基因枪在肿瘤基因治疗中的应用价值
作者：查园园 林晨 梁萧 付明 张雪艳 吴旻
单位：100021 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室
关键词：生物弹道学；基因疗法；肿瘤
中华医学杂志000715【摘要】目的 研究基因枪经小鼠皮肤转移基因的效率、被转基因的表达量、表达时间，以及对小鼠肿瘤的治疗效果，探讨作为一种新的基因转移工具，基因枪在基因治疗中应用的可能性。方法 (1)用荧光显微镜观察基因枪对体外培养细胞系的基因转导效率和被转基因表达时间；(2) 通过基因枪向小鼠皮肤转Lac-Z基因后，取转基因部位的皮肤做冰冻切片进行β-gal染色，观察转基因蛋白在皮肤中表达的部位；(3) 用ELISA法检测向小鼠皮肤转mGM-CSF基因后，血清中的转基因蛋白表达量，并取转基因部位的皮肤做病理切片，通过观察局部病理改变，推测转基因蛋白在局部的表达情况；(4) 用基因枪向小鼠腹部皮肤转mGM-CSF 10 d后，用肿瘤细胞攻击，观察肿瘤生长情况；(5) 在小鼠右腋下接种肿瘤细胞，1周后进行转基因或注射瘤苗治疗，观察肿瘤生长情况。结果 (1) 基因枪能有效地对体外培养的各种肿瘤细胞系转基因，转导基因的效率是16.5%±9.0%，被转基因可获得较长时间的瞬时表达；(2) 小鼠皮肤冰冻切片染色结果显示，基因枪可有效地将外源基因导入到皮肤表皮4～5层；(3) ELISA结果显示，经皮肤转基因后，血清中GM-CSF蛋白水平显著升高，最高可达对照组的12.5倍。小鼠皮肤病理切片可见到炎性浸润，提示局部有活性的转基因蛋白GM-CSF的表达；(4) 经基因枪转mGM-CSF后，小鼠抵御B16细胞攻击的能力明显增强，肿瘤生长速度显著下降，抑瘤率达43.7%，当基因枪转基因与瘤苗和佐剂联合免疫后，抗瘤效果更加显著，抑瘤率达73.5%；(5) 治疗实验中，每隔2天进行1次转基因治疗，连续治疗4次后，可起到一定的抗瘤效果。结论 基因枪能有效地将外源基因转到体外培养的细胞和经皮肤转导至动物皮下，并能得到较长时间的表达。基因枪是一种简单、安全、有效的转移基因工具，具有良好的应用前景。
, http://www.100md.com
The use of gene gun in cancer gene therapy
ZHA Yuanyuan LIN Chen LIANG Xiao et al.
(National Lab of Molecule Oncology, Cancer Institute, PUMC & CAMS, Beijing, 100021 China)
【Abstract】Objective With Helios gene gun ，the report genes EGFP and Lac-Z were transfected to several cultured mammalian tumor cell lines in vitro and mice skin in vivo, respectively. A stable long time exogene's expression were got. Then , the pWRG3142， which carried mGM-CSF gene was delivered to the abdominal skin of C57BL/6 mice using gene gun. Pathological sections showed the local transproteins' expression companying with a profound inflammation reaction characterized by neutrophilic infiltration . ELISA assay of transfected mouse's serum sample indicated a high improvement of transgenic proteins level ， which demonstrated that transgenic GM-CSF secreted from treated skin into the bloodstream effectively . In B16 melanoma tumor model ， mice immunized with mGM-CSF expression plasmids could be partially protected from 1×105 B16 cells challenge and exhibited a drastically reduced tumor growth rate . Finally， we conclucled that exogenes could be transfected into cultured cell lines and mice skin effectively by gene gun technology ， and gene gun mediated in vivo delivery of GM-CSF cDNA should be further developed for potential clinical testing as an approach for human cancer gene therapy.
