尼卡地平对缺氧／复氧心肌细胞损害及细胞内Ca2＋的影响
作者：彭章龙 杭燕南 孙大金
单位：上海第二医科大学附属仁济医院麻醉科，200001
关键词：尼卡地平；缺氧；心肌保护；钙离子
临床麻醉学杂志000708
摘要 目的：研究尼卡地平对缺氧/复氧心肌细胞损害及细胞内Ca2+的影响。方法：培养4～5天原代SD大鼠心肌细胞分为正常对照、单纯缺氧/复氧以及低剂量和高剂量(终浓度分别为30ng/ml和270ng/ml)的尼卡地平预防用药20分钟后缺氧/复氧四组。实验结束测定培养液乳酸脱氢氧酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性以及细胞内Ca2+含量。结果：缺氧复氧后，心肌细胞内游离Ca2+浓度，以及培养液中LDH和CK活性显著升高。高剂量尼卡地平能明显减轻这种升高，而低浓度尼卡地平则无明显影响。结论：高浓度尼卡地平减轻缺氧/复氧心肌细胞Ca2+超载，对心肌细胞产生一定保护作用。
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Effect of Nicardipine on Anoxia-Reoxygenation Injury and Intracellular Calcium in Primary Culture Myocardial Cells
Peng Zhanglong，Hang Yannan，Sun Dajin
(Department of Anesthesiology，Renji Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai 200001)
Abstract Objective：To study the effect of nicardipine on anoxia-reoxygenation injury and intracellular calcium in primary culture myocardial cells.Methods：Myocardial cells，cultured in 1640 culture medium for 4-5 days，were assigned to control group，anoxia-reoxygenation group and treating with nicardipine(30ng/ml or 270 ng/ml in final concentration) followed anoxia-reoxygenation group.Intracellular free calcium in single cell and lactic dehydrogenase(LDH) and creatine kinase (CK) in culture medium were measured at the end of experiment.Results：High dose(270ng/ml) of nicardipine significantly attenuated the great increases of intracellular calcium，or LDH and CK in culture medium caused by anoxia-reoxygenation， but low dose of it did not.Conclusion：High dose of nicardipine protects myocardium cells from anoxia-reoxygenation injury at extent through decreasing intracellular calcium.
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Key words Nicardipine Anoxia Myocardium protection Calcium
尼卡地平是Ⅱ类新型短效钙通道阻滞剂，对冠脉、外周血管及心脏的Ca2+通道均有阻滞作用[1，2]。本实验采用SD乳鼠原代培养心肌细胞，建立缺氧/复氧模型，研究预防性应用尼卡地平对缺氧/复氧心肌细胞损害及细胞内游离Ca2+的影响。
材料与方法
心肌细胞培养 无菌条件下取出日龄2～3天SD大鼠心室，0.125%胰蛋白酶消化，机械振荡，分离成单个细胞，用含15%小牛血清1640培养液，在37℃、CO2培养箱中，预培养1小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化后的心肌细胞，按5×105cells/孔接种到24孔培养板(用于测定心肌酶)，1×106cells/孔接种于6孔培养板(每孔置一盖玻片，细胞贴玻片生长，用于测定细胞内游离Ca2+)，隔天换培养液，培养4～5天用于实验。实验前24小时换培养液。
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分组及药物处理 细胞按培养孔随机分为四组。正常对照组：细胞不经任何处理；单纯缺氧/复氧组：每孔细胞内加入预防用药组等体积的生理盐水，20分钟后进行缺氧2小时复氧1小时；尼卡地平预防用药组又分为常用药量血药浓度组[3]和高浓度组，分别于缺氧/复氧前20分钟加入终浓度为30ng/ml和270ng/ml的尼卡地平。
