抗人血管内皮生长因子单链抗体的构建和表达及其活性鉴定
作者：王大章 杨西川 袁清安 俞炜源 郑光勇 房思炼
单位：王大章(610041 成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室 卫生部口腔生物医学工程重点实验室)；杨西川(610041 成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室 卫生部口腔生物医学工程重点实验室)；郑光勇(610041 成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室 卫生部口腔生物医学工程重点实验室)；房思炼(610041 成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室 卫生部口腔生物医学工程重点实验室)；袁清安(军事医学科学院生物工程所)；俞炜源(军事医学科学院生物工程所)
关键词：内皮生长因子；基因表达
中华医学杂志000716【摘要】目的 对能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合，并对体内有抑瘤活性的单克隆抗体(E11)进行基因工程改造，构建小分子的单链抗体(ScFv)，为临床应用奠定基础。方法 通过逆转录及多聚酶链式反应，扩增并克隆E11的可变区基因片段。用一编码亲水性多肽接头的DNA片段将E11轻、重链可变区基因连接，构建表达载体PET-15YV，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物经变性及复性后，用免疫组化方法检测其活性。结果 经测序表明，VL基因全长333 bp，编码111个氨基酸，归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。VH基因全长369 bp，编码123个氨基酸，归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。对颊癌组织进行检测的结果表明，基因工程抗体ScFv与原代抗体一样，具有较高的组织特异性。结论 抗人血管内皮生长因子单链抗体可作为生物导向药物，为肿瘤放射免疫显象及以血管为靶目标的抗血管生成治疗奠定了良好基础。
, 百拇医药
Construction and expression of single-chain Fv antibody against human VEGF
WANG Dazhang YANG Xichuan YUAN Qing′an et al.
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Stomatology, West China University of Medical Sciences, Chengdu, 610041, China)
【Abstract】Objective Binding specificity of a monoclonal antibody (MAb) (γ.k 2b) E11 which can react with the peptide of human VEGF was determined by ELISA and immunohistochemistry. The E11 primarily proved to be potential activity of suppressing tumor growth in vivo. The construction and expression of engineering antibody (ScFv) could widen application of this MAb in both diagnosis and treatment of human cancer. Methods From the hybridoma cell line secreting MAb against VEGF, total RNA was prepared and used as a template for cDNA synthesis and cloning. Reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to clone the immunoglobulin variable region gene (VH, VL). The cloned VH and VL were linked by well documented flexible peptide bridging sequence (GGGGS)3 in the VH-linker-VL orientation. The constructed ScFv gene was inserted into pET-15b and expressed in E.coli BL21(DE3). Biding activity of ScFv was evaluated by ELISA and immunohistochemical methods after its denature and renature treatment.Results The sequence analysis revealed that the full length of VH was 369 bp, and VL was 333 bp. According to Kabat classification, VH and VL are the member of mouse Ig variable gene heavy chain subgroup Ⅱ(A) and light chain subgroup Ⅲ, respectively. The ScFv was highly expressed in the form of inclusion bodies which activity was recovered after being renatured. Immunohistochemical results showed that ScFv retained almost the same antigen affinity and specificity as its parent monoclonal antibody.Conclusions Recombinant antibody ScFv is potential in both diagnostic and therapeutic application of human malignant tumors.
