应用mRNA差异显示技术筛选卵巢癌耐药相关基因
作者：程国钧 田方 李亚里 李春海 王宏 祝华 杨秀玉
单位：程国钧(100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)；李亚里(100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)；祝华(100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)；田方(中国人民解放军军事医学科学院)；李春海(中国人民解放军军事医学科学院)；王宏(中国人民解放军军事医学科学院)；杨秀玉(北京协和医院妇产科)
关键词：卵巢肿瘤；抗药性；基因
中华医学杂志000720【摘要】目的 筛选卵巢癌泰素耐药相关基因。方法 采用间歇诱导法建立了卵巢癌泰素耐药细胞株Skov3/Taxol-25;采用mRNA DD比较Skov3/Taxol-25和敏感细胞Skov3的mRNA表达差异，筛选卵巢癌泰素耐药相关基因。结果 Skov3/Taxol-25对泰素耐药增加44倍，同时对顺铂也产生了耐药。比较Skov3和Skov3/Taxol-25的mRNA，获得22个差异条带。对其中5个差异条带进行了DNA序列测定，有3个与已知的基因高度同源，分别为tPA、Kiaa0372和LDLC。2个为未知新基因片段，Genbank登录号分别为AF120327和AF120328。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示，tPA和Kiaa0372为Skov3/Taxol-25特异表达基因，而LDLC为假阳性。结论 卵巢癌对泰素耐药后有多个基因表达差异。耐药细胞株的tPA表达增强提示发生耐药后肿瘤的转移能力增强。
, 百拇医药
The selection of taxol resistance associated genes in ovarian cancer cell line by mRNA DD
CHENG Guojun TIAN Fang LI Yali et al.
(Department of Obstetrics & Gynecology, Chinese PLA General Hospital, Beijing, 100853, China)
【Abstract】Objective One of the main reasons of the treatment failure for ovarian cancer is the emergence of drug resistance in which several genes involved. The purpose of the study was to select the genes related to Taxol resistance in ovarian cancer. Methods Resistant ovarian cancer cell line, Skov3/Taxol-25, was established by interval exposure Skov3 to Taxol. mRNA was compared between Skov3 and Skov3/Taxol-25 by mRNA DD. Results Skov3/Taxol-25 showed 44 times increase resisance to Taxol after 12 months of induction. There were 22 new differential bands obtained from Skov3/Taxol-25 as compared with Skov3. 18 bands were special by repeated PCR. In the 5 sub-clones, three clones were homologous to the known gene. 105/106 base pair of clone 1 were homologous to tPA (tissue plasminogen activator), 261/268 of clone 3 to Kiaa 0372, and 406/409 of clone 18 to LDLC. The other 2 ESTs were new gene segments, which were banked to Genbank with the number of AF120327 and AF120328. The identification by RT-PCR revealed that both tPA and Kiaa0372 were special genes from Skov3/Taxol-25, while LDLC was pseudopositive. Conclusion Several genes were involved in the resistance to Taxol in ovarian cancer. The enhanced expression of tPA indicated the increased ability of metastasis after the acquisition of resistance to taxol.
