正常人髋关节滑膜细胞有限细胞系的建立及其生物学特性的研究
作者：蔡谞 王继芳 卢世璧 黄靖香 顾铮 张曙光 侯宁
单位：蔡谞 王继芳 卢世璧(100853 北京，解放军总医院骨科)；黄靖香 顾铮 张曙光 侯宁(解放军总医院病理科)
关键词：髋关节；滑膜；细胞培养；体外研究；生物学
中华骨科杂志000712
【摘要】目的建立正常人髋关节滑膜细胞系，为进一步研究磨损颗粒在骨-假体界面的作用机制提供体外实验模型。方法从正常人髋关节滑膜取材，纱巾组织块法原代培养，1∶2传代培养，进行活细胞形态、组织学和电镜观察，测定细胞增殖及活性参数，鉴定细胞染色体，以鼠抗人CD68单克隆抗体做免疫组化染色(SABC)，分析细胞类型。结果原代培养14d滑膜细胞从组织块边缘逸出，21d密集生长开始传代。传代细胞12h内完全贴壁，分裂指数第4d最高，然后回落，细胞数量逐渐增加，第7d达高峰，倍增时间为25.3h。传至21代，细胞生长及特性稳定，染色体正常。第5代冻存细胞复苏良好。细胞系由形态、核型和超微结构不同的大、小两种细胞构成，其中小型细胞CD68阳性，占23.17%±5.60%(
±s)。结论体外培养可获得生物学特性稳定的正常人髋关节滑膜细胞系，并保留巨噬细胞样细胞(MCs)和成纤维细胞样细胞(FCs)，其不同的形态特征为镜下区分提供了依据，是研究磨损颗粒作用机制较好的体外模型。
, 百拇医药
Establishment of finite synoviocyte line of normal human hip joint
CAI Xu
(Department of Orthopaedics, General Hospital of Chinese People s Liberation Army, Beijing 100853, China)
WANG Jifang, LU Shibi, et al.
【 Abstract】 Objective To establish a finite synoviocyte system of normal human hip joint as an in vitro model for the study of wear particles. Methods Synovial membrane was obtained from the normal hip joint of a 64- year- old man and was primarily cultured by gauze kerchief technique. After primary synoviocytes were obtained, the cells were subcultured to the secondary generation. Living cell configuration, histologic and ultrastructural feature of synoviocyte was observed. The proliferation and active parameter were also determined. CD68 monoclonal antibody was used to distinguish different kinds of cells in the system (SABC technique). Results 14 days after primary culture, synoviocyte began to move out from the edge of synovium tissue. The cells began to grow thickly after 21 days and then subculture was performed. The subcultured cells completely anchored in 12 hours. Mitotic index was highest at the 4 days and then declined. The amount of cells increased gradually and arrived at the peak at the 7th day. The doubling time was 25.3 hours. The feature of cells remained stable till 21st passage and the chromosome analysis was normal. The cell line consisted of two kinds of cells with different configurations; the ultrastructure showed the small one being CD68 positive occupying 23.17% ± 5.60% (± s). Conclusion Finite synoviocyte line of normal human hip joint can be established in vitro with stable biological feature. The macrophage-like cells (MCs) and fibroblast-like cells (FCs) can be reserved in the system and can be distinguished by different configuration feature. The synoviocyte system is a preferable in vitro model in the study of wear particles.