, 百拇医药
【Key words】Biolistics； Gene therapy； Cancer
基因治疗对于许多遗传性疾病，恶性肿瘤，传染性疾病的治疗具有巨大的应用潜力[1，2]。而基因治疗应用于临床治疗各种疾病所面临的一个首先需要解决的问题是如何建立一个安全、 高效的基因导入系统。现有的各种已通过药审的导入系统(如腺病毒，逆转录病毒，脂质体等)大多操作复杂，对靶组织(或靶细胞)要求较高，且体内应用效率较低。目前，国际上对一种新的基因转移技术，即基因枪技术介导的基因治疗的报道逐渐增多，用基因枪体外转导GM-CSF基因并经过照射处理的肿瘤细胞做瘤苗，治疗黑色素瘤和肉瘤，已被FDA批准进行Ⅰ、Ⅱ期临床试验。本室于1997年引进了国内第一台Helios基因枪设备，近2年的研究表明，基因枪使用起来方便，安全，具有很好的临床应用前景。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药
1.细胞系与实验动物: 人肺腺癌细胞系GLC-82、人结肠癌细胞系HCT、人膀胱癌细胞系EJ、人肝癌细胞系QSG-7701、小鼠黑色素瘤细胞系B16，均为本室保存，用199培养液(B16用1640培养液)，5% CO2孵箱培养。C57BL/6小鼠(18～22 g)由本所动物室提供。
2.质粒: pAdE1CMV-LacZ (携带报告基因LacZ)，本室构建。pEGFP C1 (携带绿色荧光蛋白的突变体报告基因EGFP)，刘芝华博士提供。 pWRG3142 (携带小鼠GM-CSF基因)、pWRG3224、(空载体)，均由杨宁逊博士惠赠。
3.Helios基因枪，购自Bio-rad公司；ELISA试剂盒，购自Endogen公司；荧光显微镜(OPTON)。
二、方法
1.制作子弹：用亚精胺—氯化钙包裹法将质粒DNA包裹在直径为1.0 μm的金粒上。将金颗粒-质粒DNA乙醇溶液吸入Tefzel管中，使金颗粒沉淀在管的内表面上，吸去乙醇，用氮气将管吹干，将管切成17.7 mm的小段即制成子弹。每个子弹携带有0.5 mg金，1.25 μg DNA。
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2.基因枪向体外培养的肿瘤细胞系转EGFP基因实验：用1 033.5 kPa轰击培养的5种细胞系，转导pEGFP C1后，将细胞系置入37℃，CO2孵箱培养。在不同时间点，取转导基因的细胞系在荧光显微镜下观察，计数发绿色荧光的细胞，调荧光光源到普通光光源，计数同一视野中的细胞，根据2次计数之比，计算转导效率。
3.小鼠经皮肤转LacZ基因实验:取18～20 g的C57BL/6小鼠，除去腹部皮肤上的毛，用Helios基因枪以不同的压力进行轰击，转pAdE1CMV-LacZ。3 d后，断颈法处死动物，取下轰击部位的皮肤，置于生理盐水中，立即送本所中心仪器室做冰冻切片，HE染色，然后进行β-gal 复染，显微镜下观察、照相。
4.小鼠经皮肤转GM-CSF基因实验： 用Helios基因枪以350 g向C57BL/6小鼠腹部分别转pWRG3142和pWRG3224，于转基因后6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d眼眶取血，用ELISA法检测血清中的GM-CSF蛋白水平。同时，取转基因部位的皮肤，10%甲醛固定，送本所中心仪器室做病理切片，显微镜下观察局部皮肤的炎性反应，照相。
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5.小鼠肿瘤预防实验： 将25只C57BL/6小鼠，分成5组，第1、2组于第1天用基因枪经皮肤转pWRG3224， 第3、4、5组转pWRG3142，第2、4组于第2天注射作为瘤苗的经5次反复冻融后的B16细胞的上清，第5组于第2天注射瘤苗的同时，加注25 mg/kg的当归多糖(由中国医学科学院医学生物技术研究所柳钟勋教授提供)作为佐剂，第8天向全部动物右腋下注射1×105个B16细胞，1个月后，断颈法处死动物，剥离肿瘤，称重，照相。
6.小鼠肿瘤治疗实验：取20只C57BL/6小鼠，第1天右腋下注射1×105个B16细胞，待肿瘤长到约2 mm左右，分成4组，第1组为对照组，第2组用基因枪1次轰击4枪，转pWRG3142，1枪位于肿瘤的正上方，3枪位于肿瘤周围。第3组注射瘤苗加注25 mg/kg的当归多糖佐剂，每周1次，连续2次。第4组用基因枪1次轰击1枪，转pWRG3142，隔天1次，共4次。3周后，断颈法处死动物，剥离肿瘤，称重，照相。
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7.统计学处理：差异性显著检验采用t检验。
结果
1.在选定的条件下, 所用的4种人癌细胞系均能成功地被转入并表达EGFP基因。基因枪轰击3 h后,就可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光, 以后每天观察,可见荧光细胞变多，荧光变亮，随后又逐渐减弱，但是直到第12 d,仍能看到微弱的荧光。用方法2中描述的方法计算出的平均转基因效率为16.5%±9.0%，最低为5.3%，最高为33.3%。
