重组人骨形态发生蛋白2诱发黄韧带骨化的病理学研究
作者：陈雄生 贾连顺 倪斌 袁文 陈华江 李玉莉
单位：陈雄生(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；贾连顺(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；倪斌(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；袁文(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)
关键词：黄韧带；骨化；骨形态发生蛋白2
第二军医大学学报000713 [摘要] 目的：研究实验性黄韧带骨化的病理演变特点。方法：将重组人骨形态发生蛋白2 (rhBMP-2)诱发的骨化过程中不同时期的动物黄韧带，采用石蜡切片苏木精-伊红(H-E)染色、阿尔辛蓝(AB)染色和免疫组化染色(分别以S-100单抗和胶原Ⅱ单抗为第一抗体)，然后光镜观察。结果：rhBMP-2植入后，成纤维细胞代谢活跃，出现软骨化生，并逐渐增生活跃，基质中Ⅱ型胶原纤维和硫酸软骨素增多，4周时达到高峰，此后，肥大的软骨细胞开始退变，基质钙化逐渐明显，Ⅱ型胶原纤维和硫酸软骨素随之减少，8周时出现编织骨，并可见脊髓神经纤维水肿、断裂、脱髓鞘和神经元细胞变性等改变。结论：rhBMP-2以软骨内骨化方式诱导黄韧带骨化；在软骨细胞增生最为活跃时，基质内Ⅱ型胶原和硫酸软骨素的含量最高，并随着骨化的成熟逐渐下降；黄韧带骨化在出现神经受损症状前即可出现脊髓的水肿与变性。
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[中图分类号] R 681.55 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)07-0642-03
Pathological studies on the ligamentum flavum ossification induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2
CHEN Xiong-Sheng JIA Lian-Shun NI Bin YUAN Wen
(Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
CHEN Hua-Jiang LI Yu-Li
(Department of Pathology)
[ABSTRACT] Objective: To study the progressing pathological features of experimental ossification of ligamentum flavum. Methods: Ligamentum flavum in different periods of ossification, which were induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2), were studied using parrafin slices with H-E stain, histopathology stain and immunohistology stain (S-100 monoclonal antibody or type Ⅱcollagen monoclonal antibody as first antibodies) and light microscope. Results: After the implanting of rhBMP-2, fibroblasts were very active in metabolism and differentiated into chondrocytes with increasing proliferation activity. The amount of type Ⅱcollagen fibers and chondroitin-sulfuric acid in the matrix increased and reached the hightest on the 4th week. After that, many hypertrophied chondrocytes began degenerate. Calcification of the matrix became more obvious. Type Ⅱcollagen fibers and chondroitin-sulfuric acid in the matrix decreased gradually. In the 8th week, woven bone were shown. Edema, broken and demyelination of neurofibers and degeneration of neurons in the spinal cord were seen in this period. Conclusion: rhBMP-2 induces the ossification of ligamentum flavum through endochondral ossification. The amounts of type Ⅱcollagen fibers and chondroitin-sulfuric acid in the matrix are the highest when the proliferation of chondrocytes is most active, and decreases gradually with the maturation of ossification. The edema and degeneration of spinal cord can be seen before the appearence of neurological damage.