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【 Key words】 Hip joint; Synovial; Cell culture; In vitro; Biology
磨损颗粒在界面组织中主要引起以巨噬细胞为基础的慢性异物炎症反应和成纤维细胞的大量增生，但界膜组织细胞成分复杂，影响因素较多，不利于分析磨损颗粒的致病机制。由于滑膜组织同时具备巨噬细胞样细胞(macrophage-likecells，MCs)和成纤维细胞样细胞(fibroblast-likecells，FCs)，并已有作者向动物膝关节腔内注入人工关节材料颗粒以模拟松动人工关节假体周围的生物学反应[1-3]。因此，本实验利用体外培养技术，从人髋关节滑膜取材，建立正常人髋关节滑膜细胞有限细胞系并观察其生物学特性，为体外研究磨损颗粒对巨噬细胞和成纤维细胞的影响提供实验手段。
材料与方法
一、组织来源
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取因股骨颈骨折行人工关节置换术的64岁男性患者近髋臼缘处的未受损伤的正常滑膜组织(图1)，约1.0g，Hank液冲洗3min后剪成约1mm3的碎组织块。
二、滑膜细胞的培养和传代
将滑膜组织块均匀散布于无菌培养瓶中的尼龙纱巾上，直接加入含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养液适量，置37℃体积分数为5%的CO2恒温孵箱中行纱巾组织块法原代培养[4]。当组织块边缘逸出滑膜细胞并连接成片时，用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶1ml消化1～2min，视原代细胞数量多少加入2～3倍量的培养液，吹打制成细胞悬液，分装成2或3瓶作传代培养。传代细胞呈单层密集贴壁生长后，以同样方法再次传代。在部分培养瓶中预置盖玻片条，使细胞亦贴盖玻片生长以备组织学观察。
三、滑膜细胞生物学特性检测
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1.活细胞形态、组织学及电镜观察
每日在相差及微分干涉倒置显微镜下观察活细胞形态、生长情况及分裂状态。将长有单层滑膜细胞的盖玻片条置于体积分数为10%的中性甲醛中固定，分别行HE、Giemsa、PAS和透明质酸酶组化染色，光镜下观察。以细胞呈网格状贴片生长的盖玻片条制备SEM标本，在日立S-800电镜下观察细胞表面结构；将第5代滑膜细胞悬液以2000r/min离心，沉淀块制备TEM标本，日立H-7000电镜下观察细胞超微结构。
2.细胞增殖及活性参数测定
(1)生长曲线及倍增时间:将第18代滑膜细胞按1×104/ml的浓度传至21个培养瓶(4ml/瓶)中继续培养，每天对其中3瓶做细胞计数，取均值绘制生长曲线。倍增时间=0.301T/(logN2-logN1)[5]。(2)分裂指数:做生长曲线的同时，将相同浓度的细胞悬液按1ml/瓶加入21个含盖玻片条的青霉素瓶中。每天取出3条盖玻片，经体积分数为10%的中性甲醛固定，Giemsa染色后光镜下计1000个细胞中的分裂细胞数并求均值为分裂指数。
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3.染色体分析
取第15代处于指数生长期的滑膜细胞，制备染色体标本[6]，计50个中期核分裂相细胞的染色体数并观察其核型。
4.免疫组化染色
将甲醛固定的第15代传代细胞盖玻片条按预聚合SABC法，用巨噬细胞特异的鼠抗人CD68单克隆抗体做免疫组化染色。取30个视野分别计算100个细胞中的阳性细胞数，求均值得出CD68阳性细胞比例。
结果
一、建系经过
原代培养14d可见细胞从滑膜组织块边缘逸出，部分沿纱巾的纤维网格爬行生长，另有部分散落于培养瓶壁呈贴附生长。21d形成密集的单层细胞铺满瓶壁，部分区域呈堆积生长，予传第1代。以后每隔5d传代一次至第21代。细胞生长及特性稳定，无微生物污染。第5代冻存细胞复苏良好，生长无异常。
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二、形态学观察
传代细胞一般在12h内完全贴壁，初期多呈网格状分布生长(图2)，以后随细胞数量增加而逐渐紊乱，无明确的方向性排列特征。细胞形态以梭形为主，两极胞突细长，末端多与邻近细胞连接并交织成网状。网间散布有较多小星形或多边形细胞，与梭形细胞紧密连接。分裂相多见，密集生长时细胞形态不易辨别(图3)。