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【Key words】Ovarian neoplasms；Drug resistance；Genes
化疗耐药是卵巢癌治疗失败的主要原因之一，与多个耐药相关基因的表达有关。但有些耐药现象并不能用已知的耐药基因的表达来解释，需要筛选新的耐药相关基因[1]。mRNA差异显示(mRNA DD) 是基于PCR比较mRNA差异表达的技术，被广泛用于筛选表型相关基因[2]。本研究采用mRNA DD比较了卵巢癌泰素耐药细胞株SKOV3/Taxol-25和敏感株Skov3的基因表达差异。
材料和方法
一、耐药细胞株的建立[3]
卵巢癌上皮细胞系Skov3为本室保存。Skov3在指数生长期时，在培养基中加入泰素(美国施贵宝产品)，24～48 h后换不含药物的10%小牛血清1640培养基继续培养。大部分细胞死亡，存活细胞缓慢生长，1～3周后再进入指数生长期，重复泰素诱导，共30次，剂量从10、15 nmol/L增至25 nmol/L，历时12个月。MTT法测定耐药指数(RI)。耐药细胞株命名为Skov3/Taxol-25。
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二、mRNA DD筛选耐药基因[2，4]
1.细胞总RNA的提取及鉴定：用TRIzol RNA纯化试剂盒(美国GIBCO产品)提取指数生长期细胞Skov3/Taxol-25和Skov3的总RNA。 分析鉴定样品纯度和浓度，DNA酶消化。
2.mRNA差异显示：以Archered primer-H-T11M(M分别为A，G，C的一种)为引物，反转录合成Skov3/Taxol-25和Skov3 cDNA第一链，然后以3条Archered primer与随机引物作不同组合进行PCR反应,反应条件：94℃ 30 s，40℃ 2 min，72℃ 1 min，40个循环，72℃延伸7 min。取相同引物下两个细胞株的PCR产物配对上样，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳3～4 h。银染法显示PCR产物[5]。从凝胶上切下差异条带， 进行PCR再扩增，扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接，转化JM109感受态细胞，通过酶切鉴定和PCR筛选重组克隆。
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3.差异片段的序列分析：采用ABI 373A全自动DNA序列分析仪，测定重组质粒中差异片段的核苷酸序列。从BLAST及EST基因库中查询差异片段的同源序列。
三、差异片段的鉴定
根据同源性分析结果，应用PCGENE软件设计合成引物(上海生工公司合成)，采用RT-PCR鉴定差异基因在Skov3、Skov3/Taxol-25和其他耐药细胞中的表达。以621 bp的β-actin作内参。
结果
一、耐药细胞株的特性
Skov3在诱导过程中发生明显变化。 贴壁细胞呈不规则状，突起增多，胞浆出现空泡。 细胞生长迟缓，倍增时间延长。对泰素明显产生耐受。停止诱导后2个月，Skov3和Skov3/Taxol-25对泰素的IC50分别为0.12 nmol/L±0.22 nmol/L和5.15 nmol/L±0.48 nmol/L。 Skov3/Taxol-25对泰素的RI为44.0，对顺铂产生交叉耐药，RI为6.1，但对阿霉素和足叶乙甙没有交叉耐药(图1)。
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二、耐药相关基因的筛选
1.DD-PCR：分别用HT11M(M为G、C、A的一种)与8条随机引物配对进行PCR反应，每个样本行24个PCR。 银染显示条带如图2所示。每一对引物的PCR产物都有50～70个条带，Skov3和Skov3/Taxol-25的绝大多数条带的大小和染色深浅一致，说明两者表型相关，基因表达相似。仔细比较，发现两细胞间有22条不同的差异条带。
2.差异条带的再扩增和克隆：将切下的22条差异条带作为模板，用与其来源相同的引物进行PCR再扩增，其中18条得到大小与模板一致的特异性单一再扩增条带。对其中5条片段进行克隆，图3显示的是以重组质粒为模板的PCR鉴定结果。
3.cDNA片段的序列测定及同源性分析：对所克隆的5条差异片段进行了核苷酸序列分析。将DNA序列通过Internet在BLAST 数据库中查询并分析同源性。结果：1号片段99%(105/106)个碱基与组织型纤溶酶原激活物(t-PA)同源；3号片段97%(261/268)碱基与KIAA0372相同；18号片段99%(406/409)碱基与LDLC相同；14号和21号片段分别长558 bp和449 bp，为新的基因片段，已登录Genbank，登录号分别为AF120327和AF120328。
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图1 泰素对Skov3和Skov3/Taxol25的剂量效应曲线
图2 RT-PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显示
差异条带
图3 差异条带PCR再扩增
三、差异片段的鉴定
从Genbank中分别查到tPA、KIAA0372和LDLC的基因序列，设计3对引物，对Skov3和Skov3/Taxol-25和其他耐药细胞系作RT-PCR。结果敏感细胞Skov3不表达tPA和Kiaa0372，而耐药株Skov3/Taxol-25和我们同时以Skov3建立的其他耐药细胞系都有tPA 和Kiaa0372表达。而敏感细胞和耐药细胞株中均有LDLC的表达。见图4，5。