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【Key words】Endothelial growth factor； Gene expression
血管内皮生长因子(VEGF)被认为是体内蛋白诱导血管再生最关键的调节因子[1]。常见的恶性实体肿瘤均有VEGF的过量表达[2]。已有研究表明，抑制VEGF的活性能显著抑制肿瘤的生长[3]。1993年Kim首次报道抗VEGF单克隆抗体(单抗)抑制荷瘤鼠的肿瘤生长[4]，随后又发现其抑制转移瘤的发生[5]。但由于鼠源单抗在人体内易诱发人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应，使其临床应用严重受限。基因工程技术对抗体的改造(即抗体基因重组)可降低其免疫源性，抗体工程也因此成为国内外研究热点。单链抗体(ScFv)以其分子量小，穿透力强，免疫源性低，易于大量生产等优点，得到了较为广泛的应用。作者此前的报道已述及抗人VEGF单克隆抗体杂交瘤细胞株，其单克隆抗体已用于临床检测VEGF表达，取得了满意效果[6]。并初步证实该单克隆抗体具有体内抑瘤活性。本研究旨在克隆抗体可变区基因，构建ScFv，为有效的过渡到临床应用打下基础。本文报道ScFv的构建及其表达结果。
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表1 PCR扩增的引物序列 引物
引物序列
内切酶
P1
5，GGGAATTCATG(AG)AG(AT)C(CT)CAGGTCTTTT-3,P2
5,-CCCAAGCTTTTACTGGGGATGGTGGGGAAGATGGA-3,P3
5,-GGGGAATTCATGGAGGTG(GA)AGCT(GT)GGAAGTC-3,P4
JH1:5,-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3,JH2:5,-TGAGGAGACTGTGAGTGGTGCC-3,JH3:5,-TGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3,JH4:5,TGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-3,P5
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5,GGAATTCCATATGGCCATGGAATTCATGGAGGTGCAGGTT-3.
NdeI,NcoI,EcoRI
P6
5,-CGGGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCACCTGAACCGCCTCCAC
CTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3,BamHI
P7
5,CGGGATCCGACATTGTGCTGACACAGTTTCCT-3,BamHI
P8
5,-CCGCTCGAGTCAGTCGACTTAGCGGCCGCTTTGAT-3,XhoI ,SacI,NotI
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材料与方法
1.E11可变区基因(VH，HL)的克隆及序列测定：从生长良好，能持续分泌抗VEGF单抗的杂交瘤细胞株(E11)中[7]，按文献[8]提取细胞总RNA。参照Kabat库，设计2条引物用于VL的扩增(5′端互补于引导序列，3′端引物互补于轻链恒定区)，5条用于VH扩增(针对重链FR1区1条，JH区4条)，序列见表1。以RNA为模板，在AMV逆转录酶催化下合成cDNA。以cDNA为模板，在30 ml反应体系中，分别以加入轻链可变区引物，在基因Amp PCR体系上进行扩增，参数设为：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循环。PCR产物用1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。将回收的PCR产物纯化(QIAGEN, gel extraction kit)后，克隆在末端T突出的pEGMR-T Vector中，转化感受态细菌MC1601，挑选阳性克隆，抽提质粒DNA，T7及SP6通用引物双向测序。
, http://www.100md.com 2.单链抗体基因的构建：根据轻、重链可变区的酶切图谱及构建载体pET-15S(军事医学科学院生物工程所保存，含有Etag)的酶切位点，设计PCR引物(表1)中P5-P8。VH以P5、P6为引物，P6含连接肽序列。VL以P7-P8为引物，分别用已克隆的VH及VL为模板进行PCR扩增。扩增产物经电泳纯化回收。纯化的VH及VL分别酶切、再纯化后连接，最后用P5、P8行PCR扩增，即得到ScFv全基因序列。
3.单链抗体基因的表达：将ScFv及载体pET-15S分别用同一对酶(NcoⅠ, NotⅠ)进行酶切，连接后转化DH5α，菌液PCR挑选阳性克隆，抽提质粒行酶切分析。将经筛选的质粒命名为pET15-YV，将pET15-YV转化BL21(DE3)。挑选阳性克隆。表达菌株的诱导培养、SDS-PAGE、超声破菌、分别取上清及沉淀，确定表达产物的形式。
4.单链抗体包涵体的变性与复性：(1)用1 ml变性液(0.1 mol/L Tris. HCl, pH8.0; 6 mol/L盐酸胍；2 mmol/L EDTA；0.5% β-羟基乙醇)溶解包涵体，室温放置2 h；30 000 r/min离心15 min，取上清，测定样品的蛋白含量。用复性液将其浓度调整为10 mg/ml。(2)取上述上清1 ml，快速加入到100 ml的复性液(0.1 mol/L Tris. HCl, pH8.0; 0.5 mol/L L-精氨酸；50 μmol/L CuSO4；2 mmol/L EDTA)10℃至少保温24 h，以使抗人VEGF ScFv达到充分复位的目的。