HE和Giemsa染色示多数细胞肥大，胞浆内有较多分泌泡，胞核巨大呈圆形或椭圆形，核仁明显(1～6个)，染色质着色较浅。少部分细胞及其胞核均较小,核仁不多见，染色质着色较深，呈颗粒状。PAS染色呈阳性反应，大型细胞胞浆内有大量粉红色分泌颗粒，小型细胞则少或无。透明质酸酶染色阴性。
三、超微结构观察
SEM下见多数细胞宽大扁平，表面平滑，微绒毛少或无，高倍镜下可见胞膜有微孔与外界相通；少部分细胞呈梭形或星形，胞体相对小而饱满，表面有大量皱褶和/或微绒毛，多散在依附于扁平细胞或位于细胞间隙，由胞突与周围细胞相连(图4)。
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TEM下见有两种类型的细胞:(1)细胞大，粗面内质网发达且管腔扩张，较多线粒体，高尔基体存在但不丰富，有大量分泌颗粒散布于胞浆内，核大，可有切迹，染色质相对疏松，核仁明显。(2)数量少，有丰富的微绒毛，胞浆内含较多溶酶体和吞噬空泡，核相对较小，染色质电子密度高，核仁少见(图5)。
四、细胞生长特征
1.细胞生长曲线及倍增时间
接种后第2d细胞数量稍有减少，提示部分细胞因不贴壁死亡而丢失，此后细胞数量逐渐增加并于第7d达到高峰，而后又有所下降。倍增时间为25.3h。
2.细胞分裂指数
细胞分裂指数总体水平较低，与其高分化程度一致。接种第4d其分裂指数最高，然后回落。
五、染色体分析
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培养细胞染色体数23对，均为二倍体，未发现异常染色体，提示正常人髋关节滑膜细胞经培养和传代后仍能保持正常核型。
六、CD68免疫组化标记
部分滑膜细胞胞浆及胞膜呈棕褐色阳性反应(图6)，所占比例平均为23.17%±5.60%(x±s)。阳性细胞较小且形态不一致，以梭形和星形为主，部分呈类圆形，散在分布于每一细胞集落中，符合组织学和电镜观察所见小型细胞。
讨论
一、生物学特性
体外培养的正常人髋关节滑膜细胞在形态及生长特性上与培养的其他关节滑膜细胞基本相符[7，8]，但本实验采用HE和Giemsa染色所见的小核细胞却未见报道。另外，PAS染色阳性表明滑膜细胞活跃地分泌粘蛋白，这与其生成滑液以营养关节软骨并润滑关节的功能相一致。透明质酸酶阴性也符合滑膜细胞产生而非清除透明质酸的功能[9]。
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图1正常滑膜组织CD68免疫组化染色×20图2传代培养滑膜细胞初期倒置显微镜×20图3传代培养滑膜细胞密集生长，形态不易辨别倒置显微镜×20图4可见滑膜细胞系中含大、小两种类型细胞Giemsa染色×40图5TEM下见大型细胞粗面内质网发达且管腔扩张，核大，染色质疏松，核仁明显；小型细胞微绒毛丰富，胞浆内含较多溶酶体和吞噬空泡，核小，核仁少见×3500图6传代培养的滑膜细胞，小型细胞呈阳性反应CD68免疫组化染色×20
滑膜细胞主要来自中胚层的间质细胞，在不冻存和反复传代的条件下，传30～50代可保持生物学特性相对稳定[6]。但细胞仍应在原代培养期或传代培养后早期冻存，以尽量减少变性，保证其应用的可靠性。
二、细胞分型
由于体外培养的滑膜细胞贴壁后均呈类成纤维细胞样生长，因而较多作者认为仅在光镜下从形态上较难区分其细胞类型。虽然也有作者试图以吞噬活性或贴壁早晚作为区分体外培养滑膜细胞类型的依据[4,7]，但均不甚确切。本实验从超微结构及CD68免疫组化标记两个方面对其进行了观察，表明体外培养滑膜细胞可在一定程度上以形态分型。
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1.超微结构分型
由于正常滑膜细胞的超微形态和结构涉及它们的来源及其功能的区分，因而自Barland[10]提出A、B两种滑膜内衬细胞类型以来，虽然有关其超微结构的研究已有许多报道，但在某些方面仍存在争议。
就其超微形态和表面结构而言，虽有作者发现滑膜细胞分为表面光滑和分布有少量微细绒毛两种，并认为普通纤维细胞所不具备的表面微细绒毛结构可能对滑膜细胞提高滑液的附着和分泌程度有重要作用[8]。但他们所描述的这两种不同表面形态的细胞显然属于同一类细胞，这与本实验观察到的部分宽大扁平细胞确有少量微细绒毛是一致的。然而本实验发现，体外培养的滑膜细胞中还存在另一种形态和表面结构与前者有明显差别的细胞，这种细胞相对较小，其表面完全由皱褶和/或微绒毛构成，该特征与单核吞噬细胞相似，提示它们可能与正常滑膜吞噬清除关节腔内残渣及注入颗粒的功能有关。
