关节软骨细胞的分离、培养及表皮细胞生长因子对其影响
作者：傅捷 董肇阳 祝云利 吴海山 周维江
单位：傅捷(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；董肇阳(长海医院烧伤科)；祝云利(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；吴海山(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；周维江(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)
关键词：软骨细胞，培养，表皮细胞生长因子
第二军医大学学报000724 [摘要] 目的：研究关节软骨细胞的原代分离及体外培养，了解表皮细胞生长因子(EGF)对其生长和去分化趋势的影响。方法：(1)用自制消化瓶分离原代软骨细胞并培养、传代；(2)锥虫蓝染色测定细胞存活率，测定克隆率；(3)比较EGF对软骨细胞增殖以及去分化趋势的影响。结果：(1)自制消化瓶能在3 h内将软骨碎块消化完毕；(2)细胞存活率为88.4%，克隆率为29.4%；(3)EGF 显著促进软骨细胞增殖(P<0.05)；(4)软骨细胞经过8～10次传代以后出现去分化趋势，与培养液中是否含EGF无关。结论：自制消化瓶能提高消化软骨的效率。EGF 能显著促进软骨细胞增殖，但不能阻止软骨细胞的去分化趋势。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 813.11 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)07-0677-03
Isolation and culture of articular chondrocytes and the effect of epidermal growth factor on it
FU Jie ZHU Yun-Li WU Hai-Shan ZHOU Wei-Jiang
(Department of orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
DONG Zhao-Yang
, 百拇医药
(Department of Burns, Changhai Hospital)
[ABSTRACT] Objective: To study the isolation and culture of chondrocyte of joint cartilage, and the influence of EGF on its growth and dedifferentiation. Methods: (1) Isolate chondrocytes using digestion chamber and then culture them. (2) Evaluate the digestion method by survival rate and cloning rate of isolated chondrocytes. (3) Study the influence of EGF on the growth and dedifferentiation of chondrocytes. Results: (1) Chondrocytes were totally isolated within 3 hours by the digestion chamber. (2) The survival rate was 88.4%, and the cloning rate was 29.4%. (3) EGF promoted the growth of chondrocytes (P<0.05). (4) Whether the EGF was added or not, dedifferentiation appeared after 8-10 times of detachment. Conclusion: The digestion chamber can make the isolation of chondrocytes more efficient. EGF can promote the growth of chondrocytes obviously, but can′t stop the dedifferentiation trend of chondrocytes.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] chondrocyte； culture； epidermal growth factor