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[KEY WORDS] ligamentum flavum; ossification; bone morphogenetic protein-2
近年来，由于脊柱韧带的病理性改变导致脊髓或神经根受损的一系列脊柱临床疾患越来越受到学者的关注。黄韧带在椎管狭窄症病理机制的研究中成为不可忽略的因素。临床上报道较多的是黄韧带增生肥厚，即黄韧带肥厚症(HLF)所致的椎管狭窄。黄韧带骨化症(OLF)相对少见，且一般认为多发于东南亚地区，但由于其起病和进展均较其他椎管狭窄症严重，减压手术效果并不总是十分理想，为此，学者们对其病因与发病机制进行了大量探索。 尤其是80年代以来，相关的研究报告日益增多。目前，虽然对黄韧带骨化症的病因与发病机制尚存在很多争议，但多数学者认为其病理变化实质属于软骨内骨化类型。本实验采用重组人骨形态发生蛋白2 (rhBMP-2)诱导黄韧带骨化，对其发生与发展过程的病理改变特征采用组织学、组织化学以及免疫组织化学等方法进行研究，剖析各环节的细微变化，以加深对OLF病理机制的了解。
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1 材料和方法
1.1 植入物准备 (1) rhBMP-2(军事医学科学院基础医学研究所提供)溶解于PBS溶液(pH 7.4)，去除残渣，0.2 μm滤菌膜滤菌，分装成每份含rhBMP-2 100 μg (100 μl)。(2)灭菌医用明胶海绵制成约0.5 mm3大小，分别吸附上述溶液1份或PBS溶液 (pH 7.4) 100 μl ，制成rhBMP-2/明胶海绵和PBS溶液/明胶海绵植入物，深低温下分管保存备用，用前常温下复温。
1.2 动物及分组 成年雄性中国大白兔24只(本院实验动物中心提供)，体质量2.0～3.0 kg，分为2组。E组(实验组)：rhBMP + 明胶海绵植入，12只；C组(对照组)：PBS溶液 + 明胶海绵植入，12只。各组根据观察时间不同，按2，4，6，8周分别称为E2，E4，E6，E8组和C2，C4，C6，C8组，每组3只。
1.3 模型制作 采用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉麻醉。手术方法：大白兔腰背部剃毛备皮，俯卧位固定，以L2～3为中心作长约4 cm后正中切口，剥离附着于棘突和椎板的肌肉，显露L1～2，L2～3和L3～4 3个椎板间隙，然后按不同分组要求进行操作。E组：选择显露的连续2个椎间隙，切除棘间韧带，分离显露其下方椎板间隙，后正中部可见双侧黄韧带间有一间隙，由该间隙分别向左右两侧各植入吸附rhBMP-2的明胶海绵1片。若植入困难，则将椎板边沿去除少许。C组：同E组操作，但植入物为明胶海绵吸附PBS溶液100 μl。最后缝合筋膜和皮肤，肌注丁胺卡那霉素200 mg，分笼饲养。
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1.4 取材 实验组和对照组于术后2周起每2周处死3只动物，切取实验部位韧带连同骨性结构整块置入10%中性甲醛液中浸泡固定，经脱钙后修整标本，石蜡包埋，备组织学检查。
1.5 观察指标与方法 分别采用苏木精-伊红(H-E)染色、组织化学染色[阿尔辛蓝(AB)染色]法及免疫组织化学染色等方法进行组织病理学检查。免疫组化染色使用Immunostain SP-plus Kit试剂药盒(福州迈新生物技术开发公司)，分别采用S-100单克隆抗体(Dako公司)和胶原Ⅱ单克隆抗体(Dako公司)作为第一抗体。
2 结 果
2.1 H-E染色结果 E2组：黄韧带增生肥厚，弹力纤维减少、断裂，胶原纤维增生，其间可见散在的软骨细胞，可见血管侵入(图1A，图1～3见封三)。E4组：黄韧带内软骨细胞明显增多、分裂增殖，腹侧尤为明显，基质中可见散在的点状或小片状钙盐沉着，部分软骨细胞呈肥大状。E6组：黄韧带内软骨细胞数量进一步增多，呈岛状分布，并有大量肥大的软骨细胞开始退变，基质中见片状钙盐沉着。E8组：黄韧带内可见较明显的钙盐沉着线，腹侧出现编织骨，同时可见上述各期病理变化共存，并由背侧向腹侧呈连续过渡梯度排列(图1B)。C2～8组：正常黄韧带组织，未见软骨化生和钙盐沉积。
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2.2 AB染色结果 E2组：散在的软骨细胞周围基质染成浅蓝色，表明有少量硫酸粘多糖存在，可能由软骨细胞分泌。E4组：增生活跃的软骨细胞周围存在大量基质，呈浓厚深染的蓝色，表明有较多的硫酸粘多糖分泌(图1C)。E6组：软骨细胞周围仍有较多染成蓝色的细胞基质，但较E4组减少，表明基质中硫酸粘多糖含量下降。E8组：骨化前沿的软骨细胞周围有少许染成蓝色的细胞基质，表明即将骨化的软骨区内硫酸粘多糖含量急剧下降(图1D)。