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5.单链抗体的序列测定：将获正确表达带的菌种，抽提质粒pET15-YV，将其中的ScFv序列用一对酶切(EcoRI, XhoI)下，PUC19用EcoRI及SalI酶切，因XhoI与SalI酶切的粘性末端互补，因此，即可将ScFv克隆入PUC19中，进行全自动双向测序。
6.单链抗体的活性鉴定：单链抗体的免疫组化：颊癌组织标本由本院病理科提供，分化程度较好(高、中分化)16例，分化程度差(低分化)4例，共20例。染色后约5 μm的石蜡切片，脱蜡后先经0.3%H2O2甲醇溶液浸泡30 min，然后滴加正常羊血清，37℃下10 min，一抗先后为ScFv复性原液及鼠抗E标记抗体，二抗为兔抗鼠-HRP，室温反应1 h后洗涤，以含有DAB及H2O2的底物液显色，显微镜下棕色着染为阳性，深棕色为强阳性。并以商品化的抗人VEGF单抗为实验对照。
结果
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1.E11可变区基因(VH，HL)的克隆及序列测定：
经RT-PCR，VL及VH均得已扩增，扩增VH的3′端引物为JH4，琼脂糖凝胶电泳显示两者的区带位分别在430 bp及370 bp左右，与预计大小相符。序列测定结果，VL基因全长333 bp，编码111个氨基酸，归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。VH基因全长369 bp，编码123个氨基酸，归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组(图1)。
注：A：VH；B：Marker，由下至上依次为657，(458，434)，328，289，267 bp；C：VL
图1 VH，HL PCR扩增产物
凝胶电泳
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图2 重组质粒pET-15YV
酶切鉴定
2.单链抗体基因的构建：根据轻、重链可变区基因序列设计引物P5-P8，分别对VL及VH进行扩增，其中重链可变区和连接肽(Linker)(GGGGS)3基因相连。因VH的3′端及VL的5′端均引入了BamHI位点，经T4连接酶连接，用P5，P8行PCR扩增，即得到完整的ScFv全基因序列。电泳结果为760 bp的条带。将ScFv基因克隆入表达载体pET-15S中，转化之后挑选阳性克隆，抽提质粒酶切鉴定(图2)。结果表明，VH-linker-VL已连接并定向克隆在pET-15S中，命名为pET-15YV。
3.单链抗体基因的序列测定：DNA自动测序证明，获得表达的pET-15YV中ScFv基因序列阅读框架正确。
4.单链抗体基因的表达：BL21(DE3)感受态经含单链抗体基因的pET-15YV转化，在0.2 mmol/L IPTG终浓度的诱导下，主要以包含体的形式获得大
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注：A：低分子量蛋白标准；B：PET-15YV全菌；C：PET-15YV上清；D：PET-15YV包涵体
图3 PET-15YV的表达
及纯化
量表达。包含体占总蛋白的40%。SDS-PAGE显示在接近相对分子质量30 000处有一强表达带(图3)。
5.单链抗体的活性鉴定：ScFv对颊癌组织的特异性反应与原亲本抗体相同。除4例高分化标本未见阳性反应外，余16例均为阳性反应，其中4例低分化标本呈强阳性(图4)。本结果与商品化抗人VEGF单抗在紧邻病理切片上的反应结果一致。
讨论
克隆VL基因的引物多为针对骨架区FR1及FR4的通用引物，但通用引物获得的可变区基因两端若干碱基可能与原始序列有差异，因而两端的氨基酸可能有变异。可变区氨基端，尤其是轻链氨基端的氨基酸与CDR(Complementary determining regions)表面很接近，可能对抗原抗体的结合产生影响。因此，为了获得VL两端正确的序列，本研究采用针对信号肽及恒定区的引物，这样就避免了VL的变异，保证了VL序列的正确性。Linker的设计对功能区构型的维持起着重要的作用，一般认为Linker的长度以14～25个残基为宜。最常用的Linker序列(GGGGS)3是据X线晶体衍射分析抗体结构可变区及计算机辅助分析结果设计的具柔性结构的15肽序列(GLY4-Ser)3，Linker中尽量避免使用疏水残基，因其可能形成疏水表面，包埋在抗体分子中，从而改变抗体分子的三维结构。
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图4 低分化颊癌组织VEGF免疫组化染色
箭头为癌巢(深棕色) ×200
血管内皮生长因子选择性作用于血管内皮细胞膜上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体KDR/flk-1和flt-1，使酪氨酸激酶受体自身磷酸化，激发细胞内信号传导通路，产生生物效应-主要包括血管通透性增加，内皮细胞表达整合素及蛋白酶激活因子，最终导致血浆蛋白外渗，基底膜溶解，成纤维细胞及内皮细胞游走，新生血管形成。迄今为止，对抗VEGF的策略可归为6种：(1)抗体直接阻断VEGF活性；(2)阻断VEGF受体；(3)用可溶性VEGF受体片断中和VEGF；(4)将VEGF与毒素融合；(5)VEGF反义核酸；(6)其他间接阻断方法。以上各途径均取得较好效果，有的项目已获通过进入临床试验。