组织工程学原理应用于关节软骨缺损修复治疗的先决条件是关节软骨细胞的体外培养及数量扩增[1,2]。关节软骨细胞的原代分离有赖于用消化酶分解的方法去除软骨基质。因为常规使用的消化酶(胰蛋白酶)对于软骨基质几乎无能为力，所以在梭状芽孢杆菌胶原酶被生产出来以前，关节软骨细胞的原代分离是难以实现的。关节软骨细胞在原代分离培养及研究细胞分化方面有其独特的优越性。关节软骨仅含单一的细胞种类，即透明软骨细胞，而其他组织(也许除晶状体之外)或多或少都有些纤维血管基质成分[3] 。
1 材料和方法
1.1 药品 磷酸缓冲液(PBS液)、胰蛋白酶和表皮细胞生长因子(EGF)均为Sigma公司产品。P/S液：青霉素10 000 U/ml、链霉素10 000 μg/ml的F12培养液。Ham F12培养液和Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)，谷氨酰胺256 mg/L，10%小牛血清(FCS，华美公司)、维生素C 50 mg/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml， pH 7.4。硫化钠为分析纯，上海试剂一厂产品。
, http://www.100md.com
1.2 标本采集 取4周龄新西兰兔1只，体质量约0.5 kg。过量戊巴比妥钠静脉注射处死，立即用饱和硫化钠溶液脱净两侧肩、髋、膝关节周围兔毛。无菌操作下切取两侧股骨头、肱骨头及膝关节，随即浸泡于P/S液中。以后操作在超净台内进行。将关节软骨削下，并切成边长小于1 mm的小块，注意用PBS液保持关节软骨呈湿润状态。
1.3 软骨细胞分离方法 参考文献[3]制作消化瓶。内径2.0 cm、长4.0 cm的玻璃管的下端包裹以一张边长为4 cm的正方形不锈钢丝滤网(150目)，以丝线扎紧，再将滤网的4个折角折向下立起。选25 ml烧杯(内径约3.0 cm)及10 ml培养皿盖。将玻璃管垂直放入烧杯内，不锈钢丝滤网的4个折角撑起玻璃管使其与烧杯底壁有约2.0 mm的空隙。玻璃管与烧杯之间的空间为外室；玻璃管内的空间为内室。将一枚长0.5 cm 的磁力搅拌棒置于内室，最后用培养皿盖盖住烧杯口。消化瓶制作完毕，高压消毒备用。关节软骨碎块用PBS液冲洗2遍后，移入消化瓶内室，再用PBS 液冲洗1遍。加入0.5%胰蛋白酶溶液 8 ml，置37℃ 10% CO2恒温箱内，磁力棒转速120 r/min。20 min后吸净胰蛋白酶溶液并用PBS液冲洗3遍，以除净胰蛋白酶及可能沾染的滑膜细胞。再加入0.2% Ⅱ型胶原酶溶液8 ml，置37℃ 10% CO2恒温箱内，磁力棒转速120 r/min。每45 min后从外室吸出消化液，另外再补充8 ml Ⅱ型胶原酶消化液。吸出的消化液1 000 r/min离心4 min，上清液丢弃，浅白色沉淀即为软骨细胞。加入2 ml F12培养液并吹打成细胞悬液，吸出少量用0.2%锥虫蓝染色并计数。计算细胞悬液的细胞浓度。
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1.4 细胞培养
1.4.1 单层培养 每个25 cm2细胞培养瓶中约加入1×105个软骨细胞及4 ml F12培养液。置于37℃ 10% CO2恒温箱内培养，72 h后首次换液，以后隔日换液。于倒置相差显微镜下观察软骨细胞的贴壁及生长情况，当软骨细胞连片融合时进行传代。
1.4.2 克隆率测定 10个25 cm2细胞培养瓶，每个瓶中约加入100个软骨细胞及4 ml F12培养液，置于37℃ 10% CO2恒温箱内培养，72 h后首次换液，以后隔日换液。7 d后于倒置相差显微镜下观察，计算细胞数量在15个以上的细胞团数量，即为细胞克隆率。
1.4.3 软骨细胞单层贴壁培养的计数 软骨细胞首次传代时，在两块24孔培养板的21孔内分别接种等量软骨细胞。分别加入含或不含EGF(0.1 μg/ml)的F12培养液，置37℃ 10% CO2恒温箱内培养，隔日换液。每日取3个孔的软骨细胞计数，最后进行统计学比较。
, 百拇医药
1.4.4 EGF对软骨细胞去分化趋势的影响 分别用含或不含EGF(0.1 μg/ml)的F12培养液培养软骨细胞，传代直至软骨细胞出现去分化趋势(约50%的细胞呈现成纤维细胞样形态)。记录传代次数。
2 结 果
2.1 软骨细胞分离 从幼兔的双侧肱骨头、股骨头、股骨滑车及胫骨平台共获得湿质量约350 mg的关节软骨碎块。经过4个45 min的Ⅱ型胶原酶消化之后，关节软骨碎块被完全消化，消化瓶的内室中已经无肉眼可辨的关节软骨碎块。在第2个45 min时(46～90 min)被消化游离出来的软骨细胞的数量最多。细胞总数为6.1×106个，平均细胞存活率约88.4%，消化后期的细胞锥虫蓝着色率较高(表1)。
表 1 关节软骨细胞被消化游离的速率
Tab 1 Isolating speed of chondrocytes Digestive time
, 百拇医药
