman PW,Vondem Borne AE,Sonnenberg A.P-Selectin mediates Ca 2+-dependent adhesion of activated platelets to many different types of leuk ocytes:detection by flow cytometry,1992;80:134～142, http://www.100md.com