2.3 免疫组化染色结果 (1)以S-100单克隆抗体为第一抗体染色结果。E2组：散在的软骨细胞及其周围基质中存在S-100，被染成棕色。E4组：增生活跃的软骨细胞及其周围基质中存在大量的S-100，呈深染的棕色(图2A)。E6组：软骨细胞及其周围基质棕染较E4组弱，说明S-100的量减少。E8组：软骨细胞及其周围基质染色明显减弱，表明S-100进一步减少(图2B)。C组：未见阳性表现。(2)以胶原Ⅱ单克隆抗体为第一抗体染色结果。E2组：基质染成棕色，明显深于C组，表明其中有Ⅱ型胶原增生。E4组：基质染成浓厚的棕色，表明有大量的Ⅱ型胶原增生(图2C)。E6组：基质棕染较E4组略有减弱，表明Ⅱ型胶原有所减少。E8组：基质棕染明显减弱，但仍较C组深，表明Ⅱ型胶原大幅度下降，但仍比正常组织中含量高(图2D)。
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2.4 脊髓病理变化 观察期内，虽然未发现动物后肢肌力减弱及步态异常，但对E8组动物实验节段脊髓标本行H-E染色，发现以下病理变化特征：神经纤维肿胀、断裂，间质水肿，纤维脱髓鞘改变，神经元细胞变性(图3A,B)。其他各组脊髓组织未见明显异常。
3 讨 论
3.1 临床黄韧带骨化的病理变化实质 Okada等[1]研究指出，OLF的骨化方式主要是软骨内骨化过程， OLF的发生和发展建立在HLF的基础上，并伴有软骨组织的增殖，增生的胶原纤维虽然其种类和在骨化中的作用尚不清楚，但是牵张力的作用加剧这种增殖过程。因此认为，这一系列的骨化过程取决于黄韧带的特殊纤维结构和局部的机械环境。本实验采用rhBMP-2诱发了黄韧带骨化，故推测临床黄韧带骨化过程中组织内可能有rhBMP-2的出现。王哲等[2]将黄韧带骨化的病理组织变化分为4个梯度，即韧带区、软骨样区、钙化软骨区和骨化区，甲苯胺蓝(TB)染色发现增生软骨细胞周围有大量异染物质。Sakamoto等[3]认为这种异染物质主要是硫酸软骨素，与软骨基质的钙化密切相关，因而被称为骨化前沿。本实验研究所诱发的黄韧带骨化，其病理变化经历成纤维细胞软骨化生、软骨细胞增殖、胶原基质增生、钙化、编织骨形成等一系列典型的软骨内骨化过程，基本与临床病理研究结果相一致，对研究黄韧带骨化与椎管狭窄所致的慢性脊髓损害具有良好的应用前景。但本实验未观察到板层骨和骨髓腔的形成，可能系观察时间尚短之故。
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3.2 黄韧带骨化过程中Ⅱ型胶原纤维的变化规律 许多学者[1～4]的研究均描述了黄韧带骨化过程中出现了Ⅱ型胶原纤维的大量增生，并表现为不同程度肿胀。Yoshida等[4]还观察到了胶原纤维呈现不同程度的透明变性。至于其在整个过程中的量变规律却未见报道。本实验采用免疫组化方法对黄韧带骨化不同时期Ⅱ型胶原的存在状况进行检测，发现在软骨细胞增殖最为活跃的时期以及钙化发生的早期，Ⅱ型胶原的增生也最为活跃，其组化染色最为深浓，此后随着钙化的进展和骨化的形成，Ⅱ型胶原逐渐减少。推测可能与纤维变性或向其他类型的胶原纤维转变有关。
3.3 黄韧带骨化过程中硫酸软骨素的变化趋势 Sakamoto等[3]研究证实黄韧带骨化时软骨细胞周围存在硫酸软骨素，并认为其与软骨基质的钙化密切相关。本研究采用阿尔辛蓝组化染色检测硫酸软骨素的量变趋势，发现其随着软骨细胞的增殖而增多，同时伴有明显的基质钙化，但随着骨化的日趋成熟，其在基质中的含量呈下降趋势。
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3.4 黄韧带骨化对脊髓的影响 Miyamoto等[5]通过BMP诱导黄韧带骨化，造成脊髓慢性压迫的模型，并描述脊髓的病理变化有3种不同程度：脊髓轻度变形时，几乎没有变性改变；脊髓中度变形时，白质的后柱和侧柱可见脱髓鞘改变，灰质未见病变；脊髓重度变形时，白质和灰质都有变性，白质后柱和侧柱的轴突纤维减少，并表现明显的脱髓鞘改变，灰质前角可见神经元减少和染色质溶解。Saito等[6]对受骨化物压迫后脊髓的早期病理变化进行定量形态学研究，指出：脊髓受压率(矢状径/横径)>45%时，白质中的神经纤维未见减少，但是，6个月后的白质中神经纤维的髓鞘变薄；脊髓受压率<45%时，白质浅层的神经纤维，特别是粗纤维数减少，6个月后残存的神经纤维直径变小。本实验未对脊髓病理变化作重点研究，但E8组观察到脊髓间质的水肿、神经纤维脱髓鞘以及神经元细胞变性，此时实验动物尚无神经功能障碍之表现，说明黄韧带骨化在出现神经受损症状前即可能存在脊髓的水肿与变性等表现。
综上所述，(1)rhBMP-2诱导的脊柱黄韧带骨化为软骨内骨化过程。(2)黄韧带骨化过程中基质内Ⅱ型胶原和硫酸软骨素的含量在软骨细胞增生最为活跃时最高，随着骨化的成熟逐渐呈下降趋势。(3)黄韧带骨化在出现神经受损症状前即可能存在脊髓的水肿与变性。
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图1 实验组病理变化(×200)
Fig 1 Pathological changes of experimental group (×200)
A: Group E2 ,proliferation of type IIcollagen fibers ,presence of chondrocytes ,invasion of blood vessel (H-E);B:Group E8,evidence of calfication lines ,woven bone getting mature (H-E);C:Group E4,matrix around chondrocytes were mazarine stained (AB);