滑膜内衬细胞有不同类型的超微结构特征已取得多数作者的共识，并据此对其进行了分型，即A型-MCs和B型-FCs[11]。Herderson等[12]发现A型细胞核染色质相对致密，少有核仁，微绒毛较多，胞浆内含众多溶酶体和吞噬空泡，为吞噬性细胞；B型细胞核染色质疏松，含许多核仁，有发达的粗面内质网，胞浆内存有大量致密分泌颗粒[9]，为合成和分泌性细胞[11]，这与本实验的观察结果相符。有作者将超微结构特征不典型的细胞列为AB型细胞。Graabaek[13]和Edwards等[14]在对鼠滑膜的研究中证明，至少有部分A型细胞来源于血液循环中的骨髓衍生单核细胞，提示A、B型细胞不是同种细胞的两种功能状态。因此认为，所谓AB型细胞可能是A型细胞在病理状态下接受特异性抗原或非特异性因素刺激后合成、分泌细胞因子和炎性介质的功能增强，因而其与蛋白合成有关的粗面内质网等超微结构有所增加，形态也发生相应改变。由于它们的来源可能不同，缺乏相互转化的生物学基础，故两者之间仍存在本质的区别。
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从超微形态结构分析，A型细胞即为SEM下所见表面有大量皱褶和微绒毛的小型细胞。
2.免疫组化分型
由于认为滑膜A型细胞属于体内单核吞噬细胞系统，因此用巨噬细胞特异抗原CD68单克隆抗体进行免疫组化标记可能是鉴别两种类型滑膜细胞较为可靠的方法。
Wilkinson等[15]的研究发现，正常滑膜组织由CD68阳性的MCs和含高活性尿苷二磷酸葡糖脱氢酶(UDPGD)的FCs构成，证明滑膜A型细胞确为体内单核吞噬细胞系统的成员，与巨噬细胞密切相关。它们可能源于血液中的骨髓衍生单核细胞(Mo)，随血流迁移至滑膜组织，在局部微环境的影响下进一步分化成熟为MCs，并展现其特有的生物学效应。本实验用免疫组化的方法进一步证实体外培养的滑膜细胞中存在CD68阳性的细胞，它们形态各异，且胞体和胞核均相对较小，与HE或Giemsa染色所见小核细胞一致，并且支持A型细胞的电镜特征[9]，这些特点为光镜下区分两类滑膜细胞提供了依据。
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正常人滑膜中何种细胞占优势也有不同报道。有作者据电镜所见认为，正常情况下以与滑膜吞噬功能有关的A型细胞为主，说明滑膜细胞的形态结构变化取决于其功能状态[14]。但Pasquali-Ronchetti等[16]则认为这与年龄有关，因为人胚胎滑膜中B型细胞居多，而老年人滑膜中A型细胞占优势。本实验滑膜组织虽取自老年人，但体外培养的滑膜细胞中CD68阳性的A型细胞并不多，约占23%，与Fox等[17]的报告一致(20%～30%)。考虑可能与体外传代培养过程中A型细胞容易丢失有关，但更可能提示正常滑膜的功能状态并非以吞噬为主，因而决定了A型细胞本身并不占主导地位。
三、应用于磨损颗粒生物学研究的依据
目前认为，磨损颗粒刺激骨-假体界面组织中巨噬细胞引起的一系列细胞因子介导的生物学反应可能是导致假体周围骨溶解、界面纤维组织增生以及最终人工关节无菌性松动的重要原因。因此，体外研究较多采用动物腹腔或肺泡灌洗液中的巨噬细胞及末梢血单核细胞来观察其对磨损颗粒的反应[18,19]。但这些细胞的生物学特性与局部组织巨噬细胞有所不同，同时由于界面组织中的成纤维细胞可能直接或通过巨噬细胞间接对磨损颗粒产生反应，导致其大量增殖并诱导胶原酶的合成而同样对人工关节松动产生影响。因此，有必要将这两种细胞置于同一反应体系中进行研究，滑膜的细胞构成恰好满足该要求。基于内衬层滑膜具有清除关节腔内残渣及外界注入颗粒的功能，已有作者在人工关节无菌性松动机制的研究中采用膝关节腔内注射磨损颗粒的动物模型，以观察不同人工关节材料颗粒引起的滑膜组织学反应，但尚不能除外体内其他因素的干扰[1-3]。因此，体外建立封闭的正常人髋关节滑膜细胞系是在细胞学和分子生物学水平研究磨损颗粒作用机制的较好选择。同时，滑膜细胞对培养液无特殊要求，体外培养贴附性好、适应性强及易于生长繁殖的特点，也使该细胞系的建立及研究应用成为可能。
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39800161)
参考文献
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(收稿日期:1999-06-24), 百拇医药
单位：蔡谞 王继芳 卢世璧(100853 北京，解放军总医院骨科)；黄靖香 顾铮 张曙光 侯宁(解放军总医院病理科)
关键词：髋关节；滑膜；细胞培养；体外研究；生物学
中华骨科杂志000712