2.小鼠皮肤冰冻切片β-gal 染色显示，外源基因可被导入到表皮的第4到5层细胞并表达(图1)。
3.小鼠血清ELISA检测结果：经皮肤转pWRG3142后6 h，小鼠血清中GM-CSF蛋白水平可达260 pg/ml, 为对照(转空载体pWRG3224小鼠)的12.5倍，24 h后为对照的6.5倍，以后5 d中，血清中转基因蛋白水平维持在对照组的2～3倍，提示GM-CSF表达后可由转基因部位进入到血清中。小鼠皮肤病理切片可见到以中性粒细胞和淋巴细胞为主的炎性浸润，提示局部有活性的转基因蛋白的表达，其中在第3天，炎症反应最严重。转空载体的小鼠皮肤病理切片可见到轻微的炎性浸润，提示单纯的基因枪轰击可引起一定的炎症反应(图2)。
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图1 小鼠皮肤转Lac-Z基因冰冻切片，β-gal复染结果 HE×100
图2 小鼠皮肤转GM-CSF基因病理切片 HE×100
4.小鼠肿瘤预防实验结果(表1):经基因枪转pWRG3142后，小鼠抵御B16细胞攻击的能力显著增强，肿瘤生长速度显著下降，抑瘤率达43.7%。当基因枪转基因与瘤苗和佐剂联合免疫后，抗瘤效果更加显著，抑瘤率达73.5%。
表1 小鼠肿瘤预防实验结果(
±s) 组别
鼠数(只)
肿瘤质量(g)
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抑瘤率(%)
P值
PB-3224
5
2.64±0.46
0
-
PB-3224+V
5
1.31±0.48
50.5
<0.002
PB-3142
, 百拇医药
5
1.48±0.88
43.7
<0.03
PB-3142+V
5
0.84±0.48
68.3
<0.001
PB-3142+V+A
5
0.70±0.27
, http://www.100md.com 73.5
<0.001
注：V为瘤苗，A为当归多糖佐剂 5.小鼠肿瘤治疗实验结果：在治疗实验中，第4组动物经每隔2 d进行1次转基因治疗，连续治疗4次后，肿瘤生长速度缓慢，抑瘤率达52.0%；第3组即经注射瘤苗加佐剂进行治疗后，肿瘤生长也受到了抑制，抑瘤率为49.7%；而第2组并未取得治疗效果，与对照第1组相比，肿瘤生长几乎没有变化。
讨论
基因枪技术是一种物理的转基因技术，早期多用于在植物中转移基因。它通过提供给包裹有DNA的金颗粒很高的初速度，使其穿透植物的细胞壁，而达到质粒DNA有效的细胞内转移的目的[3-5]。随后，这项技术被用于哺乳动物实验系统[6]。本实验所用的基因枪是依靠氦气提供给金颗粒很高的初速度，使其穿透靶细胞表面，将目的基因带入细胞内，理论上可以对任何细胞进行基因转移。
, 百拇医药
实验表明，基因枪对体外培养的哺乳动物细胞的转移效率在5.3%～33.3%之间， 与文献报道[7]的20%～30%相比，差别不大。转移效率的差别可能与子弹制备时金颗粒分布不均匀有关，通过控制子弹的制作，有望提高转移效率。
在直接对皮肤转基因实验中，染色结果显示，基因枪只能将基因转到表皮层。大多数被转入基因的细胞为角质化细胞，这些细胞可以表达外源基因，对机体免疫反应的发生起到一定的作用。表皮中的一些树突状细胞也可能被转入外源基因，这些细胞可以移动到附近的区域淋巴结内行使其抗原呈递功能，激活T细胞，引起机体免疫反应[8，9]。对皮肤转GM-CSF基因后，转基因部位皮肤的病理切片观察到以中性粒细胞和淋巴细胞浸润为特征的复杂的急性炎症反应，证明产生的转基因蛋白是具有生物活性的，血清ELISA分析表明，转基因蛋白由局部转移到全身。
在肿瘤预防实验中，用基因枪转GM-CSF基因免疫后的小鼠，抵御B16细胞攻击的能力明显增强，这种能力在基因免疫与传统的瘤苗加佐剂免疫联合后得到进一步的提高。这可能是基因免疫后，转基因蛋白的表达使动物局部和全身的免疫细胞重新分布和激活，免疫应答水平提高，动物抗肿瘤能力增强。在治疗实验中，不同方式的基因治疗所起的疗效也有很大的差别。1次轰击4枪，并没有起到治疗肿瘤的效果，而1次轰击1枪，隔天1次，连续4次的治疗方式则起到了一定的效果，抑瘤率达到了52.0%，但统计学差异无显著意义，今后通过治疗方式的改进，有可能取得显著的治疗效果。
, 百拇医药
基因枪具有安全、操作简单、有效等优点，但是还有一些不足之处。在体外实验中，对培养细胞系的转基因效率不如病毒载体；对于体表(如皮肤)，基因枪介导的基因转移有很大优势，但对于内脏器官，转移基因不易操作，可以考虑发展内镜式基因枪来解决；在直接向动物皮肤转基因时，会造成一定的冲击伤；是否会造成表浅肿瘤转移，有待进一步验证。
基金项目：国家“八六三”高科技计划资助项目(z20-01-02)
参考文献
1，Anderson WF. Human gene therapy. Science，1992，256:808-813.
2，Miller AD. Human gene therapy comes of age. Nature, 1992，357:455-460.