D:Group E4,blue stained matrix around chondrocytes decreased (AB)
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图2 实验组免疫组化染色结果(×200)
Fig 2 Results of immunohistology stain of experimental group (×200)
A: Group E4, chondrocytes and matrix wer Nigger -Brown stained (S-100 monoclonal antibody as first antibody );B:Group E8 ,brown stained chondrocytes and matrix attenuate 9S-100 monoclonal antibody as first antibody );C:Group E4,matrix were Nigger -Brown stained,showing a great deal proliferation of type II collagen (type II collagen monoclonal antibody as first antibody );D:Group E8, brown stained of matrix attenuate ,showing a decrease of type II collagen (type IIcollagen monoclonal antibody as first antibody )
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图3 E8组脊病理变化(H-E,×200)
Fig 3 Pahological changes of spinal cord of E8(H-E,200)
A: Demyelination of neurofibres ;B:Degeneration of neurons
基金项目：上海市医学领先专业重点学科基金资助项目(1995-Ⅳ-008，1998-Ⅳ-008)。
作者简介：陈雄生(1967-)，男(汉族)，博士，主治医师。
作者单位：陈华江(第二军医大学长征医院病理科)
李玉莉(第二军医大学长征医院病理科)
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[参 考 文 献]
[1] Okada K, Oka S, Tohge K, et al. Thoracic myelopathy caused by ossification of the ligamentum flavum: Clinicopathological study and surgical treatment[J]. Spine,1991,16(3):280-287.
[2] 王 哲, 王全平, 吕 荣, 等. 胸椎黄韧带骨化的病理观察[J]. 第四军医大学学报, 1996,17(3):220-221.
[3] Sakamoto RT, Ikata TK, Murase M, et al. Comparative study between magnatic resonance imaging and histopathologic findings in ossification or calcification of ligaments[J]. Spine, 1991,16(3):1253-1261.
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[4] Yoshida M, Shima K, Taniguchi Y, et al. Hypertrophied ligamentum flavum in lumbar spinal canal stenosis:pathogenesis and morphologic and immunohistochemical observation[J]. Spine, 1992,17(11):1353-1360.
[5] Miyamoto S, Takaoka K, Yonenobu K, et al. Ossification of the ligamentum flavum induced by bone morphogenetic protein[J]. J Bone Joint Surg Br, 1992,74(2):279-283 .
[6] Saito H, Mimatsu K, Sato K, et al. Histopathologic and morphometric study of spinal cord lesion in a chronic cord compression model using bone morphogenetic protein in rabbits[J]. Spine,1992,17(11):1368-1374.