【摘要】目的建立正常人髋关节滑膜细胞系，为进一步研究磨损颗粒在骨-假体界面的作用机制提供体外实验模型。方法从正常人髋关节滑膜取材，纱巾组织块法原代培养，1∶2传代培养，进行活细胞形态、组织学和电镜观察，测定细胞增殖及活性参数，鉴定细胞染色体，以鼠抗人CD68单克隆抗体做免疫组化染色(SABC)，分析细胞类型。结果原代培养14d滑膜细胞从组织块边缘逸出，21d密集生长开始传代。传代细胞12h内完全贴壁，分裂指数第4d最高，然后回落，细胞数量逐渐增加，第7d达高峰，倍增时间为25.3h。传至21代，细胞生长及特性稳定，染色体正常。第5代冻存细胞复苏良好。细胞系由形态、核型和超微结构不同的大、小两种细胞构成，其中小型细胞CD68阳性，占23.17%±5.60%(
±s)。结论体外培养可获得生物学特性稳定的正常人髋关节滑膜细胞系，并保留巨噬细胞样细胞(MCs)和成纤维细胞样细胞(FCs)，其不同的形态特征为镜下区分提供了依据，是研究磨损颗粒作用机制较好的体外模型。, 百拇医药
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CAI Xu
(Department of Orthopaedics, General Hospital of Chinese People s Liberation Army, Beijing 100853, China)
WANG Jifang, LU Shibi, et al.
【 Abstract】 Objective To establish a finite synoviocyte system of normal human hip joint as an in vitro model for the study of wear particles. Methods Synovial membrane was obtained from the normal hip joint of a 64- year- old man and was primarily cultured by gauze kerchief technique. After primary synoviocytes were obtained, the cells were subcultured to the secondary generation. Living cell configuration, histologic and ultrastructural feature of synoviocyte was observed. The proliferation and active parameter were also determined. CD68 monoclonal antibody was used to distinguish different kinds of cells in the system (SABC technique). Results 14 days after primary culture, synoviocyte began to move out from the edge of synovium tissue. The cells began to grow thickly after 21 days and then subculture was performed. The subcultured cells completely anchored in 12 hours. Mitotic index was highest at the 4 days and then declined. The amount of cells increased gradually and arrived at the peak at the 7th day. The doubling time was 25.3 hours. The feature of cells remained stable till 21st passage and the chromosome analysis was normal. The cell line consisted of two kinds of cells with different configurations; the ultrastructure showed the small one being CD68 positive occupying 23.17% ± 5.60% (