缺氧/复氧模型建立 培养板细胞置于小无菌密闭容器，放在恒温水浴箱内保持37℃，进气口通入95%N2+5%CO2混合气体，经出气口流出使容器内保持无氧状态，2小时后，将细胞放回37℃ CO2培养箱，继续培养1小时。
观察指标 (1)心肌酶：实验结束取培养液，经HITACHI 7150全自动生化分析仪比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性。(2)心肌细胞内游离Ca2+测定[4]：实验结束后，贴玻片生长的心肌细胞以Hepes缓冲液洗两次，再以含终浓度为10μmol Fura-2/AM Hepes缓冲液孵育细胞30分钟，用Hepes缓冲液洗两次后，将贴玻片细胞置于倒置荧光显微镜下，以340nm的紫外光激发标本，并通过计算机图象处理技术测得单细胞的荧光强度(每组测10个细胞)，将此测得值和Ca2+的浓度-荧光强度标准曲线相对照，获得相应细胞内Ca2+浓度。
, 百拇医药
统计分析 所有数据以均数±标准差(
±s)表示，采用方差分析F检验，P<0.05为有统计学差异。
结果
尼卡地平对LDH和CK的影响 与对照组比，单纯缺氧/复氧使LDH和CK的释放显著升高(P<0.01)，缺氧/复氧前预防性用尼卡地平30ng/ml并不能明显降低LDH和CK的释放，270ng/ml的尼卡地平能显著减轻缺氧/复氧引起的LDH和CK的释放，但仍明显高于正常对照组，见图1和图2。
图1 尼卡地平对LDH的影响(n＝6)
, http://www.100md.com 与30ng/ml尼卡地平比较，☆P<0.01
图2 尼卡地平对CK的影响(n＝6)
尼卡地平对心肌细胞内Ca2+的影响 正常对照组细胞内游离Ca2+为134.72mol/L，单纯缺氧/复氧使其显著升高至183.85mol/L(P<0.01)；缺氧/复氧前预防性用尼卡地平270ng/ml，能显著减轻细胞内游离Ca2+升高而降至156.92ng/ml(P<0.01)；30ng/ml尼卡地平对其无明显影响，见图3。
讨论
缺氧/复氧时细胞内游离Ca2+超载被认为是造成细胞不可逆损害的原因之一[5]。有报道预防性用钙通道拮抗剂可阻滞或减轻Ca2+超载[6]。本研究采用Fura-2作为荧光探针，运用计算机图象分析技术测定单个心肌细胞内Ca2+含量，结果显示，单纯缺氧/复氧可引起细胞内Ca2+显著升高，临床常用剂量血药浓度的尼卡地平对这种细胞内Ca2+升高无明显影响，高浓度时才显著降低心肌细胞内Ca2+升高，但仍不能降至正常对照水平，表明预防性用尼卡地平减轻缺氧/复氧引起的心肌细胞内Ca2+超载是有限的。其原因可能是心肌细胞内Ca2+含量受许多因素影响，主要包括通过Ca2+通道的Ca2+内流、Na+-Ca2+交换系统和Ca2+泵转运，尼卡地平只阻滞慢钙通道的Ca2+内流，而对其他途径的Ca2+内流无阻断作用。
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图3 尼卡地平对心肌细胞内Ca2+的影响
LDH和CK是心肌细胞内正常代谢酶，心肌细胞的裂解或细胞膜受损，其释放均增加。培养液中LDH和CK活性的升高可反映细胞受损的程度。本研究显示高浓度尼卡地平能明显减轻缺氧/复氧引起的LDH和CK活性的显著升高，而临床常用剂量的血药浓度的尼卡地平则无明显影响，表明高剂量尼卡地平对缺氧/复氧引起的心肌细胞损害有一定的保护作用。
参考文献
1，Kishi Y，Okumura F，Furuya H.Haemodynamic effects of nicardipine hydrochloride：studies during its use to control acute hypertension in anaesthetized patients.Br J Anaesth，1984，56∶1003-1007.
, http://www.100md.com
2，Tobias JD.Nicardipine：application in anaesthesia. Practice J Clin Anesth，1995，7∶525-531.
3，Nishiyama T，Matsakawa T，Hanaoka K，et al.Interaction between nicardipine and enflurane，isoflurane and sevoflurane.Br J Anaesth，1997，10∶1070-1076.
4，王军，张佩瑾，章鲁，等.维拉帕米和Mn2+对缺氧及复氧单心肌细胞游离Ca2+的影响.中国病理生理杂志，1996，6∶95-97.
5，Borgers M，Shu LG，Xhonneux R，et al.Changes in ultrastructure and Ca2+ distribution in the isolated working rabbit heart after ischemia：a time-related study.Am J Pathol，1987，126∶92-102.