[收稿日期] 2000-01-05
[修回日期] 2000-06-12, http://www.100md.com
单位：陈雄生(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；贾连顺(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；倪斌(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)；袁文(第二军医大学长征医院骨科，上海200003)
关键词：黄韧带；骨化；骨形态发生蛋白2
第二军医大学学报000713 [摘要] 目的：研究实验性黄韧带骨化的病理演变特点。方法：将重组人骨形态发生蛋白2 (rhBMP-2)诱发的骨化过程中不同时期的动物黄韧带，采用石蜡切片苏木精-伊红(H-E)染色、阿尔辛蓝(AB)染色和免疫组化染色(分别以S-100单抗和胶原Ⅱ单抗为第一抗体)，然后光镜观察。结果：rhBMP-2植入后，成纤维细胞代谢活跃，出现软骨化生，并逐渐增生活跃，基质中Ⅱ型胶原纤维和硫酸软骨素增多，4周时达到高峰，此后，肥大的软骨细胞开始退变，基质钙化逐渐明显，Ⅱ型胶原纤维和硫酸软骨素随之减少，8周时出现编织骨，并可见脊髓神经纤维水肿、断裂、脱髓鞘和神经元细胞变性等改变。结论：rhBMP-2以软骨内骨化方式诱导黄韧带骨化；在软骨细胞增生最为活跃时，基质内Ⅱ型胶原和硫酸软骨素的含量最高，并随着骨化的成熟逐渐下降；黄韧带骨化在出现神经受损症状前即可出现脊髓的水肿与变性。
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[中图分类号] R 681.55 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)07-0642-03
Pathological studies on the ligamentum flavum ossification induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2
CHEN Xiong-Sheng JIA Lian-Shun NI Bin YUAN Wen
(Department of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
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CHEN Hua-Jiang LI Yu-Li
(Department of Pathology)
[ABSTRACT] Objective: To study the progressing pathological features of experimental ossification of ligamentum flavum. Methods: Ligamentum flavum in different periods of ossification, which were induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2), were studied using parrafin slices with H-E stain, histopathology stain and immunohistology stain (S-100 monoclonal antibody or type Ⅱcollagen monoclonal antibody as first antibodies) and light microscope. Results: After the implanting of rhBMP-2, fibroblasts were very active in metabolism and differentiated into chondrocytes with increasing proliferation activity. The amount of type Ⅱcollagen fibers and chondroitin-sulfuric acid in the matrix increased and reached the hightest on the 4th week. After that, many hypertrophied chondrocytes began degenerate. Calcification of the matrix became more obvious. Type Ⅱcollagen fibers and chondroitin-sulfuric acid in the matrix decreased gradually. In the 8th week, woven bone were shown. Edema, broken and demyelination of neurofibers and degeneration of neurons in the spinal cord were seen in this period. Conclusion: rhBMP-2 induces the ossification of ligamentum flavum through endochondral ossification. The amounts of type Ⅱcollagen fibers and chondroitin-sulfuric acid in the matrix are the highest when the proliferation of chondrocytes is most active, and decreases gradually with the maturation of ossification. The edema and degeneration of spinal cord can be seen before the appearence of neurological damage.