± s). Conclusion Finite synoviocyte line of normal human hip joint can be established in vitro with stable biological feature. The macrophage-like cells (MCs) and fibroblast-like cells (FCs) can be reserved in the system and can be distinguished by different configuration feature. The synoviocyte system is a preferable in vitro model in the study of wear particles., http://www.100md.com
【 Key words】 Hip joint; Synovial; Cell culture; In vitro; Biology
磨损颗粒在界面组织中主要引起以巨噬细胞为基础的慢性异物炎症反应和成纤维细胞的大量增生，但界膜组织细胞成分复杂，影响因素较多，不利于分析磨损颗粒的致病机制。由于滑膜组织同时具备巨噬细胞样细胞(macrophage-likecells，MCs)和成纤维细胞样细胞(fibroblast-likecells，FCs)，并已有作者向动物膝关节腔内注入人工关节材料颗粒以模拟松动人工关节假体周围的生物学反应[1-3]。因此，本实验利用体外培养技术，从人髋关节滑膜取材，建立正常人髋关节滑膜细胞有限细胞系并观察其生物学特性，为体外研究磨损颗粒对巨噬细胞和成纤维细胞的影响提供实验手段。
材料与方法
一、组织来源
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取因股骨颈骨折行人工关节置换术的64岁男性患者近髋臼缘处的未受损伤的正常滑膜组织(图1)，约1.0g，Hank液冲洗3min后剪成约1mm3的碎组织块。
二、滑膜细胞的培养和传代
将滑膜组织块均匀散布于无菌培养瓶中的尼龙纱巾上，直接加入含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养液适量，置37℃体积分数为5%的CO2恒温孵箱中行纱巾组织块法原代培养[4]。当组织块边缘逸出滑膜细胞并连接成片时，用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶1ml消化1～2min，视原代细胞数量多少加入2～3倍量的培养液，吹打制成细胞悬液，分装成2或3瓶作传代培养。传代细胞呈单层密集贴壁生长后，以同样方法再次传代。在部分培养瓶中预置盖玻片条，使细胞亦贴盖玻片生长以备组织学观察。
三、滑膜细胞生物学特性检测
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1.活细胞形态、组织学及电镜观察
每日在相差及微分干涉倒置显微镜下观察活细胞形态、生长情况及分裂状态。将长有单层滑膜细胞的盖玻片条置于体积分数为10%的中性甲醛中固定，分别行HE、Giemsa、PAS和透明质酸酶组化染色，光镜下观察。以细胞呈网格状贴片生长的盖玻片条制备SEM标本，在日立S-800电镜下观察细胞表面结构；将第5代滑膜细胞悬液以2000r/min离心，沉淀块制备TEM标本，日立H-7000电镜下观察细胞超微结构。
2.细胞增殖及活性参数测定
(1)生长曲线及倍增时间:将第18代滑膜细胞按1×104/ml的浓度传至21个培养瓶(4ml/瓶)中继续培养，每天对其中3瓶做细胞计数，取均值绘制生长曲线。倍增时间=0.301T/(logN2-logN1)[5]。(2)分裂指数:做生长曲线的同时，将相同浓度的细胞悬液按1ml/瓶加入21个含盖玻片条的青霉素瓶中。每天取出3条盖玻片，经体积分数为10%的中性甲醛固定，Giemsa染色后光镜下计1000个细胞中的分裂细胞数并求均值为分裂指数。
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3.染色体分析
取第15代处于指数生长期的滑膜细胞，制备染色体标本[6]，计50个中期核分裂相细胞的染色体数并观察其核型。
4.免疫组化染色
将甲醛固定的第15代传代细胞盖玻片条按预聚合SABC法，用巨噬细胞特异的鼠抗人CD68单克隆抗体做免疫组化染色。取30个视野分别计算100个细胞中的阳性细胞数，求均值得出CD68阳性细胞比例。
结果
一、建系经过
原代培养14d可见细胞从滑膜组织块边缘逸出，部分沿纱巾的纤维网格爬行生长，另有部分散落于培养瓶壁呈贴附生长。21d形成密集的单层细胞铺满瓶壁，部分区域呈堆积生长，予传第1代。以后每隔5d传代一次至第21代。细胞生长及特性稳定，无微生物污染。第5代冻存细胞复苏良好，生长无异常。
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二、形态学观察