, 百拇医药
3，Klein TM，Wolf JA，Wu R，et al. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature，1987，327:70-73.
4，Klein TM， Fromm M， Weissinger A，et al. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles. Proc Natl Acad Sci USA，1988，85:4305-4309.
5，McCabe DE，Swain WF，Martnell BJ，et al. Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Biotechnology，1988，6:923-926.
, 百拇医药
6，Yang NS，Sun WH，McCabe DE. Developing particle-mediated gene-transfer technology for research into gene therapy of cancer. Mol Med Today，1996，11:476-481.
7，Mahvi DM，Burkholder JK，Turner J，et al. Particle-mediated gene transfer of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor cDNA to tumor cells: Implications for a clinically relevant tumor vaccine. Hum Gene Ther, 1996，7:1535-1543.
8，Klinman DM，Sechler JMG，Conover J，et al. Contribution of cells at the site of DNA vaccination to the generation of antigen-specific immunity and memory. J Immunol, 1998，160:2388-2392.
9，Porgador A，Irvine KR，Iwasaki A，et al. Predominant role for directly transfected dendritic cells in antigen presentation to CD8+ T cells after gene gun immunization. J Exp Med, 1998，188: 1075-1082.
收稿日期:1999-10-18, 百拇医药
单位：100021 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室
关键词：生物弹道学；基因疗法；肿瘤
中华医学杂志000715【摘要】目的 研究基因枪经小鼠皮肤转移基因的效率、被转基因的表达量、表达时间，以及对小鼠肿瘤的治疗效果，探讨作为一种新的基因转移工具，基因枪在基因治疗中应用的可能性。方法 (1)用荧光显微镜观察基因枪对体外培养细胞系的基因转导效率和被转基因表达时间；(2) 通过基因枪向小鼠皮肤转Lac-Z基因后，取转基因部位的皮肤做冰冻切片进行β-gal染色，观察转基因蛋白在皮肤中表达的部位；(3) 用ELISA法检测向小鼠皮肤转mGM-CSF基因后，血清中的转基因蛋白表达量，并取转基因部位的皮肤做病理切片，通过观察局部病理改变，推测转基因蛋白在局部的表达情况；(4) 用基因枪向小鼠腹部皮肤转mGM-CSF 10 d后，用肿瘤细胞攻击，观察肿瘤生长情况；(5) 在小鼠右腋下接种肿瘤细胞，1周后进行转基因或注射瘤苗治疗，观察肿瘤生长情况。结果 (1) 基因枪能有效地对体外培养的各种肿瘤细胞系转基因，转导基因的效率是16.5%±9.0%，被转基因可获得较长时间的瞬时表达；(2) 小鼠皮肤冰冻切片染色结果显示，基因枪可有效地将外源基因导入到皮肤表皮4～5层；(3) ELISA结果显示，经皮肤转基因后，血清中GM-CSF蛋白水平显著升高，最高可达对照组的12.5倍。小鼠皮肤病理切片可见到炎性浸润，提示局部有活性的转基因蛋白GM-CSF的表达；(4) 经基因枪转mGM-CSF后，小鼠抵御B16细胞攻击的能力明显增强，肿瘤生长速度显著下降，抑瘤率达43.7%，当基因枪转基因与瘤苗和佐剂联合免疫后，抗瘤效果更加显著，抑瘤率达73.5%；(5) 治疗实验中，每隔2天进行1次转基因治疗，连续治疗4次后，可起到一定的抗瘤效果。结论 基因枪能有效地将外源基因转到体外培养的细胞和经皮肤转导至动物皮下，并能得到较长时间的表达。基因枪是一种简单、安全、有效的转移基因工具，具有良好的应用前景。
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The use of gene gun in cancer gene therapy
ZHA Yuanyuan LIN Chen LIANG Xiao et al.