本研究结果不仅显示了抗人VEGF ScFv抗肿瘤治疗的潜能，若标记同位素，还可用于肿瘤区放射免疫显象，检查原发及转移病灶(ScFv分子小，未结合的抗体易被清除，显影时本底低，图像清晰)。此外，将ScFv与毒素等构建融合蛋白，或标记放射性核素，或与化疗药物结合，即可作为导向药物。这种既是血管生成抑制剂，又是魔弹的“双功能”药物，很可能是治疗恶性肿瘤有效的新途径。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570768)
参考文献
1，Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev, 1997, 18:4-25.
2，Brown LF, Berse B, Jackman RW, et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in breast cancer. Hum Pathol, 1995, 26:86-91.
3，Borgstrom P Hillan KJ, Sriramarao P, et al. Complete inhibition of angiogenesis and growth of microtumors by anti-vascular endothelial growth factor neutralizing antibody: novel concepts of angiostatic therapy from intravital videomicroscopy. Cancer Res, 1996, 56:4032-4039.
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4，Kim KJ, Li B, Winer J, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo. Nature, 1993,362:841-844.
5，Melnyk O, Shuman J, Kim KJ, et al. Vascular endothelial growth factor promotes tumor dissemination by a mechanism distinct from its effect on primary tumor growth. Cancer Res, 1996,56:921-924.
6，王大章，杨西川，何志秀，等.血管内皮生长因子在颊癌中的表达和分布.中华医学杂志，1998，78：845.
7，杨西川，王大章，李虹.抗人血管内皮生长因子合成肽杂交瘤细胞株的建立，细胞与分子免疫学杂志，1998，14：208,224.
8，Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol, 1990,28:495.
收稿日期：1999-07-19, http://www.100md.com
单位：王大章(610041 成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室 卫生部口腔生物医学工程重点实验室)；杨西川(610041 成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室 卫生部口腔生物医学工程重点实验室)；郑光勇(610041 成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室 卫生部口腔生物医学工程重点实验室)；房思炼(610041 成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室 卫生部口腔生物医学工程重点实验室)；袁清安(军事医学科学院生物工程所)；俞炜源(军事医学科学院生物工程所)
关键词：内皮生长因子；基因表达
中华医学杂志000716【摘要】目的 对能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合，并对体内有抑瘤活性的单克隆抗体(E11)进行基因工程改造，构建小分子的单链抗体(ScFv)，为临床应用奠定基础。方法 通过逆转录及多聚酶链式反应，扩增并克隆E11的可变区基因片段。用一编码亲水性多肽接头的DNA片段将E11轻、重链可变区基因连接，构建表达载体PET-15YV，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物经变性及复性后，用免疫组化方法检测其活性。结果 经测序表明，VL基因全长333 bp，编码111个氨基酸，归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。VH基因全长369 bp，编码123个氨基酸，归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。对颊癌组织进行检测的结果表明，基因工程抗体ScFv与原代抗体一样，具有较高的组织特异性。结论 抗人血管内皮生长因子单链抗体可作为生物导向药物，为肿瘤放射免疫显象及以血管为靶目标的抗血管生成治疗奠定了良好基础。
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Construction and expression of single-chain Fv antibody against human VEGF
WANG Dazhang YANG Xichuan YUAN Qing′an et al.