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M.Marker；N.阴性对照；1.Skov3；2.Skov3/Taxol-p；3.Skov3/Taxol-25；4.Skov3/CDDP-P；5.Skov3/CDDP50；6.Skov3/VP16；7.Skov3/Adr
图4 RT-PCR检测tPA在耐药细胞系和亲本细胞系的表达
M.Marker；P.阳性质粒对照；N.阴性对照；1.Skov3；2.Skov3/Taxol-p；3.Skov3/Taxol-25；4.Skov3/CDDP-P；5.Skov3/CDDP50；6.Skov3/VP16；7.Skov3/Adr
图5 RT-PCR检测Kiaa0372在耐药细胞系和亲本细胞系的表达
讨论
, 百拇医药
传统克隆耐药基因的方法是利用耐药细胞株制备单克隆抗体，但需耗费大量人力和物力。mRNA DD是一种分离表型相关基因的有效方法, 具有简便、灵敏、高效率和省时的优点，但假阳性高是其主要缺点[2]。1998年Husain等[6]采用mRNA DD研究卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3 CDDP/R，发现BRCA1基因的上调节与耐药有关。
本实验我们用泰素间歇诱导法建立了SKOV3/Taxol-25卵巢癌多药耐药细胞系，该细胞系不仅对泰素产生了耐药，而且对其它结构和作用机理不同的顺铂也产生了抵抗，耐药细胞的形态和细胞周期都发生了明显变化。这为我们用耐药细胞系Skov3/Taxol-25 和亲本细胞系Skov3作为差异筛选对象奠定了基础。应用建立的耐药细胞株Skov3/Taxol-25和亲本细胞株Skov3作DD-PCR ，发现22个差异表达条带。对其中5个进行了克隆和测序鉴定， 3个序列分别与已知的基因tPA、Kiaa0372和LDLC高度同源。2个序列为未知片段已登录Genbank。表明耐药细胞的生物学与基因水平的变化密切相关。
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mRNA DD的主要缺点是假阳性高[5]，所以鉴定工作非常重要。通常从测序胶中分离的差异条带都要经过Northern杂交来确定其真实性，但很难检测出丰度低的mRNA分子。我们用敏感的RT-PCR方法代替Northern 杂交。 结果发现，tPA 和Kiaa 0372在Skov3中无表达，在Skov3/Taxol-25中均有高表达， 而LDLC在Skov3及耐药株中都有表达，表达程度接近。提示tPA和Kiaa0372是Skov3产生耐药后表达的特异基因，而LDLC的差异片段是假阳性结果。tPA是一种特异性的丝氨酸蛋白水解酶，除了可以溶解凝血块，也参与肿瘤的侵袭转移[7]。本研究中我们发现卵巢癌细胞株Skov3在获得耐药后tPA的表达增强，提示其降解细胞外基质的能力增强，更易发生转移。这可能是肿瘤获得耐药后预后较差的另一个原因。另一个已知基因Kiaa0372是从脑组织克隆得到的新基因，长5 704 bp，编码1 565个氨基酸残基组成的蛋白，但功能尚不明确。
参考文献
, 百拇医药
1，Coukos G, Rubin SC. Chemotherapy resistance in ovarian cancer: new molecular perspectives, Obstet Gynecol, 1998,91:783-792.
2，Liang P, Pardee B. Differential display of eukarytic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992,257: 967-971.
3，Parekh , Wiesen K, Simpkins H. Acquisition of Taxol resistance via P-glycoprotein and non-p-glycoprotein-mediated mechanism in human ovarian carcinoma cells. Biochem Pharmacol, 1997,53:461-470.
, 百拇医药
4，Dieffendach CW, Dveksler GS. PCR技术实验指南.黄培堂，俞炜源，陈添弥，等，译.北京：科学出版社，1998.295-310.
5，Bassam B, Caetano G, Gresshof P, et al. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1991,196:80-83.
6，Husain A, He GS, Venkatraman ES, et al. BRCA1 up-regulation is associated with repair-mediated resistance to cis-diamminedichloplatinum(II). Cancer Res, 1998,58:1120-1123.
7，Sheng S, Truong B, Fredrickson D，et al. Tissue-type plasminogen activator is a target of the tumor suppressor gene maspin. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95:499-504.