(National Lab of Molecule Oncology, Cancer Institute, PUMC & CAMS, Beijing, 100021 China)
【Abstract】Objective With Helios gene gun ，the report genes EGFP and Lac-Z were transfected to several cultured mammalian tumor cell lines in vitro and mice skin in vivo, respectively. A stable long time exogene's expression were got. Then , the pWRG3142， which carried mGM-CSF gene was delivered to the abdominal skin of C57BL/6 mice using gene gun. Pathological sections showed the local transproteins' expression companying with a profound inflammation reaction characterized by neutrophilic infiltration . ELISA assay of transfected mouse's serum sample indicated a high improvement of transgenic proteins level ， which demonstrated that transgenic GM-CSF secreted from treated skin into the bloodstream effectively . In B16 melanoma tumor model ， mice immunized with mGM-CSF expression plasmids could be partially protected from 1×105 B16 cells challenge and exhibited a drastically reduced tumor growth rate . Finally， we conclucled that exogenes could be transfected into cultured cell lines and mice skin effectively by gene gun technology ， and gene gun mediated in vivo delivery of GM-CSF cDNA should be further developed for potential clinical testing as an approach for human cancer gene therapy.
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【Key words】Biolistics； Gene therapy； Cancer
基因治疗对于许多遗传性疾病，恶性肿瘤，传染性疾病的治疗具有巨大的应用潜力[1，2]。而基因治疗应用于临床治疗各种疾病所面临的一个首先需要解决的问题是如何建立一个安全、 高效的基因导入系统。现有的各种已通过药审的导入系统(如腺病毒，逆转录病毒，脂质体等)大多操作复杂，对靶组织(或靶细胞)要求较高，且体内应用效率较低。目前，国际上对一种新的基因转移技术，即基因枪技术介导的基因治疗的报道逐渐增多，用基因枪体外转导GM-CSF基因并经过照射处理的肿瘤细胞做瘤苗，治疗黑色素瘤和肉瘤，已被FDA批准进行Ⅰ、Ⅱ期临床试验。本室于1997年引进了国内第一台Helios基因枪设备，近2年的研究表明，基因枪使用起来方便，安全，具有很好的临床应用前景。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药
1.细胞系与实验动物: 人肺腺癌细胞系GLC-82、人结肠癌细胞系HCT、人膀胱癌细胞系EJ、人肝癌细胞系QSG-7701、小鼠黑色素瘤细胞系B16，均为本室保存，用199培养液(B16用1640培养液)，5% CO2孵箱培养。C57BL/6小鼠(18～22 g)由本所动物室提供。