(t/min)
Number of chondrocytes
(×105)
Rate of typan
blue (+) (%)
0-45
2.7
7
46-90
41.4
12
91-135
, http://www.100md.com
14.8
11
136-180
2.1
15
2.2 软骨细胞克隆率 经过7 d的培养之后，10个进行软骨细胞克隆率测定的细胞培养瓶中形成的克隆数量分别为30, 28, 36, 35, 30, 23, 25, 27, 29和31，平均29.4。原代软骨细胞克隆率为29.4%。
2.3 倒置显微镜下观察结果 刚接种的软骨细胞呈圆球形，漂流在培养液中，细胞的大小略有差异。12 h后大部分细胞沉降于细胞培养瓶的底壁上，以后细胞逐渐变得扁平且透亮。24～36 h后在已变得扁平且透亮的软骨细胞的边缘出现突起，细胞逐渐变为多角形，完成细胞贴壁过程。传代后的软骨细胞贴壁较快，在12 h内即可完成。未发现软骨细胞聚集现象。软骨细胞连片生长时，边缘的细胞的突起较长，细胞偏梭形；中央的细胞的突起较短，呈多角形，有些在中央的细胞甚至无明显突起而近似呈圆形。原代软骨细胞一般在接种15 d后连片生长并占据了细胞培养瓶底壁的大部分。平均10 d传代1次。
, 百拇医药
2.4 EGF对软骨细胞生长和去分化趋势的影响 EGF组的软骨细胞的增殖速度明显快于对照组(P<0.05，表2)。不论是否使用含EGF的培养液，经过8～10次传代后，50%以上的软骨细胞呈梭形，如成纤维细胞状。
表 2 软骨细胞单层贴壁培养细胞计数
Tab 2 Counting of monolayer cultured chondrocytes Time (t/d)
Medium with
EGF(×104)
Medium without
EGF (×104)
, 百拇医药 1
0.62
0.63
2
1.53
1.01
3
2.49
1.40
4
3.61
1.79
5
, 百拇医药 4.91
2.15
6
7.00
3.20
7
10.28
4.45
3 讨 论
采用上述消化瓶后，关节软骨碎块能在3 h内被完全消化。而在以前的实验中简单地将关节软骨碎块与Ⅱ型胶原酶溶液混合后置37℃恒温箱内，一般需要5～6 h以上才能消化完全。加快消化速度不仅提高工作效率，而且更多地保存软骨细胞活力。
Ham F12培养液最适合软骨细胞的生长，尤其是原代培养。使用中未发现在其他培养液中常出现的软骨细胞聚集现象。这种聚集现象将抑制软骨细胞的分裂增殖。关节软骨细胞的特征性产物为Ⅱ型胶原[4]，Ⅱ型胶原免疫组化染色参见文献[5]。
, http://www.100md.com
EGF能明显促进兔关节软骨细胞增殖，但不能阻止其去分化趋势。软骨细胞在贴壁培养时有梭形和多角形两种基本形态。这两种形态的软骨细胞分别被认为是分化和去分化软骨细胞。无论培养液中是否含有EGF，当传代至第8～10代时，超过50%的细胞呈梭形。对于如何保持关节软骨细胞的分化状态尚需进一步的研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770743)。
作者简介：傅捷(1968-)，男(汉族)，博士生，住院医师。
[参 考 文 献]
[1] Richardson JB, Caterson B, Evans EH， et al. Repair of human articular cartilage after implantation of autologous chondrocytes[J]. J Bone Joint Surg Br, 1999, 81(6): 1064-1068.
, http://www.100md.com
[2] Brittberg M. Autologous chondrocyte transplantation[J]. Clin Orthop, 1999, 367 (Suppl): S147-155.
[3] GreenWT Jr. Behavior of articular chondrocytes in cell culture[J]. Clin Orthop Relat Res, 1971, 75:248-260.
[4] Fortier LA, Brofman PJ, Nixon AJ， et al. Disparate chondrocyte metabolism in three dimensional fibrin cultures derived from autogenous or commercially manufactured fibrinogen[J]. Am J Vet Res, 1998, 59(4): 514-520.
[5] 傅 捷，祝云利，吴海山，等.兔关节软骨细胞在纤维蛋白胶中体外培养[J].第二军医大学学报，2000，21(7)：670-672.