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[KEY WORDS] ligamentum flavum; ossification; bone morphogenetic protein-2
近年来，由于脊柱韧带的病理性改变导致脊髓或神经根受损的一系列脊柱临床疾患越来越受到学者的关注。黄韧带在椎管狭窄症病理机制的研究中成为不可忽略的因素。临床上报道较多的是黄韧带增生肥厚，即黄韧带肥厚症(HLF)所致的椎管狭窄。黄韧带骨化症(OLF)相对少见，且一般认为多发于东南亚地区，但由于其起病和进展均较其他椎管狭窄症严重，减压手术效果并不总是十分理想，为此，学者们对其病因与发病机制进行了大量探索。 尤其是80年代以来，相关的研究报告日益增多。目前，虽然对黄韧带骨化症的病因与发病机制尚存在很多争议，但多数学者认为其病理变化实质属于软骨内骨化类型。本实验采用重组人骨形态发生蛋白2 (rhBMP-2)诱导黄韧带骨化，对其发生与发展过程的病理改变特征采用组织学、组织化学以及免疫组织化学等方法进行研究，剖析各环节的细微变化，以加深对OLF病理机制的了解。
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1 材料和方法
1.1 植入物准备 (1) rhBMP-2(军事医学科学院基础医学研究所提供)溶解于PBS溶液(pH 7.4)，去除残渣，0.2 μm滤菌膜滤菌，分装成每份含rhBMP-2 100 μg (100 μl)。(2)灭菌医用明胶海绵制成约0.5 mm3大小，分别吸附上述溶液1份或PBS溶液 (pH 7.4) 100 μl ，制成rhBMP-2/明胶海绵和PBS溶液/明胶海绵植入物，深低温下分管保存备用，用前常温下复温。
1.2 动物及分组 成年雄性中国大白兔24只(本院实验动物中心提供)，体质量2.0～3.0 kg，分为2组。E组(实验组)：rhBMP + 明胶海绵植入，12只；C组(对照组)：PBS溶液 + 明胶海绵植入，12只。各组根据观察时间不同，按2，4，6，8周分别称为E2，E4，E6，E8组和C2，C4，C6，C8组，每组3只。
1.3 模型制作 采用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉麻醉。手术方法：大白兔腰背部剃毛备皮，俯卧位固定，以L2～3为中心作长约4 cm后正中切口，剥离附着于棘突和椎板的肌肉，显露L1～2，L2～3和L3～4 3个椎板间隙，然后按不同分组要求进行操作。E组：选择显露的连续2个椎间隙，切除棘间韧带，分离显露其下方椎板间隙，后正中部可见双侧黄韧带间有一间隙，由该间隙分别向左右两侧各植入吸附rhBMP-2的明胶海绵1片。若植入困难，则将椎板边沿去除少许。C组：同E组操作，但植入物为明胶海绵吸附PBS溶液100 μl。最后缝合筋膜和皮肤，肌注丁胺卡那霉素200 mg，分笼饲养。
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1.4 取材 实验组和对照组于术后2周起每2周处死3只动物，切取实验部位韧带连同骨性结构整块置入10%中性甲醛液中浸泡固定，经脱钙后修整标本，石蜡包埋，备组织学检查。
1.5 观察指标与方法 分别采用苏木精-伊红(H-E)染色、组织化学染色[阿尔辛蓝(AB)染色]法及免疫组织化学染色等方法进行组织病理学检查。免疫组化染色使用Immunostain SP-plus Kit试剂药盒(福州迈新生物技术开发公司)，分别采用S-100单克隆抗体(Dako公司)和胶原Ⅱ单克隆抗体(Dako公司)作为第一抗体。
2 结 果
2.1 H-E染色结果 E2组：黄韧带增生肥厚，弹力纤维减少、断裂，胶原纤维增生，其间可见散在的软骨细胞，可见血管侵入(图1A，图1～3见封三)。E4组：黄韧带内软骨细胞明显增多、分裂增殖，腹侧尤为明显，基质中可见散在的点状或小片状钙盐沉着，部分软骨细胞呈肥大状。E6组：黄韧带内软骨细胞数量进一步增多，呈岛状分布，并有大量肥大的软骨细胞开始退变，基质中见片状钙盐沉着。E8组：黄韧带内可见较明显的钙盐沉着线，腹侧出现编织骨，同时可见上述各期病理变化共存，并由背侧向腹侧呈连续过渡梯度排列(图1B)。C2～8组：正常黄韧带组织，未见软骨化生和钙盐沉积。
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2.2 AB染色结果 E2组：散在的软骨细胞周围基质染成浅蓝色，表明有少量硫酸粘多糖存在，可能由软骨细胞分泌。E4组：增生活跃的软骨细胞周围存在大量基质，呈浓厚深染的蓝色，表明有较多的硫酸粘多糖分泌(图1C)。E6组：软骨细胞周围仍有较多染成蓝色的细胞基质，但较E4组减少，表明基质中硫酸粘多糖含量下降。E8组：骨化前沿的软骨细胞周围有少许染成蓝色的细胞基质，表明即将骨化的软骨区内硫酸粘多糖含量急剧下降(图1D)。