6，Tschirkov A，Mishev B，Natschev G，et al.Perioperative myocardial protection with the calcium antagonist diltiazem.Eur J Cardiothorac Surg，1992，6∶225-235.
收稿：1999-07-09, 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属仁济医院麻醉科，200001
关键词：尼卡地平；缺氧；心肌保护；钙离子
临床麻醉学杂志000708
摘要 目的：研究尼卡地平对缺氧/复氧心肌细胞损害及细胞内Ca2+的影响。方法：培养4～5天原代SD大鼠心肌细胞分为正常对照、单纯缺氧/复氧以及低剂量和高剂量(终浓度分别为30ng/ml和270ng/ml)的尼卡地平预防用药20分钟后缺氧/复氧四组。实验结束测定培养液乳酸脱氢氧酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性以及细胞内Ca2+含量。结果：缺氧复氧后，心肌细胞内游离Ca2+浓度，以及培养液中LDH和CK活性显著升高。高剂量尼卡地平能明显减轻这种升高，而低浓度尼卡地平则无明显影响。结论：高浓度尼卡地平减轻缺氧/复氧心肌细胞Ca2+超载，对心肌细胞产生一定保护作用。
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Effect of Nicardipine on Anoxia-Reoxygenation Injury and Intracellular Calcium in Primary Culture Myocardial Cells
Peng Zhanglong，Hang Yannan，Sun Dajin
(Department of Anesthesiology，Renji Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai 200001)
Abstract Objective：To study the effect of nicardipine on anoxia-reoxygenation injury and intracellular calcium in primary culture myocardial cells.Methods：Myocardial cells，cultured in 1640 culture medium for 4-5 days，were assigned to control group，anoxia-reoxygenation group and treating with nicardipine(30ng/ml or 270 ng/ml in final concentration) followed anoxia-reoxygenation group.Intracellular free calcium in single cell and lactic dehydrogenase(LDH) and creatine kinase (CK) in culture medium were measured at the end of experiment.Results：High dose(270ng/ml) of nicardipine significantly attenuated the great increases of intracellular calcium，or LDH and CK in culture medium caused by anoxia-reoxygenation， but low dose of it did not.Conclusion：High dose of nicardipine protects myocardium cells from anoxia-reoxygenation injury at extent through decreasing intracellular calcium.
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Key words Nicardipine Anoxia Myocardium protection Calcium
尼卡地平是Ⅱ类新型短效钙通道阻滞剂，对冠脉、外周血管及心脏的Ca2+通道均有阻滞作用[1，2]。本实验采用SD乳鼠原代培养心肌细胞，建立缺氧/复氧模型，研究预防性应用尼卡地平对缺氧/复氧心肌细胞损害及细胞内游离Ca2+的影响。
材料与方法
心肌细胞培养 无菌条件下取出日龄2～3天SD大鼠心室，0.125%胰蛋白酶消化，机械振荡，分离成单个细胞，用含15%小牛血清1640培养液，在37℃、CO2培养箱中，预培养1小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化后的心肌细胞，按5×105cells/孔接种到24孔培养板(用于测定心肌酶)，1×106cells/孔接种于6孔培养板(每孔置一盖玻片，细胞贴玻片生长，用于测定细胞内游离Ca2+)，隔天换培养液，培养4～5天用于实验。实验前24小时换培养液。
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分组及药物处理 细胞按培养孔随机分为四组。正常对照组：细胞不经任何处理；单纯缺氧/复氧组：每孔细胞内加入预防用药组等体积的生理盐水，20分钟后进行缺氧2小时复氧1小时；尼卡地平预防用药组又分为常用药量血药浓度组[3]和高浓度组，分别于缺氧/复氧前20分钟加入终浓度为30ng/ml和270ng/ml的尼卡地平。