收稿日期：1999-07-07, 百拇医药
单位：程国钧(100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)；李亚里(100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)；祝华(100853 北京，中国人民解放军总医院妇产科)；田方(中国人民解放军军事医学科学院)；李春海(中国人民解放军军事医学科学院)；王宏(中国人民解放军军事医学科学院)；杨秀玉(北京协和医院妇产科)
关键词：卵巢肿瘤；抗药性；基因
中华医学杂志000720【摘要】目的 筛选卵巢癌泰素耐药相关基因。方法 采用间歇诱导法建立了卵巢癌泰素耐药细胞株Skov3/Taxol-25;采用mRNA DD比较Skov3/Taxol-25和敏感细胞Skov3的mRNA表达差异，筛选卵巢癌泰素耐药相关基因。结果 Skov3/Taxol-25对泰素耐药增加44倍，同时对顺铂也产生了耐药。比较Skov3和Skov3/Taxol-25的mRNA，获得22个差异条带。对其中5个差异条带进行了DNA序列测定，有3个与已知的基因高度同源，分别为tPA、Kiaa0372和LDLC。2个为未知新基因片段，Genbank登录号分别为AF120327和AF120328。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示，tPA和Kiaa0372为Skov3/Taxol-25特异表达基因，而LDLC为假阳性。结论 卵巢癌对泰素耐药后有多个基因表达差异。耐药细胞株的tPA表达增强提示发生耐药后肿瘤的转移能力增强。
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The selection of taxol resistance associated genes in ovarian cancer cell line by mRNA DD
CHENG Guojun TIAN Fang LI Yali et al.
(Department of Obstetrics & Gynecology, Chinese PLA General Hospital, Beijing, 100853, China)
【Abstract】Objective One of the main reasons of the treatment failure for ovarian cancer is the emergence of drug resistance in which several genes involved. The purpose of the study was to select the genes related to Taxol resistance in ovarian cancer. Methods Resistant ovarian cancer cell line, Skov3/Taxol-25, was established by interval exposure Skov3 to Taxol. mRNA was compared between Skov3 and Skov3/Taxol-25 by mRNA DD. Results Skov3/Taxol-25 showed 44 times increase resisance to Taxol after 12 months of induction. There were 22 new differential bands obtained from Skov3/Taxol-25 as compared with Skov3. 18 bands were special by repeated PCR. In the 5 sub-clones, three clones were homologous to the known gene. 105/106 base pair of clone 1 were homologous to tPA (tissue plasminogen activator), 261/268 of clone 3 to Kiaa 0372, and 406/409 of clone 18 to LDLC. The other 2 ESTs were new gene segments, which were banked to Genbank with the number of AF120327 and AF120328. The identification by RT-PCR revealed that both tPA and Kiaa0372 were special genes from Skov3/Taxol-25, while LDLC was pseudopositive. Conclusion Several genes were involved in the resistance to Taxol in ovarian cancer. The enhanced expression of tPA indicated the increased ability of metastasis after the acquisition of resistance to taxol.