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Stomatology, West China University of Medical Sciences, Chengdu, 610041, China)
【Abstract】Objective Binding specificity of a monoclonal antibody (MAb) (γ.k 2b) E11 which can react with the peptide of human VEGF was determined by ELISA and immunohistochemistry. The E11 primarily proved to be potential activity of suppressing tumor growth in vivo. The construction and expression of engineering antibody (ScFv) could widen application of this MAb in both diagnosis and treatment of human cancer. Methods From the hybridoma cell line secreting MAb against VEGF, total RNA was prepared and used as a template for cDNA synthesis and cloning. Reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to clone the immunoglobulin variable region gene (VH, VL). The cloned VH and VL were linked by well documented flexible peptide bridging sequence (GGGGS)3 in the VH-linker-VL orientation. The constructed ScFv gene was inserted into pET-15b and expressed in E.coli BL21(DE3). Biding activity of ScFv was evaluated by ELISA and immunohistochemical methods after its denature and renature treatment.Results The sequence analysis revealed that the full length of VH was 369 bp, and VL was 333 bp. According to Kabat classification, VH and VL are the member of mouse Ig variable gene heavy chain subgroup Ⅱ(A) and light chain subgroup Ⅲ, respectively. The ScFv was highly expressed in the form of inclusion bodies which activity was recovered after being renatured. Immunohistochemical results showed that ScFv retained almost the same antigen affinity and specificity as its parent monoclonal antibody.Conclusions Recombinant antibody ScFv is potential in both diagnostic and therapeutic application of human malignant tumors.
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【Key words】Endothelial growth factor； Gene expression
血管内皮生长因子(VEGF)被认为是体内蛋白诱导血管再生最关键的调节因子[1]。常见的恶性实体肿瘤均有VEGF的过量表达[2]。已有研究表明，抑制VEGF的活性能显著抑制肿瘤的生长[3]。1993年Kim首次报道抗VEGF单克隆抗体(单抗)抑制荷瘤鼠的肿瘤生长[4]，随后又发现其抑制转移瘤的发生[5]。但由于鼠源单抗在人体内易诱发人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应，使其临床应用严重受限。基因工程技术对抗体的改造(即抗体基因重组)可降低其免疫源性，抗体工程也因此成为国内外研究热点。单链抗体(ScFv)以其分子量小，穿透力强，免疫源性低，易于大量生产等优点，得到了较为广泛的应用。作者此前的报道已述及抗人VEGF单克隆抗体杂交瘤细胞株，其单克隆抗体已用于临床检测VEGF表达，取得了满意效果[6]。并初步证实该单克隆抗体具有体内抑瘤活性。本研究旨在克隆抗体可变区基因，构建ScFv，为有效的过渡到临床应用打下基础。本文报道ScFv的构建及其表达结果。
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表1 PCR扩增的引物序列 引物
引物序列
内切酶
P1
5，GGGAATTCATG(AG)AG(AT)C(CT)CAGGTCTTTT-3,P2
5,-CCCAAGCTTTTACTGGGGATGGTGGGGAAGATGGA-3,P3
5,-GGGGAATTCATGGAGGTG(GA)AGCT(GT)GGAAGTC-3,P4
JH1:5,-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3,JH2:5,-TGAGGAGACTGTGAGTGGTGCC-3,JH3:5,-TGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3,JH4:5,TGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-3,P5
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5,GGAATTCCATATGGCCATGGAATTCATGGAGGTGCAGGTT-3.