2.质粒: pAdE1CMV-LacZ (携带报告基因LacZ)，本室构建。pEGFP C1 (携带绿色荧光蛋白的突变体报告基因EGFP)，刘芝华博士提供。 pWRG3142 (携带小鼠GM-CSF基因)、pWRG3224、(空载体)，均由杨宁逊博士惠赠。
3.Helios基因枪，购自Bio-rad公司；ELISA试剂盒，购自Endogen公司；荧光显微镜(OPTON)。
二、方法
1.制作子弹：用亚精胺—氯化钙包裹法将质粒DNA包裹在直径为1.0 μm的金粒上。将金颗粒-质粒DNA乙醇溶液吸入Tefzel管中，使金颗粒沉淀在管的内表面上，吸去乙醇，用氮气将管吹干，将管切成17.7 mm的小段即制成子弹。每个子弹携带有0.5 mg金，1.25 μg DNA。
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2.基因枪向体外培养的肿瘤细胞系转EGFP基因实验：用1 033.5 kPa轰击培养的5种细胞系，转导pEGFP C1后，将细胞系置入37℃，CO2孵箱培养。在不同时间点，取转导基因的细胞系在荧光显微镜下观察，计数发绿色荧光的细胞，调荧光光源到普通光光源，计数同一视野中的细胞，根据2次计数之比，计算转导效率。
3.小鼠经皮肤转LacZ基因实验:取18～20 g的C57BL/6小鼠，除去腹部皮肤上的毛，用Helios基因枪以不同的压力进行轰击，转pAdE1CMV-LacZ。3 d后，断颈法处死动物，取下轰击部位的皮肤，置于生理盐水中，立即送本所中心仪器室做冰冻切片，HE染色，然后进行β-gal 复染，显微镜下观察、照相。
4.小鼠经皮肤转GM-CSF基因实验： 用Helios基因枪以350 g向C57BL/6小鼠腹部分别转pWRG3142和pWRG3224，于转基因后6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d眼眶取血，用ELISA法检测血清中的GM-CSF蛋白水平。同时，取转基因部位的皮肤，10%甲醛固定，送本所中心仪器室做病理切片，显微镜下观察局部皮肤的炎性反应，照相。
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5.小鼠肿瘤预防实验： 将25只C57BL/6小鼠，分成5组，第1、2组于第1天用基因枪经皮肤转pWRG3224， 第3、4、5组转pWRG3142，第2、4组于第2天注射作为瘤苗的经5次反复冻融后的B16细胞的上清，第5组于第2天注射瘤苗的同时，加注25 mg/kg的当归多糖(由中国医学科学院医学生物技术研究所柳钟勋教授提供)作为佐剂，第8天向全部动物右腋下注射1×105个B16细胞，1个月后，断颈法处死动物，剥离肿瘤，称重，照相。
6.小鼠肿瘤治疗实验：取20只C57BL/6小鼠，第1天右腋下注射1×105个B16细胞，待肿瘤长到约2 mm左右，分成4组，第1组为对照组，第2组用基因枪1次轰击4枪，转pWRG3142，1枪位于肿瘤的正上方，3枪位于肿瘤周围。第3组注射瘤苗加注25 mg/kg的当归多糖佐剂，每周1次，连续2次。第4组用基因枪1次轰击1枪，转pWRG3142，隔天1次，共4次。3周后，断颈法处死动物，剥离肿瘤，称重，照相。
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7.统计学处理：差异性显著检验采用t检验。
结果
1.在选定的条件下, 所用的4种人癌细胞系均能成功地被转入并表达EGFP基因。基因枪轰击3 h后,就可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光, 以后每天观察,可见荧光细胞变多，荧光变亮，随后又逐渐减弱，但是直到第12 d,仍能看到微弱的荧光。用方法2中描述的方法计算出的平均转基因效率为16.5%±9.0%，最低为5.3%，最高为33.3%。
2.小鼠皮肤冰冻切片β-gal 染色显示，外源基因可被导入到表皮的第4到5层细胞并表达(图1)。
3.小鼠血清ELISA检测结果：经皮肤转pWRG3142后6 h，小鼠血清中GM-CSF蛋白水平可达260 pg/ml, 为对照(转空载体pWRG3224小鼠)的12.5倍，24 h后为对照的6.5倍，以后5 d中，血清中转基因蛋白水平维持在对照组的2～3倍，提示GM-CSF表达后可由转基因部位进入到血清中。小鼠皮肤病理切片可见到以中性粒细胞和淋巴细胞为主的炎性浸润，提示局部有活性的转基因蛋白的表达，其中在第3天，炎症反应最严重。转空载体的小鼠皮肤病理切片可见到轻微的炎性浸润，提示单纯的基因枪轰击可引起一定的炎症反应(图2)。