[收稿日期] 2000-01-14
[修回日期] 2000-05-24, http://www.100md.com
单位：傅捷(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；董肇阳(长海医院烧伤科)；祝云利(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；吴海山(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；周维江(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)
关键词：软骨细胞，培养，表皮细胞生长因子
第二军医大学学报000724 [摘要] 目的：研究关节软骨细胞的原代分离及体外培养，了解表皮细胞生长因子(EGF)对其生长和去分化趋势的影响。方法：(1)用自制消化瓶分离原代软骨细胞并培养、传代；(2)锥虫蓝染色测定细胞存活率，测定克隆率；(3)比较EGF对软骨细胞增殖以及去分化趋势的影响。结果：(1)自制消化瓶能在3 h内将软骨碎块消化完毕；(2)细胞存活率为88.4%，克隆率为29.4%；(3)EGF 显著促进软骨细胞增殖(P<0.05)；(4)软骨细胞经过8～10次传代以后出现去分化趋势，与培养液中是否含EGF无关。结论：自制消化瓶能提高消化软骨的效率。EGF 能显著促进软骨细胞增殖，但不能阻止软骨细胞的去分化趋势。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 813.11 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)07-0677-03
Isolation and culture of articular chondrocytes and the effect of epidermal growth factor on it
FU Jie ZHU Yun-Li WU Hai-Shan ZHOU Wei-Jiang
(Department of orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
DONG Zhao-Yang
, 百拇医药
(Department of Burns, Changhai Hospital)
[ABSTRACT] Objective: To study the isolation and culture of chondrocyte of joint cartilage, and the influence of EGF on its growth and dedifferentiation. Methods: (1) Isolate chondrocytes using digestion chamber and then culture them. (2) Evaluate the digestion method by survival rate and cloning rate of isolated chondrocytes. (3) Study the influence of EGF on the growth and dedifferentiation of chondrocytes. Results: (1) Chondrocytes were totally isolated within 3 hours by the digestion chamber. (2) The survival rate was 88.4%, and the cloning rate was 29.4%. (3) EGF promoted the growth of chondrocytes (P<0.05). (4) Whether the EGF was added or not, dedifferentiation appeared after 8-10 times of detachment. Conclusion: The digestion chamber can make the isolation of chondrocytes more efficient. EGF can promote the growth of chondrocytes obviously, but can′t stop the dedifferentiation trend of chondrocytes.
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[KEY WORDS] chondrocyte； culture； epidermal growth factor