NdeI,NcoI,EcoRI
P6
5,-CGGGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCACCTGAACCGCCTCCAC
CTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3,BamHI
P7
5,CGGGATCCGACATTGTGCTGACACAGTTTCCT-3,BamHI
P8
5,-CCGCTCGAGTCAGTCGACTTAGCGGCCGCTTTGAT-3,XhoI ,SacI,NotI
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材料与方法
1.E11可变区基因(VH，HL)的克隆及序列测定：从生长良好，能持续分泌抗VEGF单抗的杂交瘤细胞株(E11)中[7]，按文献[8]提取细胞总RNA。参照Kabat库，设计2条引物用于VL的扩增(5′端互补于引导序列，3′端引物互补于轻链恒定区)，5条用于VH扩增(针对重链FR1区1条，JH区4条)，序列见表1。以RNA为模板，在AMV逆转录酶催化下合成cDNA。以cDNA为模板，在30 ml反应体系中，分别以加入轻链可变区引物，在基因Amp PCR体系上进行扩增，参数设为：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循环。PCR产物用1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。将回收的PCR产物纯化(QIAGEN, gel extraction kit)后，克隆在末端T突出的pEGMR-T Vector中，转化感受态细菌MC1601，挑选阳性克隆，抽提质粒DNA，T7及SP6通用引物双向测序。
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3.单链抗体基因的表达：将ScFv及载体pET-15S分别用同一对酶(NcoⅠ, NotⅠ)进行酶切，连接后转化DH5α，菌液PCR挑选阳性克隆，抽提质粒行酶切分析。将经筛选的质粒命名为pET15-YV，将pET15-YV转化BL21(DE3)。挑选阳性克隆。表达菌株的诱导培养、SDS-PAGE、超声破菌、分别取上清及沉淀，确定表达产物的形式。
4.单链抗体包涵体的变性与复性：(1)用1 ml变性液(0.1 mol/L Tris. HCl, pH8.0; 6 mol/L盐酸胍；2 mmol/L EDTA；0.5% β-羟基乙醇)溶解包涵体，室温放置2 h；30 000 r/min离心15 min，取上清，测定样品的蛋白含量。用复性液将其浓度调整为10 mg/ml。(2)取上述上清1 ml，快速加入到100 ml的复性液(0.1 mol/L Tris. HCl, pH8.0; 0.5 mol/L L-精氨酸；50 μmol/L CuSO4；2 mmol/L EDTA)10℃至少保温24 h，以使抗人VEGF ScFv达到充分复位的目的。
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5.单链抗体的序列测定：将获正确表达带的菌种，抽提质粒pET15-YV，将其中的ScFv序列用一对酶切(EcoRI, XhoI)下，PUC19用EcoRI及SalI酶切，因XhoI与SalI酶切的粘性末端互补，因此，即可将ScFv克隆入PUC19中，进行全自动双向测序。
6.单链抗体的活性鉴定：单链抗体的免疫组化：颊癌组织标本由本院病理科提供，分化程度较好(高、中分化)16例，分化程度差(低分化)4例，共20例。染色后约5 μm的石蜡切片，脱蜡后先经0.3%H2O2甲醇溶液浸泡30 min，然后滴加正常羊血清，37℃下10 min，一抗先后为ScFv复性原液及鼠抗E标记抗体，二抗为兔抗鼠-HRP，室温反应1 h后洗涤，以含有DAB及H2O2的底物液显色，显微镜下棕色着染为阳性，深棕色为强阳性。并以商品化的抗人VEGF单抗为实验对照。
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1.E11可变区基因(VH，HL)的克隆及序列测定：
经RT-PCR，VL及VH均得已扩增，扩增VH的3′端引物为JH4，琼脂糖凝胶电泳显示两者的区带位分别在430 bp及370 bp左右，与预计大小相符。序列测定结果，VL基因全长333 bp，编码111个氨基酸，归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。VH基因全长369 bp，编码123个氨基酸，归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组(图1)。