缺氧/复氧模型建立 培养板细胞置于小无菌密闭容器，放在恒温水浴箱内保持37℃，进气口通入95%N2+5%CO2混合气体，经出气口流出使容器内保持无氧状态，2小时后，将细胞放回37℃ CO2培养箱，继续培养1小时。
观察指标 (1)心肌酶：实验结束取培养液，经HITACHI 7150全自动生化分析仪比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性。(2)心肌细胞内游离Ca2+测定[4]：实验结束后，贴玻片生长的心肌细胞以Hepes缓冲液洗两次，再以含终浓度为10μmol Fura-2/AM Hepes缓冲液孵育细胞30分钟，用Hepes缓冲液洗两次后，将贴玻片细胞置于倒置荧光显微镜下，以340nm的紫外光激发标本，并通过计算机图象处理技术测得单细胞的荧光强度(每组测10个细胞)，将此测得值和Ca2+的浓度-荧光强度标准曲线相对照，获得相应细胞内Ca2+浓度。
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统计分析 所有数据以均数±标准差(
±s)表示，采用方差分析F检验，P<0.05为有统计学差异。结果
尼卡地平对LDH和CK的影响 与对照组比，单纯缺氧/复氧使LDH和CK的释放显著升高(P<0.01)，缺氧/复氧前预防性用尼卡地平30ng/ml并不能明显降低LDH和CK的释放，270ng/ml的尼卡地平能显著减轻缺氧/复氧引起的LDH和CK的释放，但仍明显高于正常对照组，见图1和图2。
图1 尼卡地平对LDH的影响(n＝6)
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图2 尼卡地平对CK的影响(n＝6)
尼卡地平对心肌细胞内Ca2+的影响 正常对照组细胞内游离Ca2+为134.72mol/L，单纯缺氧/复氧使其显著升高至183.85mol/L(P<0.01)；缺氧/复氧前预防性用尼卡地平270ng/ml，能显著减轻细胞内游离Ca2+升高而降至156.92ng/ml(P<0.01)；30ng/ml尼卡地平对其无明显影响，见图3。
讨论
缺氧/复氧时细胞内游离Ca2+超载被认为是造成细胞不可逆损害的原因之一[5]。有报道预防性用钙通道拮抗剂可阻滞或减轻Ca2+超载[6]。本研究采用Fura-2作为荧光探针，运用计算机图象分析技术测定单个心肌细胞内Ca2+含量，结果显示，单纯缺氧/复氧可引起细胞内Ca2+显著升高，临床常用剂量血药浓度的尼卡地平对这种细胞内Ca2+升高无明显影响，高浓度时才显著降低心肌细胞内Ca2+升高，但仍不能降至正常对照水平，表明预防性用尼卡地平减轻缺氧/复氧引起的心肌细胞内Ca2+超载是有限的。其原因可能是心肌细胞内Ca2+含量受许多因素影响，主要包括通过Ca2+通道的Ca2+内流、Na+-Ca2+交换系统和Ca2+泵转运，尼卡地平只阻滞慢钙通道的Ca2+内流，而对其他途径的Ca2+内流无阻断作用。
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图3 尼卡地平对心肌细胞内Ca2+的影响
LDH和CK是心肌细胞内正常代谢酶，心肌细胞的裂解或细胞膜受损，其释放均增加。培养液中LDH和CK活性的升高可反映细胞受损的程度。本研究显示高浓度尼卡地平能明显减轻缺氧/复氧引起的LDH和CK活性的显著升高，而临床常用剂量的血药浓度的尼卡地平则无明显影响，表明高剂量尼卡地平对缺氧/复氧引起的心肌细胞损害有一定的保护作用。
参考文献
1，Kishi Y，Okumura F，Furuya H.Haemodynamic effects of nicardipine hydrochloride：studies during its use to control acute hypertension in anaesthetized patients.Br J Anaesth，1984，56∶1003-1007.
, http://www.100md.com
2，Tobias JD.Nicardipine：application in anaesthesia. Practice J Clin Anesth，1995，7∶525-531.
3，Nishiyama T，Matsakawa T，Hanaoka K，et al.Interaction between nicardipine and enflurane，isoflurane and sevoflurane.Br J Anaesth，1997，10∶1070-1076.
4，王军，张佩瑾，章鲁，等.维拉帕米和Mn2+对缺氧及复氧单心肌细胞游离Ca2+的影响.中国病理生理杂志，1996，6∶95-97.
5，Borgers M，Shu LG，Xhonneux R，et al.Changes in ultrastructure and Ca2+ distribution in the isolated working rabbit heart after ischemia：a time-related study.Am J Pathol，1987，126∶92-102.
6，Tschirkov A，Mishev B，Natschev G，et al.Perioperative myocardial protection with the calcium antagonist diltiazem.Eur J Cardiothorac Surg，1992，6∶225-235.
收稿：1999-07-09, 百拇医药