组织工程学原理应用于关节软骨缺损修复治疗的先决条件是关节软骨细胞的体外培养及数量扩增[1,2]。关节软骨细胞的原代分离有赖于用消化酶分解的方法去除软骨基质。因为常规使用的消化酶(胰蛋白酶)对于软骨基质几乎无能为力，所以在梭状芽孢杆菌胶原酶被生产出来以前，关节软骨细胞的原代分离是难以实现的。关节软骨细胞在原代分离培养及研究细胞分化方面有其独特的优越性。关节软骨仅含单一的细胞种类，即透明软骨细胞，而其他组织(也许除晶状体之外)或多或少都有些纤维血管基质成分[3] 。
1 材料和方法
1.1 药品 磷酸缓冲液(PBS液)、胰蛋白酶和表皮细胞生长因子(EGF)均为Sigma公司产品。P/S液：青霉素10 000 U/ml、链霉素10 000 μg/ml的F12培养液。Ham F12培养液和Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)，谷氨酰胺256 mg/L，10%小牛血清(FCS，华美公司)、维生素C 50 mg/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml， pH 7.4。硫化钠为分析纯，上海试剂一厂产品。
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1.2 标本采集 取4周龄新西兰兔1只，体质量约0.5 kg。过量戊巴比妥钠静脉注射处死，立即用饱和硫化钠溶液脱净两侧肩、髋、膝关节周围兔毛。无菌操作下切取两侧股骨头、肱骨头及膝关节，随即浸泡于P/S液中。以后操作在超净台内进行。将关节软骨削下，并切成边长小于1 mm的小块，注意用PBS液保持关节软骨呈湿润状态。
1.3 软骨细胞分离方法 参考文献[3]制作消化瓶。内径2.0 cm、长4.0 cm的玻璃管的下端包裹以一张边长为4 cm的正方形不锈钢丝滤网(150目)，以丝线扎紧，再将滤网的4个折角折向下立起。选25 ml烧杯(内径约3.0 cm)及10 ml培养皿盖。将玻璃管垂直放入烧杯内，不锈钢丝滤网的4个折角撑起玻璃管使其与烧杯底壁有约2.0 mm的空隙。玻璃管与烧杯之间的空间为外室；玻璃管内的空间为内室。将一枚长0.5 cm 的磁力搅拌棒置于内室，最后用培养皿盖盖住烧杯口。消化瓶制作完毕，高压消毒备用。关节软骨碎块用PBS液冲洗2遍后，移入消化瓶内室，再用PBS 液冲洗1遍。加入0.5%胰蛋白酶溶液 8 ml，置37℃ 10% CO2恒温箱内，磁力棒转速120 r/min。20 min后吸净胰蛋白酶溶液并用PBS液冲洗3遍，以除净胰蛋白酶及可能沾染的滑膜细胞。再加入0.2% Ⅱ型胶原酶溶液8 ml，置37℃ 10% CO2恒温箱内，磁力棒转速120 r/min。每45 min后从外室吸出消化液，另外再补充8 ml Ⅱ型胶原酶消化液。吸出的消化液1 000 r/min离心4 min，上清液丢弃，浅白色沉淀即为软骨细胞。加入2 ml F12培养液并吹打成细胞悬液，吸出少量用0.2%锥虫蓝染色并计数。计算细胞悬液的细胞浓度。
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1.4 细胞培养
1.4.1 单层培养 每个25 cm2细胞培养瓶中约加入1×105个软骨细胞及4 ml F12培养液。置于37℃ 10% CO2恒温箱内培养，72 h后首次换液，以后隔日换液。于倒置相差显微镜下观察软骨细胞的贴壁及生长情况，当软骨细胞连片融合时进行传代。
1.4.2 克隆率测定 10个25 cm2细胞培养瓶，每个瓶中约加入100个软骨细胞及4 ml F12培养液，置于37℃ 10% CO2恒温箱内培养，72 h后首次换液，以后隔日换液。7 d后于倒置相差显微镜下观察，计算细胞数量在15个以上的细胞团数量，即为细胞克隆率。
1.4.3 软骨细胞单层贴壁培养的计数 软骨细胞首次传代时，在两块24孔培养板的21孔内分别接种等量软骨细胞。分别加入含或不含EGF(0.1 μg/ml)的F12培养液，置37℃ 10% CO2恒温箱内培养，隔日换液。每日取3个孔的软骨细胞计数，最后进行统计学比较。
, 百拇医药
1.4.4 EGF对软骨细胞去分化趋势的影响 分别用含或不含EGF(0.1 μg/ml)的F12培养液培养软骨细胞，传代直至软骨细胞出现去分化趋势(约50%的细胞呈现成纤维细胞样形态)。记录传代次数。
2 结 果
2.1 软骨细胞分离 从幼兔的双侧肱骨头、股骨头、股骨滑车及胫骨平台共获得湿质量约350 mg的关节软骨碎块。经过4个45 min的Ⅱ型胶原酶消化之后，关节软骨碎块被完全消化，消化瓶的内室中已经无肉眼可辨的关节软骨碎块。在第2个45 min时(46～90 min)被消化游离出来的软骨细胞的数量最多。细胞总数为6.1×106个，平均细胞存活率约88.4%，消化后期的细胞锥虫蓝着色率较高(表1)。
表 1 关节软骨细胞被消化游离的速率
Tab 1 Isolating speed of chondrocytes Digestive time
, 百拇医药
(t/min)
Number of chondrocytes
(×105)
Rate of typan
blue (+) (%)