2.3 免疫组化染色结果 (1)以S-100单克隆抗体为第一抗体染色结果。E2组：散在的软骨细胞及其周围基质中存在S-100，被染成棕色。E4组：增生活跃的软骨细胞及其周围基质中存在大量的S-100，呈深染的棕色(图2A)。E6组：软骨细胞及其周围基质棕染较E4组弱，说明S-100的量减少。E8组：软骨细胞及其周围基质染色明显减弱，表明S-100进一步减少(图2B)。C组：未见阳性表现。(2)以胶原Ⅱ单克隆抗体为第一抗体染色结果。E2组：基质染成棕色，明显深于C组，表明其中有Ⅱ型胶原增生。E4组：基质染成浓厚的棕色，表明有大量的Ⅱ型胶原增生(图2C)。E6组：基质棕染较E4组略有减弱，表明Ⅱ型胶原有所减少。E8组：基质棕染明显减弱，但仍较C组深，表明Ⅱ型胶原大幅度下降，但仍比正常组织中含量高(图2D)。
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2.4 脊髓病理变化 观察期内，虽然未发现动物后肢肌力减弱及步态异常，但对E8组动物实验节段脊髓标本行H-E染色，发现以下病理变化特征：神经纤维肿胀、断裂，间质水肿，纤维脱髓鞘改变，神经元细胞变性(图3A,B)。其他各组脊髓组织未见明显异常。
3 讨 论
3.1 临床黄韧带骨化的病理变化实质 Okada等[1]研究指出，OLF的骨化方式主要是软骨内骨化过程， OLF的发生和发展建立在HLF的基础上，并伴有软骨组织的增殖，增生的胶原纤维虽然其种类和在骨化中的作用尚不清楚，但是牵张力的作用加剧这种增殖过程。因此认为，这一系列的骨化过程取决于黄韧带的特殊纤维结构和局部的机械环境。本实验采用rhBMP-2诱发了黄韧带骨化，故推测临床黄韧带骨化过程中组织内可能有rhBMP-2的出现。王哲等[2]将黄韧带骨化的病理组织变化分为4个梯度，即韧带区、软骨样区、钙化软骨区和骨化区，甲苯胺蓝(TB)染色发现增生软骨细胞周围有大量异染物质。Sakamoto等[3]认为这种异染物质主要是硫酸软骨素，与软骨基质的钙化密切相关，因而被称为骨化前沿。本实验研究所诱发的黄韧带骨化，其病理变化经历成纤维细胞软骨化生、软骨细胞增殖、胶原基质增生、钙化、编织骨形成等一系列典型的软骨内骨化过程，基本与临床病理研究结果相一致，对研究黄韧带骨化与椎管狭窄所致的慢性脊髓损害具有良好的应用前景。但本实验未观察到板层骨和骨髓腔的形成，可能系观察时间尚短之故。
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3.2 黄韧带骨化过程中Ⅱ型胶原纤维的变化规律 许多学者[1～4]的研究均描述了黄韧带骨化过程中出现了Ⅱ型胶原纤维的大量增生，并表现为不同程度肿胀。Yoshida等[4]还观察到了胶原纤维呈现不同程度的透明变性。至于其在整个过程中的量变规律却未见报道。本实验采用免疫组化方法对黄韧带骨化不同时期Ⅱ型胶原的存在状况进行检测，发现在软骨细胞增殖最为活跃的时期以及钙化发生的早期，Ⅱ型胶原的增生也最为活跃，其组化染色最为深浓，此后随着钙化的进展和骨化的形成，Ⅱ型胶原逐渐减少。推测可能与纤维变性或向其他类型的胶原纤维转变有关。
3.3 黄韧带骨化过程中硫酸软骨素的变化趋势 Sakamoto等[3]研究证实黄韧带骨化时软骨细胞周围存在硫酸软骨素，并认为其与软骨基质的钙化密切相关。本研究采用阿尔辛蓝组化染色检测硫酸软骨素的量变趋势，发现其随着软骨细胞的增殖而增多，同时伴有明显的基质钙化，但随着骨化的日趋成熟，其在基质中的含量呈下降趋势。
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3.4 黄韧带骨化对脊髓的影响 Miyamoto等[5]通过BMP诱导黄韧带骨化，造成脊髓慢性压迫的模型，并描述脊髓的病理变化有3种不同程度：脊髓轻度变形时，几乎没有变性改变；脊髓中度变形时，白质的后柱和侧柱可见脱髓鞘改变，灰质未见病变；脊髓重度变形时，白质和灰质都有变性，白质后柱和侧柱的轴突纤维减少，并表现明显的脱髓鞘改变，灰质前角可见神经元减少和染色质溶解。Saito等[6]对受骨化物压迫后脊髓的早期病理变化进行定量形态学研究，指出：脊髓受压率(矢状径/横径)>45%时，白质中的神经纤维未见减少，但是，6个月后的白质中神经纤维的髓鞘变薄；脊髓受压率<45%时，白质浅层的神经纤维，特别是粗纤维数减少，6个月后残存的神经纤维直径变小。本实验未对脊髓病理变化作重点研究，但E8组观察到脊髓间质的水肿、神经纤维脱髓鞘以及神经元细胞变性，此时实验动物尚无神经功能障碍之表现，说明黄韧带骨化在出现神经受损症状前即可能存在脊髓的水肿与变性等表现。
综上所述，(1)rhBMP-2诱导的脊柱黄韧带骨化为软骨内骨化过程。(2)黄韧带骨化过程中基质内Ⅱ型胶原和硫酸软骨素的含量在软骨细胞增生最为活跃时最高，随着骨化的成熟逐渐呈下降趋势。(3)黄韧带骨化在出现神经受损症状前即可能存在脊髓的水肿与变性。
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图1 实验组病理变化(×200)
Fig 1 Pathological changes of experimental group (×200)
A: Group E2 ,proliferation of type IIcollagen fibers ,presence of chondrocytes ,invasion of blood vessel (H-E);B:Group E8,evidence of calfication lines ,woven bone getting mature (H-E);C:Group E4,matrix around chondrocytes were mazarine stained (AB);