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图1 小鼠皮肤转Lac-Z基因冰冻切片，β-gal复染结果 HE×100
图2 小鼠皮肤转GM-CSF基因病理切片 HE×100
4.小鼠肿瘤预防实验结果(表1):经基因枪转pWRG3142后，小鼠抵御B16细胞攻击的能力显著增强，肿瘤生长速度显著下降，抑瘤率达43.7%。当基因枪转基因与瘤苗和佐剂联合免疫后，抗瘤效果更加显著，抑瘤率达73.5%。
表1 小鼠肿瘤预防实验结果(
±s) 组别鼠数(只)
肿瘤质量(g)
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抑瘤率(%)
P值
PB-3224
5
2.64±0.46
0
-
PB-3224+V
5
1.31±0.48
50.5
<0.002
PB-3142
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5
1.48±0.88
43.7
<0.03
PB-3142+V
5
0.84±0.48
68.3
<0.001
PB-3142+V+A
5
0.70±0.27
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<0.001
注：V为瘤苗，A为当归多糖佐剂 5.小鼠肿瘤治疗实验结果：在治疗实验中，第4组动物经每隔2 d进行1次转基因治疗，连续治疗4次后，肿瘤生长速度缓慢，抑瘤率达52.0%；第3组即经注射瘤苗加佐剂进行治疗后，肿瘤生长也受到了抑制，抑瘤率为49.7%；而第2组并未取得治疗效果，与对照第1组相比，肿瘤生长几乎没有变化。
讨论
基因枪技术是一种物理的转基因技术，早期多用于在植物中转移基因。它通过提供给包裹有DNA的金颗粒很高的初速度，使其穿透植物的细胞壁，而达到质粒DNA有效的细胞内转移的目的[3-5]。随后，这项技术被用于哺乳动物实验系统[6]。本实验所用的基因枪是依靠氦气提供给金颗粒很高的初速度，使其穿透靶细胞表面，将目的基因带入细胞内，理论上可以对任何细胞进行基因转移。
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实验表明，基因枪对体外培养的哺乳动物细胞的转移效率在5.3%～33.3%之间， 与文献报道[7]的20%～30%相比，差别不大。转移效率的差别可能与子弹制备时金颗粒分布不均匀有关，通过控制子弹的制作，有望提高转移效率。
在直接对皮肤转基因实验中，染色结果显示，基因枪只能将基因转到表皮层。大多数被转入基因的细胞为角质化细胞，这些细胞可以表达外源基因，对机体免疫反应的发生起到一定的作用。表皮中的一些树突状细胞也可能被转入外源基因，这些细胞可以移动到附近的区域淋巴结内行使其抗原呈递功能，激活T细胞，引起机体免疫反应[8，9]。对皮肤转GM-CSF基因后，转基因部位皮肤的病理切片观察到以中性粒细胞和淋巴细胞浸润为特征的复杂的急性炎症反应，证明产生的转基因蛋白是具有生物活性的，血清ELISA分析表明，转基因蛋白由局部转移到全身。
在肿瘤预防实验中，用基因枪转GM-CSF基因免疫后的小鼠，抵御B16细胞攻击的能力明显增强，这种能力在基因免疫与传统的瘤苗加佐剂免疫联合后得到进一步的提高。这可能是基因免疫后，转基因蛋白的表达使动物局部和全身的免疫细胞重新分布和激活，免疫应答水平提高，动物抗肿瘤能力增强。在治疗实验中，不同方式的基因治疗所起的疗效也有很大的差别。1次轰击4枪，并没有起到治疗肿瘤的效果，而1次轰击1枪，隔天1次，连续4次的治疗方式则起到了一定的效果，抑瘤率达到了52.0%，但统计学差异无显著意义，今后通过治疗方式的改进，有可能取得显著的治疗效果。
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基因枪具有安全、操作简单、有效等优点，但是还有一些不足之处。在体外实验中，对培养细胞系的转基因效率不如病毒载体；对于体表(如皮肤)，基因枪介导的基因转移有很大优势，但对于内脏器官，转移基因不易操作，可以考虑发展内镜式基因枪来解决；在直接向动物皮肤转基因时，会造成一定的冲击伤；是否会造成表浅肿瘤转移，有待进一步验证。
基金项目：国家“八六三”高科技计划资助项目(z20-01-02)
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收稿日期:1999-10-18, 百拇医药