0-45
2.7
7
46-90
41.4
12
91-135
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14.8
11
136-180
2.1
15
2.2 软骨细胞克隆率 经过7 d的培养之后，10个进行软骨细胞克隆率测定的细胞培养瓶中形成的克隆数量分别为30, 28, 36, 35, 30, 23, 25, 27, 29和31，平均29.4。原代软骨细胞克隆率为29.4%。
2.3 倒置显微镜下观察结果 刚接种的软骨细胞呈圆球形，漂流在培养液中，细胞的大小略有差异。12 h后大部分细胞沉降于细胞培养瓶的底壁上，以后细胞逐渐变得扁平且透亮。24～36 h后在已变得扁平且透亮的软骨细胞的边缘出现突起，细胞逐渐变为多角形，完成细胞贴壁过程。传代后的软骨细胞贴壁较快，在12 h内即可完成。未发现软骨细胞聚集现象。软骨细胞连片生长时，边缘的细胞的突起较长，细胞偏梭形；中央的细胞的突起较短，呈多角形，有些在中央的细胞甚至无明显突起而近似呈圆形。原代软骨细胞一般在接种15 d后连片生长并占据了细胞培养瓶底壁的大部分。平均10 d传代1次。
, 百拇医药
2.4 EGF对软骨细胞生长和去分化趋势的影响 EGF组的软骨细胞的增殖速度明显快于对照组(P<0.05，表2)。不论是否使用含EGF的培养液，经过8～10次传代后，50%以上的软骨细胞呈梭形，如成纤维细胞状。
表 2 软骨细胞单层贴壁培养细胞计数
Tab 2 Counting of monolayer cultured chondrocytes Time (t/d)
Medium with
EGF(×104)
Medium without
EGF (×104)
, 百拇医药 1
0.62
0.63
2
1.53
1.01
3
2.49
1.40
4
3.61
1.79
5
, 百拇医药 4.91
2.15
6
7.00
3.20
7
10.28
4.45
3 讨 论
采用上述消化瓶后，关节软骨碎块能在3 h内被完全消化。而在以前的实验中简单地将关节软骨碎块与Ⅱ型胶原酶溶液混合后置37℃恒温箱内，一般需要5～6 h以上才能消化完全。加快消化速度不仅提高工作效率，而且更多地保存软骨细胞活力。
Ham F12培养液最适合软骨细胞的生长，尤其是原代培养。使用中未发现在其他培养液中常出现的软骨细胞聚集现象。这种聚集现象将抑制软骨细胞的分裂增殖。关节软骨细胞的特征性产物为Ⅱ型胶原[4]，Ⅱ型胶原免疫组化染色参见文献[5]。
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EGF能明显促进兔关节软骨细胞增殖，但不能阻止其去分化趋势。软骨细胞在贴壁培养时有梭形和多角形两种基本形态。这两种形态的软骨细胞分别被认为是分化和去分化软骨细胞。无论培养液中是否含有EGF，当传代至第8～10代时，超过50%的细胞呈梭形。对于如何保持关节软骨细胞的分化状态尚需进一步的研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770743)。
作者简介：傅捷(1968-)，男(汉族)，博士生，住院医师。
[参 考 文 献]
[1] Richardson JB, Caterson B, Evans EH， et al. Repair of human articular cartilage after implantation of autologous chondrocytes[J]. J Bone Joint Surg Br, 1999, 81(6): 1064-1068.
, http://www.100md.com
[2] Brittberg M. Autologous chondrocyte transplantation[J]. Clin Orthop, 1999, 367 (Suppl): S147-155.
[3] GreenWT Jr. Behavior of articular chondrocytes in cell culture[J]. Clin Orthop Relat Res, 1971, 75:248-260.
[4] Fortier LA, Brofman PJ, Nixon AJ， et al. Disparate chondrocyte metabolism in three dimensional fibrin cultures derived from autogenous or commercially manufactured fibrinogen[J]. Am J Vet Res, 1998, 59(4): 514-520.
[5] 傅 捷，祝云利，吴海山，等.兔关节软骨细胞在纤维蛋白胶中体外培养[J].第二军医大学学报，2000，21(7)：670-672.
[收稿日期] 2000-01-14
[修回日期] 2000-05-24, http://www.100md.com