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【Key words】Ovarian neoplasms；Drug resistance；Genes
化疗耐药是卵巢癌治疗失败的主要原因之一，与多个耐药相关基因的表达有关。但有些耐药现象并不能用已知的耐药基因的表达来解释，需要筛选新的耐药相关基因[1]。mRNA差异显示(mRNA DD) 是基于PCR比较mRNA差异表达的技术，被广泛用于筛选表型相关基因[2]。本研究采用mRNA DD比较了卵巢癌泰素耐药细胞株SKOV3/Taxol-25和敏感株Skov3的基因表达差异。
材料和方法
一、耐药细胞株的建立[3]
卵巢癌上皮细胞系Skov3为本室保存。Skov3在指数生长期时，在培养基中加入泰素(美国施贵宝产品)，24～48 h后换不含药物的10%小牛血清1640培养基继续培养。大部分细胞死亡，存活细胞缓慢生长，1～3周后再进入指数生长期，重复泰素诱导，共30次，剂量从10、15 nmol/L增至25 nmol/L，历时12个月。MTT法测定耐药指数(RI)。耐药细胞株命名为Skov3/Taxol-25。
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二、mRNA DD筛选耐药基因[2，4]
1.细胞总RNA的提取及鉴定：用TRIzol RNA纯化试剂盒(美国GIBCO产品)提取指数生长期细胞Skov3/Taxol-25和Skov3的总RNA。 分析鉴定样品纯度和浓度，DNA酶消化。
2.mRNA差异显示：以Archered primer-H-T11M(M分别为A，G，C的一种)为引物，反转录合成Skov3/Taxol-25和Skov3 cDNA第一链，然后以3条Archered primer与随机引物作不同组合进行PCR反应,反应条件：94℃ 30 s，40℃ 2 min，72℃ 1 min，40个循环，72℃延伸7 min。取相同引物下两个细胞株的PCR产物配对上样，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳3～4 h。银染法显示PCR产物[5]。从凝胶上切下差异条带， 进行PCR再扩增，扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接，转化JM109感受态细胞，通过酶切鉴定和PCR筛选重组克隆。
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3.差异片段的序列分析：采用ABI 373A全自动DNA序列分析仪，测定重组质粒中差异片段的核苷酸序列。从BLAST及EST基因库中查询差异片段的同源序列。
三、差异片段的鉴定
根据同源性分析结果，应用PCGENE软件设计合成引物(上海生工公司合成)，采用RT-PCR鉴定差异基因在Skov3、Skov3/Taxol-25和其他耐药细胞中的表达。以621 bp的β-actin作内参。
结果
一、耐药细胞株的特性
Skov3在诱导过程中发生明显变化。 贴壁细胞呈不规则状，突起增多，胞浆出现空泡。 细胞生长迟缓，倍增时间延长。对泰素明显产生耐受。停止诱导后2个月，Skov3和Skov3/Taxol-25对泰素的IC50分别为0.12 nmol/L±0.22 nmol/L和5.15 nmol/L±0.48 nmol/L。 Skov3/Taxol-25对泰素的RI为44.0，对顺铂产生交叉耐药，RI为6.1，但对阿霉素和足叶乙甙没有交叉耐药(图1)。
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二、耐药相关基因的筛选
1.DD-PCR：分别用HT11M(M为G、C、A的一种)与8条随机引物配对进行PCR反应，每个样本行24个PCR。 银染显示条带如图2所示。每一对引物的PCR产物都有50～70个条带，Skov3和Skov3/Taxol-25的绝大多数条带的大小和染色深浅一致，说明两者表型相关，基因表达相似。仔细比较，发现两细胞间有22条不同的差异条带。
2.差异条带的再扩增和克隆：将切下的22条差异条带作为模板，用与其来源相同的引物进行PCR再扩增，其中18条得到大小与模板一致的特异性单一再扩增条带。对其中5条片段进行克隆，图3显示的是以重组质粒为模板的PCR鉴定结果。
3.cDNA片段的序列测定及同源性分析：对所克隆的5条差异片段进行了核苷酸序列分析。将DNA序列通过Internet在BLAST 数据库中查询并分析同源性。结果：1号片段99%(105/106)个碱基与组织型纤溶酶原激活物(t-PA)同源；3号片段97%(261/268)碱基与KIAA0372相同；18号片段99%(406/409)碱基与LDLC相同；14号和21号片段分别长558 bp和449 bp，为新的基因片段，已登录Genbank，登录号分别为AF120327和AF120328。
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图1 泰素对Skov3和Skov3/Taxol25的剂量效应曲线
图2 RT-PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显示
差异条带
图3 差异条带PCR再扩增
三、差异片段的鉴定
从Genbank中分别查到tPA、KIAA0372和LDLC的基因序列，设计3对引物，对Skov3和Skov3/Taxol-25和其他耐药细胞系作RT-PCR。结果敏感细胞Skov3不表达tPA和Kiaa0372，而耐药株Skov3/Taxol-25和我们同时以Skov3建立的其他耐药细胞系都有tPA 和Kiaa0372表达。而敏感细胞和耐药细胞株中均有LDLC的表达。见图4，5。