传代细胞一般在12h内完全贴壁，初期多呈网格状分布生长(图2)，以后随细胞数量增加而逐渐紊乱，无明确的方向性排列特征。细胞形态以梭形为主，两极胞突细长，末端多与邻近细胞连接并交织成网状。网间散布有较多小星形或多边形细胞，与梭形细胞紧密连接。分裂相多见，密集生长时细胞形态不易辨别(图3)。
HE和Giemsa染色示多数细胞肥大，胞浆内有较多分泌泡，胞核巨大呈圆形或椭圆形，核仁明显(1～6个)，染色质着色较浅。少部分细胞及其胞核均较小,核仁不多见，染色质着色较深，呈颗粒状。PAS染色呈阳性反应，大型细胞胞浆内有大量粉红色分泌颗粒，小型细胞则少或无。透明质酸酶染色阴性。
三、超微结构观察
SEM下见多数细胞宽大扁平，表面平滑，微绒毛少或无，高倍镜下可见胞膜有微孔与外界相通；少部分细胞呈梭形或星形，胞体相对小而饱满，表面有大量皱褶和/或微绒毛，多散在依附于扁平细胞或位于细胞间隙，由胞突与周围细胞相连(图4)。
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TEM下见有两种类型的细胞:(1)细胞大，粗面内质网发达且管腔扩张，较多线粒体，高尔基体存在但不丰富，有大量分泌颗粒散布于胞浆内，核大，可有切迹，染色质相对疏松，核仁明显。(2)数量少，有丰富的微绒毛，胞浆内含较多溶酶体和吞噬空泡，核相对较小，染色质电子密度高，核仁少见(图5)。
四、细胞生长特征
1.细胞生长曲线及倍增时间
接种后第2d细胞数量稍有减少，提示部分细胞因不贴壁死亡而丢失，此后细胞数量逐渐增加并于第7d达到高峰，而后又有所下降。倍增时间为25.3h。
2.细胞分裂指数
细胞分裂指数总体水平较低，与其高分化程度一致。接种第4d其分裂指数最高，然后回落。
五、染色体分析
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培养细胞染色体数23对，均为二倍体，未发现异常染色体，提示正常人髋关节滑膜细胞经培养和传代后仍能保持正常核型。
六、CD68免疫组化标记
部分滑膜细胞胞浆及胞膜呈棕褐色阳性反应(图6)，所占比例平均为23.17%±5.60%(x±s)。阳性细胞较小且形态不一致，以梭形和星形为主，部分呈类圆形，散在分布于每一细胞集落中，符合组织学和电镜观察所见小型细胞。
讨论
一、生物学特性
体外培养的正常人髋关节滑膜细胞在形态及生长特性上与培养的其他关节滑膜细胞基本相符[7，8]，但本实验采用HE和Giemsa染色所见的小核细胞却未见报道。另外，PAS染色阳性表明滑膜细胞活跃地分泌粘蛋白，这与其生成滑液以营养关节软骨并润滑关节的功能相一致。透明质酸酶阴性也符合滑膜细胞产生而非清除透明质酸的功能[9]。
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图1正常滑膜组织CD68免疫组化染色×20图2传代培养滑膜细胞初期倒置显微镜×20图3传代培养滑膜细胞密集生长，形态不易辨别倒置显微镜×20图4可见滑膜细胞系中含大、小两种类型细胞Giemsa染色×40图5TEM下见大型细胞粗面内质网发达且管腔扩张，核大，染色质疏松，核仁明显；小型细胞微绒毛丰富，胞浆内含较多溶酶体和吞噬空泡，核小，核仁少见×3500图6传代培养的滑膜细胞，小型细胞呈阳性反应CD68免疫组化染色×20
滑膜细胞主要来自中胚层的间质细胞，在不冻存和反复传代的条件下，传30～50代可保持生物学特性相对稳定[6]。但细胞仍应在原代培养期或传代培养后早期冻存，以尽量减少变性，保证其应用的可靠性。
二、细胞分型
由于体外培养的滑膜细胞贴壁后均呈类成纤维细胞样生长，因而较多作者认为仅在光镜下从形态上较难区分其细胞类型。虽然也有作者试图以吞噬活性或贴壁早晚作为区分体外培养滑膜细胞类型的依据[4,7]，但均不甚确切。本实验从超微结构及CD68免疫组化标记两个方面对其进行了观察，表明体外培养滑膜细胞可在一定程度上以形态分型。
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1.超微结构分型
由于正常滑膜细胞的超微形态和结构涉及它们的来源及其功能的区分，因而自Barland[10]提出A、B两种滑膜内衬细胞类型以来，虽然有关其超微结构的研究已有许多报道，但在某些方面仍存在争议。
就其超微形态和表面结构而言，虽有作者发现滑膜细胞分为表面光滑和分布有少量微细绒毛两种，并认为普通纤维细胞所不具备的表面微细绒毛结构可能对滑膜细胞提高滑液的附着和分泌程度有重要作用[8]。但他们所描述的这两种不同表面形态的细胞显然属于同一类细胞，这与本实验观察到的部分宽大扁平细胞确有少量微细绒毛是一致的。然而本实验发现，体外培养的滑膜细胞中还存在另一种形态和表面结构与前者有明显差别的细胞，这种细胞相对较小，其表面完全由皱褶和/或微绒毛构成，该特征与单核吞噬细胞相似，提示它们可能与正常滑膜吞噬清除关节腔内残渣及注入颗粒的功能有关。