注：A：VH；B：Marker，由下至上依次为657，(458，434)，328，289，267 bp；C：VL
图1 VH，HL PCR扩增产物
凝胶电泳
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图2 重组质粒pET-15YV
酶切鉴定
2.单链抗体基因的构建：根据轻、重链可变区基因序列设计引物P5-P8，分别对VL及VH进行扩增，其中重链可变区和连接肽(Linker)(GGGGS)3基因相连。因VH的3′端及VL的5′端均引入了BamHI位点，经T4连接酶连接，用P5，P8行PCR扩增，即得到完整的ScFv全基因序列。电泳结果为760 bp的条带。将ScFv基因克隆入表达载体pET-15S中，转化之后挑选阳性克隆，抽提质粒酶切鉴定(图2)。结果表明，VH-linker-VL已连接并定向克隆在pET-15S中，命名为pET-15YV。
3.单链抗体基因的序列测定：DNA自动测序证明，获得表达的pET-15YV中ScFv基因序列阅读框架正确。
4.单链抗体基因的表达：BL21(DE3)感受态经含单链抗体基因的pET-15YV转化，在0.2 mmol/L IPTG终浓度的诱导下，主要以包含体的形式获得大
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注：A：低分子量蛋白标准；B：PET-15YV全菌；C：PET-15YV上清；D：PET-15YV包涵体
图3 PET-15YV的表达
及纯化
量表达。包含体占总蛋白的40%。SDS-PAGE显示在接近相对分子质量30 000处有一强表达带(图3)。
5.单链抗体的活性鉴定：ScFv对颊癌组织的特异性反应与原亲本抗体相同。除4例高分化标本未见阳性反应外，余16例均为阳性反应，其中4例低分化标本呈强阳性(图4)。本结果与商品化抗人VEGF单抗在紧邻病理切片上的反应结果一致。
讨论
克隆VL基因的引物多为针对骨架区FR1及FR4的通用引物，但通用引物获得的可变区基因两端若干碱基可能与原始序列有差异，因而两端的氨基酸可能有变异。可变区氨基端，尤其是轻链氨基端的氨基酸与CDR(Complementary determining regions)表面很接近，可能对抗原抗体的结合产生影响。因此，为了获得VL两端正确的序列，本研究采用针对信号肽及恒定区的引物，这样就避免了VL的变异，保证了VL序列的正确性。Linker的设计对功能区构型的维持起着重要的作用，一般认为Linker的长度以14～25个残基为宜。最常用的Linker序列(GGGGS)3是据X线晶体衍射分析抗体结构可变区及计算机辅助分析结果设计的具柔性结构的15肽序列(GLY4-Ser)3，Linker中尽量避免使用疏水残基，因其可能形成疏水表面，包埋在抗体分子中，从而改变抗体分子的三维结构。
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图4 低分化颊癌组织VEGF免疫组化染色
箭头为癌巢(深棕色) ×200
血管内皮生长因子选择性作用于血管内皮细胞膜上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体KDR/flk-1和flt-1，使酪氨酸激酶受体自身磷酸化，激发细胞内信号传导通路，产生生物效应-主要包括血管通透性增加，内皮细胞表达整合素及蛋白酶激活因子，最终导致血浆蛋白外渗，基底膜溶解，成纤维细胞及内皮细胞游走，新生血管形成。迄今为止，对抗VEGF的策略可归为6种：(1)抗体直接阻断VEGF活性；(2)阻断VEGF受体；(3)用可溶性VEGF受体片断中和VEGF；(4)将VEGF与毒素融合；(5)VEGF反义核酸；(6)其他间接阻断方法。以上各途径均取得较好效果，有的项目已获通过进入临床试验。
本研究结果不仅显示了抗人VEGF ScFv抗肿瘤治疗的潜能，若标记同位素，还可用于肿瘤区放射免疫显象，检查原发及转移病灶(ScFv分子小，未结合的抗体易被清除，显影时本底低，图像清晰)。此外，将ScFv与毒素等构建融合蛋白，或标记放射性核素，或与化疗药物结合，即可作为导向药物。这种既是血管生成抑制剂，又是魔弹的“双功能”药物，很可能是治疗恶性肿瘤有效的新途径。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570768)
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收稿日期：1999-07-19, http://www.100md.com