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M.Marker；N.阴性对照；1.Skov3；2.Skov3/Taxol-p；3.Skov3/Taxol-25；4.Skov3/CDDP-P；5.Skov3/CDDP50；6.Skov3/VP16；7.Skov3/Adr
图4 RT-PCR检测tPA在耐药细胞系和亲本细胞系的表达
M.Marker；P.阳性质粒对照；N.阴性对照；1.Skov3；2.Skov3/Taxol-p；3.Skov3/Taxol-25；4.Skov3/CDDP-P；5.Skov3/CDDP50；6.Skov3/VP16；7.Skov3/Adr
图5 RT-PCR检测Kiaa0372在耐药细胞系和亲本细胞系的表达
讨论
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传统克隆耐药基因的方法是利用耐药细胞株制备单克隆抗体，但需耗费大量人力和物力。mRNA DD是一种分离表型相关基因的有效方法, 具有简便、灵敏、高效率和省时的优点，但假阳性高是其主要缺点[2]。1998年Husain等[6]采用mRNA DD研究卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3 CDDP/R，发现BRCA1基因的上调节与耐药有关。
本实验我们用泰素间歇诱导法建立了SKOV3/Taxol-25卵巢癌多药耐药细胞系，该细胞系不仅对泰素产生了耐药，而且对其它结构和作用机理不同的顺铂也产生了抵抗，耐药细胞的形态和细胞周期都发生了明显变化。这为我们用耐药细胞系Skov3/Taxol-25 和亲本细胞系Skov3作为差异筛选对象奠定了基础。应用建立的耐药细胞株Skov3/Taxol-25和亲本细胞株Skov3作DD-PCR ，发现22个差异表达条带。对其中5个进行了克隆和测序鉴定， 3个序列分别与已知的基因tPA、Kiaa0372和LDLC高度同源。2个序列为未知片段已登录Genbank。表明耐药细胞的生物学与基因水平的变化密切相关。
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mRNA DD的主要缺点是假阳性高[5]，所以鉴定工作非常重要。通常从测序胶中分离的差异条带都要经过Northern杂交来确定其真实性，但很难检测出丰度低的mRNA分子。我们用敏感的RT-PCR方法代替Northern 杂交。 结果发现，tPA 和Kiaa 0372在Skov3中无表达，在Skov3/Taxol-25中均有高表达， 而LDLC在Skov3及耐药株中都有表达，表达程度接近。提示tPA和Kiaa0372是Skov3产生耐药后表达的特异基因，而LDLC的差异片段是假阳性结果。tPA是一种特异性的丝氨酸蛋白水解酶，除了可以溶解凝血块，也参与肿瘤的侵袭转移[7]。本研究中我们发现卵巢癌细胞株Skov3在获得耐药后tPA的表达增强，提示其降解细胞外基质的能力增强，更易发生转移。这可能是肿瘤获得耐药后预后较差的另一个原因。另一个已知基因Kiaa0372是从脑组织克隆得到的新基因，长5 704 bp，编码1 565个氨基酸残基组成的蛋白，但功能尚不明确。
参考文献
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1，Coukos G, Rubin SC. Chemotherapy resistance in ovarian cancer: new molecular perspectives, Obstet Gynecol, 1998,91:783-792.
2，Liang P, Pardee B. Differential display of eukarytic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992,257: 967-971.
3，Parekh , Wiesen K, Simpkins H. Acquisition of Taxol resistance via P-glycoprotein and non-p-glycoprotein-mediated mechanism in human ovarian carcinoma cells. Biochem Pharmacol, 1997,53:461-470.
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4，Dieffendach CW, Dveksler GS. PCR技术实验指南.黄培堂，俞炜源，陈添弥，等，译.北京：科学出版社，1998.295-310.
5，Bassam B, Caetano G, Gresshof P, et al. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1991,196:80-83.
6，Husain A, He GS, Venkatraman ES, et al. BRCA1 up-regulation is associated with repair-mediated resistance to cis-diamminedichloplatinum(II). Cancer Res, 1998,58:1120-1123.
7，Sheng S, Truong B, Fredrickson D，et al. Tissue-type plasminogen activator is a target of the tumor suppressor gene maspin. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95:499-504.
收稿日期：1999-07-07, 百拇医药