滑膜内衬细胞有不同类型的超微结构特征已取得多数作者的共识，并据此对其进行了分型，即A型-MCs和B型-FCs[11]。Herderson等[12]发现A型细胞核染色质相对致密，少有核仁，微绒毛较多，胞浆内含众多溶酶体和吞噬空泡，为吞噬性细胞；B型细胞核染色质疏松，含许多核仁，有发达的粗面内质网，胞浆内存有大量致密分泌颗粒[9]，为合成和分泌性细胞[11]，这与本实验的观察结果相符。有作者将超微结构特征不典型的细胞列为AB型细胞。Graabaek[13]和Edwards等[14]在对鼠滑膜的研究中证明，至少有部分A型细胞来源于血液循环中的骨髓衍生单核细胞，提示A、B型细胞不是同种细胞的两种功能状态。因此认为，所谓AB型细胞可能是A型细胞在病理状态下接受特异性抗原或非特异性因素刺激后合成、分泌细胞因子和炎性介质的功能增强，因而其与蛋白合成有关的粗面内质网等超微结构有所增加，形态也发生相应改变。由于它们的来源可能不同，缺乏相互转化的生物学基础，故两者之间仍存在本质的区别。
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从超微形态结构分析，A型细胞即为SEM下所见表面有大量皱褶和微绒毛的小型细胞。
2.免疫组化分型
由于认为滑膜A型细胞属于体内单核吞噬细胞系统，因此用巨噬细胞特异抗原CD68单克隆抗体进行免疫组化标记可能是鉴别两种类型滑膜细胞较为可靠的方法。
Wilkinson等[15]的研究发现，正常滑膜组织由CD68阳性的MCs和含高活性尿苷二磷酸葡糖脱氢酶(UDPGD)的FCs构成，证明滑膜A型细胞确为体内单核吞噬细胞系统的成员，与巨噬细胞密切相关。它们可能源于血液中的骨髓衍生单核细胞(Mo)，随血流迁移至滑膜组织，在局部微环境的影响下进一步分化成熟为MCs，并展现其特有的生物学效应。本实验用免疫组化的方法进一步证实体外培养的滑膜细胞中存在CD68阳性的细胞，它们形态各异，且胞体和胞核均相对较小，与HE或Giemsa染色所见小核细胞一致，并且支持A型细胞的电镜特征[9]，这些特点为光镜下区分两类滑膜细胞提供了依据。
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正常人滑膜中何种细胞占优势也有不同报道。有作者据电镜所见认为，正常情况下以与滑膜吞噬功能有关的A型细胞为主，说明滑膜细胞的形态结构变化取决于其功能状态[14]。但Pasquali-Ronchetti等[16]则认为这与年龄有关，因为人胚胎滑膜中B型细胞居多，而老年人滑膜中A型细胞占优势。本实验滑膜组织虽取自老年人，但体外培养的滑膜细胞中CD68阳性的A型细胞并不多，约占23%，与Fox等[17]的报告一致(20%～30%)。考虑可能与体外传代培养过程中A型细胞容易丢失有关，但更可能提示正常滑膜的功能状态并非以吞噬为主，因而决定了A型细胞本身并不占主导地位。
三、应用于磨损颗粒生物学研究的依据
目前认为，磨损颗粒刺激骨-假体界面组织中巨噬细胞引起的一系列细胞因子介导的生物学反应可能是导致假体周围骨溶解、界面纤维组织增生以及最终人工关节无菌性松动的重要原因。因此，体外研究较多采用动物腹腔或肺泡灌洗液中的巨噬细胞及末梢血单核细胞来观察其对磨损颗粒的反应[18,19]。但这些细胞的生物学特性与局部组织巨噬细胞有所不同，同时由于界面组织中的成纤维细胞可能直接或通过巨噬细胞间接对磨损颗粒产生反应，导致其大量增殖并诱导胶原酶的合成而同样对人工关节松动产生影响。因此，有必要将这两种细胞置于同一反应体系中进行研究，滑膜的细胞构成恰好满足该要求。基于内衬层滑膜具有清除关节腔内残渣及外界注入颗粒的功能，已有作者在人工关节无菌性松动机制的研究中采用膝关节腔内注射磨损颗粒的动物模型，以观察不同人工关节材料颗粒引起的滑膜组织学反应，但尚不能除外体内其他因素的干扰[1-3]。因此，体外建立封闭的正常人髋关节滑膜细胞系是在细胞学和分子生物学水平研究磨损颗粒作用机制的较好选择。同时，滑膜细胞对培养液无特殊要求，体外培养贴附性好、适应性强及易于生长繁殖的特点，也使该细胞系的建立及研究应用成为可能。
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39800161)
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(收稿日期:1999-06-24), 百拇医药