D:Group E4,blue stained matrix around chondrocytes decreased (AB)
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图2 实验组免疫组化染色结果(×200)
Fig 2 Results of immunohistology stain of experimental group (×200)
A: Group E4, chondrocytes and matrix wer Nigger -Brown stained (S-100 monoclonal antibody as first antibody );B:Group E8 ,brown stained chondrocytes and matrix attenuate 9S-100 monoclonal antibody as first antibody );C:Group E4,matrix were Nigger -Brown stained,showing a great deal proliferation of type II collagen (type II collagen monoclonal antibody as first antibody );D:Group E8, brown stained of matrix attenuate ,showing a decrease of type II collagen (type IIcollagen monoclonal antibody as first antibody )
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图3 E8组脊病理变化(H-E,×200)
Fig 3 Pahological changes of spinal cord of E8(H-E,200)
A: Demyelination of neurofibres ;B:Degeneration of neurons
基金项目：上海市医学领先专业重点学科基金资助项目(1995-Ⅳ-008，1998-Ⅳ-008)。
作者简介：陈雄生(1967-)，男(汉族)，博士，主治医师。
作者单位：陈华江(第二军医大学长征医院病理科)
李玉莉(第二军医大学长征医院病理科)
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[参 考 文 献]
[1] Okada K, Oka S, Tohge K, et al. Thoracic myelopathy caused by ossification of the ligamentum flavum: Clinicopathological study and surgical treatment[J]. Spine,1991,16(3):280-287.
[2] 王 哲, 王全平, 吕 荣, 等. 胸椎黄韧带骨化的病理观察[J]. 第四军医大学学报, 1996,17(3):220-221.
[3] Sakamoto RT, Ikata TK, Murase M, et al. Comparative study between magnatic resonance imaging and histopathologic findings in ossification or calcification of ligaments[J]. Spine, 1991,16(3):1253-1261.
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[4] Yoshida M, Shima K, Taniguchi Y, et al. Hypertrophied ligamentum flavum in lumbar spinal canal stenosis:pathogenesis and morphologic and immunohistochemical observation[J]. Spine, 1992,17(11):1353-1360.
[5] Miyamoto S, Takaoka K, Yonenobu K, et al. Ossification of the ligamentum flavum induced by bone morphogenetic protein[J]. J Bone Joint Surg Br, 1992,74(2):279-283 .
[6] Saito H, Mimatsu K, Sato K, et al. Histopathologic and morphometric study of spinal cord lesion in a chronic cord compression model using bone morphogenetic protein in rabbits[J]. Spine,1992,17(11):1368-1374.
[收稿日期] 2000-01-05
[修回日期] 2000-06-12, http://www.100md.com